Name: Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor RNA-isolatie uit Pseudomonas aeruginosa geïsoleerd uit het caecum van muizen. Deze techniek levert hoogwaardig RNA geschikt voor qPCR, transcriptieprofilering en RNA-sequencing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. Muizenmodel van P. aeruginosa GI kolonisatie en verspreiding <ol><li> C3H/HeN muizen (6-8 wkn oud, vrouw, Harlan) worden behandeld met orale antibiotica om commensale flora afbreken en daarna mono-gekoloniseerd met PA zoals eerder beschreven 4. </li></ol> 2. Oogsten Murine cecal Luminal Inhoud <ol><li> Dompel een schoon roestvrij stalen vijzel in een vloeibare stikstof bad. </li><li> Euthanaseren muizen door kooldioxide stikken. </li><li> Veilig muis karkas op een piepschuim bord en een douche met 95% ethanol. Maak een middellijn longitudinale incisie door de huid van het borstbeen tot het perineum. Weerspiegeling van de huid en het buikvlies naar de buikholte bloot te leggen. </li><li> Reseceren de hele blindedarm. Houd de blindedarm met een tang boven de RVS mortel. Snip beide uiteinden van de blindedarm met dissectie schaar. </li><li> Plaats een P1000 pipettip gevuld met 1 ml van cecal flushate buffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA en 200 mM NaCl) 5 in het proximale uiteinde van de blindedarm. Spoel de cecal flushate buffer en cecal luminale inhoud in de roestvrij stalen mortel. 1 ml van cecal flushate buffer voldoende zal zijn voor alle spoelen van de blindedarmkeutels inhoud. Cecal flushate inhoud zal onmiddellijk te bevriezen bij in contact komen met de mortel. </li><li> Maal de blindedarmkeutels flushate inhoud met een steriel stamper. </li><li> Plaats de grond bevroren cecal luminale inhoud in een 50 ml polypropyleen conische buis ondergedompeld in een droog ijs / ethanol bad. </li><li> Herhaal stap 2.2 tot en met 2.7 voor elke extra muis. </li><li> Bewaren bij -80 ° C. </li></ol> 3. Bacterieel RNA isolatie <ol><li> Warm een ​​volume (gebaseerd op de uiteindelijke volume van de twee cecal luminale inhoud, ongeveer 3 ml) van zuur fenol / chloroform (5:1, v / v) die in een 50 ml Oak Ridge centrifugebuis met de kap vastgezet in parafilm in een 65 ° C waterbad. </li><li> Kook 0,5 volume van lysis buffer (2% SDS, 16 mM EDTA en 200 mM NaCl) 6 in een 50 ml polypropyleen conische buis gedurende 5 minuten. </li><li> Kokend lysis buffer om cecal luminale inhoud. Homogeniseren. Kook gedurende 5 minuten met periodieke vortexen. </li><li> Voeg de 100 ° C cecal inhoud / lysis monster tot de 65 ° C zuur fenol / chloroform in het Oak Ridge centrifugebuis. Seal cap met parafilm. </li><li> Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten met periodieke vortexen (elke 2 minuten). </li><li> Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten. </li><li> Zorgvuldig overdracht waterige fase (het vermijden van een van de witte interface) om een ​​frisse 50 ml Oak Ridge centrifuge. Het volume van de waterfase zal ongeveer 50% van het totale volume van cecal inhoud, lysis buffer, en zuur fenol / chloroform worden. Voeg een gelijk volume zuur fenol / chloroform. </li><li> Seal cap met parafilm en meng goed door vortexen bij hoge snelheid. </li><li> Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten. </li><li> Herhaal de stappen 3,7 tot 3,9 totdat er geen zichtbare witte interface tussen de waterige en organische fasen. </li><li> Zorgvuldig overdragen waterige fase naar een verse 50 ml Oak Ridge centrifuge. Voeg een gelijk volume van chloroform / isoamylalcohol (24:1, v / v). </li><li> Seal cap en meng goed door vortexen. </li><li> Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° gedurende 15 minuten. Verwijder de waterige fase (volume zal ongeveer 50% van de totale reactie volume) tot 15 ml polypropyleen conische buis en voeg een gelijk volume isopropanol. </li><li> Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur of 's nachts. </li><li> Centrifugeer monster op 2,500 g bij 4 ° C gedurende 45 minuten. Een gel-achtige pellet vormen op de bodem van de buis. Verwijder supernatant. </li><li> Was de pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol. Vortex. Centrifugeer monster op bij 10.000 g bij 4 ° gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en omkeren van de buis om de pellet laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeer de RNA pellet in 200 ui van RNase-vrij water. </li></ol> 4. DNase behandeling (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems) <ol><li> Voeg 20 ul van 10X Turbo DNase buffer en 2 pl Turbo DNase en meng voorzichtig. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 20 ul van de geresuspendeerde DNase inactivatie reagens en meng goed. </li><li> Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur, mixen af ​​en toe. </li><li> Centrifugeer bij 10.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1,5 minuten en breng het supernatant naar een nieuwe microfugebuis. </li><li> Voeg een volume van koud (4 °) zuur fenol / chloroform en meng door vortexen gedurende 1 minuut. </li><li> Centrifugeer bij 12.500 g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg een volume van chloroform / isoamylalcohol (49:1 v / v), vortex. </li><li> Centrifugeer bij 12.500 g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Breng de waterige fase (ongeveer 50% van de totale reactie volume) naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 0,1 volume 3M natriumacetaat, pH 5,5 en2,5 volumes van ijskoude 100% ethanol. Vortex. </li><li> Incubeer bij -20 ° C gedurende minstens 2 uur of bij -80 ° gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 30 minuten bij 4 ° </li><li> Verwijder supernatant. </li><li> Was de pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 10.000 g bij 4 °. </li><li> Verwijder het supernatant en drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 ui van RNase-vrij water. Kan nodig zijn om in 65 ° waterbad om opnieuw in suspensie en de pellet te ontbinden. </li><li> Voor het testen van de effectiviteit van de DNase behandeling, kan een standaard RT-PCR-reactie voor de amplificatie van een ribosomale eiwit (of een andere referentie-gen) worden uitgevoerd voor behandeld en niet-behandelde monsters, met behulp van geen RT controles. </li></ol> 5. RNA Cleanup Step (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Raadpleeg de pagina's 56-57 van Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 e editie, april 2006). Volgen zoals aangegeven. </li></ol> 6. Representatieve resultaten De hoeveelheid van bacteriële totaal RNA teruggevorderd door het gebruik van dit protocol is ongeveer 2-3 microgram van twee cecums. Teruggevorderde RNA is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor de daaropvolgende qPCR, transcriptie profilering, en RNA-Seq experimenten. RNA zuiverheid wordt regelmatig getoetst door het meten van de verhouding tussen 260nm/280nm 7 van het monster, maar deze methode geeft geen informatie over RNA integriteit. De Agilent Bioanalyzer is een microfluidics-gebaseerd platform voor de dimensionering, de kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA, RNA, eiwitten en cellen, en maakt gebruik van een RNA integriteit metrische bekend als RNA Integrity Number (RIN) 8. RNA geëxtraheerd met dit protocol levert 260/280 ratio's variërend 1,7 tot 2,0 en RIN-waarden ≥ 7,0. Een voorbeeld van een Agilent Bioanalyzer analyse van de bacteriële RNA teruggevorderd door dit protocol is weergegeven in figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram en gel-achtig beeld van Pseudomonas aeruginosa totaal RNA monster geïsoleerd en hersteld van muizen cecal inhoud. RIN 8,0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De RNA-extractie hier beschreven methode maakt het mogelijk herstel van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit Pseudomonas aeruginosa totaal RNA geoogst uit de muizen maag-darmkanaal. Deze methode is niet beperkt tot P. aeruginosa en kan eventueel worden toegepast op andere bacteriën. Het herstel van voldoende micro-organismen uit de darm zal aanzienlijk verschillen van organisme tot organisme. In ons muismodel, P. aeruginosa koloniseert meestal de muizen maagdarmkanaal op een niveau tussen 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve / g feces 4. Sinds de herstelde cecal inhoud zijn ongeveer 0,5 gram, het geschatte aantal van P. aeruginosa hersteld van twee cecums is tussen de 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve. Als er andere micro-organismen worden gebruikt, zou het verstandig zijn om GI kolonisatie niveaus te controleren en vervolgens het aantal cecums nodig is om het beoogde aantal kve terug te berekenen. Het is ook belangrijk op te merken dat bij het gebruik van dit muismodel, antibiotica-behandelde muizen niet besmet met PA geen meetbare hoeveelheden RNA geïsoleerd van hun cecal inhoud hebben. Onze muizenmodel van Pseudomonas aeruginosa gastro-intestinale kolonisatie en verspreiding pogingen om de pathogenese van P. emuleren aeruginosa bacteriëmie bij kanker en stamcel transplantatie patiënten. In deze patiëntengroep, is commensale flora vaak uitgeput secundair aan antibiotica of chemotherapeutische behandeling (bijvoorbeeld het antibioticum uitputting van de GI commensale flora), resulterend in overgroei van pathogene micro-organismen (bijvoorbeeld mono-associatie met P. aeruginosa) en de daaropvolgende verspreiding na het immuunsysteem onderdrukken. De voordelen en beperkingen van dit muismodel zijn al eerder vier aangepakt. Het doel van deze huidige studie is een methode te bieden voor het isoleren van microbiële totaal RNA uit het spijsverteringskanaal. Dit protocol kan eenvoudig aangepast worden aan andere muismodellen dat andere aspecten van microbiële pathogenese in het maagdarmkanaal (dat wil zeggen commensale flora interacties, bacteriële effecten op inflammatoire darmziekte, etc.) te bestuderen. Een voordeel van deze methode is het opnemen van meerdere lysis stappen waaronder vries / dooi, mechanische verstoring (verpulveren met mortel / stamper, homogeniseren), koken, en chemische lysis (bijv. SDS). Ondanks de veelheid aan lysis stappen, kunnen sommige micro-organismen (met name Gram-positieve bacteriën en schimmels / gisten) extra mechanische storing. Na de hete lysis / zuur fenol-chloroform incubatie (Stap 3.5), de toevoeging van parels (0,1 mm voor bacteriën en / of 0.5-0.7 mm voor gist) en een volgende kraal-beating stap moet voldoende zijn om deze organismen 9 lyseren, 10. Gezien de complexe aard van de materialen hersteld van de muizen blindedarm, de herhaalde koude acid-phenol/chloroform extracties (Stap 3,7 tot 3,9), zijn absoluut nodig om acceptabele RNA kwaliteit en integriteit voor verder stroomafwaarts reacties te bereiken. Tussen 3-5 koude acid-phenol/chloroform extracties kan nodig zijn voordat de witte interface tussen de waterige en organische fasen wordt geëlimineerd. Ten slotte is de combinatie van zowel de DNase behandeling (stap 4) en RNeasy Cleanup Protocol (stap 5) zijn essentieel voor het verwijderen van vervuilende DNA en kleine, niet-mRNA (5s en tRNA). Zoals eerder vermeld, de RNA-teruggewonnen door gebruik te maken van dit protocol is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor latere transcriptie profilering 3, qPCR (niet gepubliceerd), en RNA Seq (niet gepubliceerd) experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Vijzel en stamper </td><td> Visser </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogenisator </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge centrifugebuis (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Zuur Fenol / Chloroform </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamylalcohol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M Natrium Acetaat </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

isolatie van rna pseudomonas aeruginosa kolonisatie van de muizen maagdarmkanaal

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infecties leiden tot aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij gastheren met een verminderde immuunsysteem, zoals patiënten met leukemie, ernstige brandwonden, of orgaantransplantaties 1. Bij patiënten met een hoog risico voor het ontwikkelen van PA infecties in het bloed, de gastro-intestinale (GI) stelsel is het belangrijkste reservoir voor kolonisatie 2, maar de mechanismen waarmee PA overgangen van een asymptomatische kolonisatie microbe tot een invasieve, en vaak dodelijk, pathogeen zijn onduidelijk. Eerder hebben we in vivo transcriptie profilering experimenten door herstellende PA mRNA van bacteriële cellen die woonachtig zijn in de cecums van gekoloniseerde muizen 3 om veranderingen in de bacteriële genexpressie identificeren bij wijzigingen in het immuunsysteem van de gastheer status. Zoals bij elke transcriptie profilering experiment, de snelheidsbeperkende stap is in de isolatie van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit mRNA. Gezien de overvloed van enzymen, vuil, etensresten, en fijn stof in het spijsverteringskanaal, de uitdaging van RNA-isolatie is een hele uitdaging. Hier presenteren we een methode voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie van bacteriële RNA hersteld van de muizen maag-darmkanaal. Deze methode maakt gebruik van een gerenommeerde muizenmodel van PA GI kolonisatie en neutropenie-geïnduceerde verspreiding van 4. Eenmaal GI kolonisatie met PA is bevestigd, muizen zijn gedood en cecal inhoud wordt hersteld en flash bevroren. RNA is vervolgens geëxtraheerd met behulp van een combinatie van mechanische verstoring, koken, fenol / chloroform extractie, DNase behandeling en affiniteitschromatografie. De hoeveelheid en zuiverheid worden bevestigd door middel van spectrofotometrie (Nanodrop Technologies) en bioanalyzer (Agilent Technologies) (afb. 1). Deze methode van gastro-intestinale microbiële RNA isolatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere bacteriën en schimmels ook.

Een betrouwbare methode voor het RNA isolatie van<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Hersteld van muizen cecums wordt beschreven. Teruggevorderde RNA is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor de daaropvolgende qPCR, transcriptie profilering, en RNA-Seq experimenten. Deze techniek kan worden aangepast voor RNA-isolatie van andere intestinale micro-organismen.

Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal

*Pseudomonas aeruginosa* (PA)-infecties leiden tot aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij gastheren met een gecompromitteerd immuunsysteem, zoals patiënten met ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van het totale RNA van Pseudomonas aerogen dat is teruggewonnen uit muizen-ECM's. Dit wordt bereikt door eerst de lumeninhoud van het sequentieel te oogsten. Vervolgens wordt het bacteriële RNA geïsoleerd.Vervolgens worden de D'S-behandeling en de RNA-reiniging uitgevoerd. Ten slotte wordt het RNA gekwantificeerd en wordt de zuiverheid van het isolaat gecontroleerd via bioanalyzer- en spectrofotometrische analyse. Uiteindelijk kan bacterieel RNA van voldoende kwaliteit en kwantiteit worden verkregen voor daaropvolgende experimentele evaluaties, zoals via QPCR-analyse, transcriptieprofilering of RNA-sequencingexperimenten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals triol-extractie, is dat deze methode meerdere lysestappen in extreem rigoureus zuur combineert met chloroform-extractiestappen om RNA van hoge kwaliteit te garanderen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de lyse- en extractiestappen moeilijk aan te leren zijn omdat geschreven protocollen kleine details weglaten die cruciaal zijn voor het succes. De procedure zal worden gedemonstreerd door Eduardo Lopez Medina, een postdoctoral fellow, en Megan Neubauer, de labmanager, beiden uit mijn laboratorium. Voordat de oogst begint, reinigt IMSA de roestvrijstalen vijzel in een bad van vloeibare stikstof.Euthanaseer vervolgens een zes tot acht weken oude C3 HHEN-muis die is gekoloniseerd met Pseudomonas aerogen, plaats het dier in rugligging op een piepschuimplaat en besprenkel het abdomen met 95% ethanol. Maak daarna een longitudinale middenincisie door de huid van het sternum tot het perineum. Trek vervolgens de huid en het peritoneum terug en leg de buikholte bloot.Resect nu het volledige caecum met een pincet. Houd het caecum boven de vijzel van roestvrij staal en knip vervolgens beide uiteinden van het caecum door met dissectiescharen. Vul een P 1000 pipetpunt met één milliliter sequel flush eight-buffer en steek de punt vervolgens in het proximale uiteinde van het caecum.Spoel de inhoud van de sequel flush eight buffer en de sequel lumeninhoud in de roestvrijstalen vijzel. Maal vervolgens de inhoud van de sequel flush eight fijn met een steriele stamper.Giet vervolgens ethanol in een container met droge ijs en plaats een conische polypropylene buis van 50 milliliter in het bad van droge ijs en ethanol. Breng de gemalen bevroren inhoud van de sequel luminal over in de conische buis en bewaar de buis bij minus 80 °C. De volgende reeks stappen zijn de meest kritieke van de procedure.Gezien de complexe aard van materialen die uit het caecum van de MI worden verkregen, zijn herhaalde koude filoform-extracties absoluut noodzakelijk om een acceptabele homogeniteit en integriteit te bereiken; er kunnen drie tot vijf extracties nodig zijn voordat de brede interface tussen de waterige en organische fasen is geëlimineerd. Breng één volume zuur fenolchloroform over in een centrifugebuis van 50 milliliter van Oak Ridge. Sluit de dop stevig en warm de buis vervolgens op in een waterbad van 65 °C.Voeg een half volume lysisbuffer toe aan een conische polypropylene buis van 50 milliliter en kook de buffer vervolgens vijf minuten. Haal de sequel luminale inhoud uit de opslag bij -80 °C, warm de buis kort op door deze stevig tussen de handen te wrijven en voeg vervolgens de kokende lysisbuffer toe aan de buis. Schud het mengsel om de SQL luminale inhoud-oplossing van de lysisbuffer te homogeniseren.Kook de lysisbuffer en de inhoud van de SQL-luminale fractie gedurende vijf minuten. Ontdooi, met periodiek vortexen, de Oak Ridge-centrifugebuis met de fenol-chloroformoplossing en breng het lysaat van de SQL-inhoud over in de buis. Sluit vervolgens de dop opnieuw af met Parafilm en plaats de buis gedurende 10 minuten terug in het waterbad van 65 °C, waarbij de buis elke twee minuten wordt geschud.Was het monster 15 minuten bij 2.500 ×g bij vier graden Celsius. Draag nu voorzichtig de waterige fase over naar een nieuwe centrifugebuis van 50 ml van Oak Ridge, waarbij de witte interface wordt vermeden. Voeg vervolgens een gelijk volume zuur fenol-chloroform toe aan de nieuwe buis.Sluitt de dop af met Parafilm en meng de inhoud goed door de buis op hoge snelheid te vortexen. Centrifugeer het monster verder en breng de waterige fase over naar een centrifugebuis. Als het volume van de bovenste waterige fase te klein wordt, kan deze worden overgebracht naar een buis met een kleinere diameter.Zet dit proces voort totdat er geen zichtbare witte interface meer aanwezig is tussen de waterige en organische fasen. Wanneer de witte interface is verdwenen, wordt de waterige fase voorzichtig overgebracht naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg vervolgens een gelijk volume chloroform-isoamylalcohol toe aan de buis, sluit de dop en meng de inhoud goed door middel van vortexen.Centrifuge vervolgens het monster opnieuw en breng de waterige fase over naar een conische polypropyleen buis van 15 milliliter en voeg een gelijk volume isopropanol toe. Incubeer de oplossing vervolgens bij -20 °C gedurende ten minste twee uur of overnacht. Centrifugeer de buis na incubatie van het monster 45 minuten.Nadat het gelachtige pellet onderin de buis is geïdentificeerd, wordt het supernatant verwijderd. Was het pellet vervolgens met één milliliter ijskoud, 70%ethanol door de buis te vortexen, en centrifugeer de sample daarna bij 10 000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C. Verwijder tot slot het supernatant en keer de buis om om het pellet 10 minuten aan de lucht te laten drogen bij kamertemperatuur.Resuspendeer vervolgens het RNA-pellet in 200 µL RNase-vrij water. Voeg eerst 20 µL 10x Turbo DNA-buffer en twee µL Turbo DNAse toe aan de microcentrifugebuis en meng de oplossing voorzichtig. Incubeer de buis vervolgens 20 minuten bij 37 °C, voeg daarna 20 µL geresuspendeerd DNAse-inactiveringsreagens toe aan de buis en meng dit goed.Incubeer de buis nu nog vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen. Centrifugeer vervolgens het pellet in een microcentrifuge bij 10.000 ×g gedurende 1,5 minuut en breng daarna het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg één volume koud zuur fenol-chloroform toe aan het pellet en meng de oplossing vervolgens grondig door één minuut te vortexen.Na het centrifugeren van de oplossing gedurende twee minuten bij 12 500 ×g, brengt u de waterige fase over naar een nieuwe buis en voegt u één volume chloroform-isoamylalcohol toe. Meng vervolgens de oplossing door te vortexen en centrifugeer de oplossing opnieuw onder dezelfde condities. Breng de waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Voeg vervolgens 0,1 volume drie molar natriumacetaat en 2,5 volumes ijskoude, 100% ethanol toe. Vortex de buis om te mengen. Incubeer het monster bij minus 80 °C gedurende 30 minuten.Centrifuge vervolgens 30 minuten bij 12, 000 ×g bij vier °C en verwijder de supernatant. Was daarna de pellet met 1 mL ijskoud 70% ethanol. Verwijder de supernatant en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen.Resuspendeer vervolgens het pellet in 100 µL RNase-vrij water. De Agilent Bioanalyzer is een op microfluïdica gebaseerd platform voor het bepalen van de grootte, kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA, RNA, eiwitten en cellen, en maakt gebruik van een maatstaf voor RNA-integriteit die bekend staat als het RNA integrity number of RIN. RNA dat met dit protocol is geëxtraheerd, levert 260/280-ratio's op variërend van 1,7 tot 2,0 en RIN-waarden groter dan of gelijk aan 7,0.Een voorbeeld van een Agilent bioanalyzer electroferogram van het bacteriële RNA wordt hier links getoond, en een gel-achtig beeld van pseudomonas arosa teruggewonnen uit murine SQL-inhouden wordt hier rechts getoond. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve PCR of RNA-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals verfijnde genexpressieprofilering.

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Morrill, S. R., et al. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a protocol for modeling vaginal colonization in mice using antibiotic-resistant anaerobic bacteria. It begins with hormonal treatment to increase epithelial susceptibility, followed by vaginal inoculation and co-inoculation under anaerobic conditions. The procedure concludes with post-inoculation sampling and culture to evaluate bacterial colonization...

Modeling Murine Vaginal Colonization by Anaerobic Bacteria

Source: Taylor, M. N., et.al. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the exposure of germ-free, age-matched Caenorhabditis elegans worms to a bacterial strain for intestinal colonization. It explains the selective removal of non-adhered and external bacteria, leaving only viable bacteria adhered to the gut epithelium for quantification.

Evaluating Intestinal Bacterial Colonization in Germ-Free C. elegans

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Geautomatiseerde Scheiding van<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Non-Invasive Model van Neuropathogenic Escherichia coli Infectie in de Neonatale Rat

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om één, besmet-blaas epitheliale cellen van een lymfkliertest model van urineweginfectie te isoleren.

Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Dit protocol beschrijft de noodzakelijke stappen voor kolonisatie van muizen met pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden, evenals niet-invasieve methoden voor validatie van kolonisatie en beoordeling van de pks+ E. coli-expansie in ontlasting.

Kolonisatie met Murine pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden

Leer een betrouwbare methode voor RNA-isolatie uit Pseudomonas aeruginosa geïsoleerd uit het caecum van muizen. Deze techniek levert hoogwaardig RNA geschikt voor qPCR, transcriptieprofilering en RNA-sequencing.

Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal

Meer video's verkennen