Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van het totale RNA van Pseudomonas aerogen dat is teruggewonnen uit muizen-ECM's. Dit wordt bereikt door eerst de lumeninhoud van het sequentieel te oogsten. Vervolgens wordt het bacteriële RNA geïsoleerd.

Vervolgens worden de D'S-behandeling en de RNA-reiniging uitgevoerd. Ten slotte wordt het RNA gekwantificeerd en wordt de zuiverheid van het isolaat gecontroleerd via bioanalyzer- en spectrofotometrische analyse. Uiteindelijk kan bacterieel RNA van voldoende kwaliteit en kwantiteit worden verkregen voor daaropvolgende experimentele evaluaties, zoals via QPCR-analyse, transcriptieprofilering of RNA-sequencingexperimenten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals triol-extractie, is dat deze methode meerdere lysestappen in extreem rigoureus zuur combineert met chloroform-extractiestappen om RNA van hoge kwaliteit te garanderen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de lyse- en extractiestappen moeilijk aan te leren zijn omdat geschreven protocollen kleine details weglaten die cruciaal zijn voor het succes. De procedure zal worden gedemonstreerd door Eduardo Lopez Medina, een postdoctoral fellow, en Megan Neubauer, de labmanager, beiden uit mijn laboratorium. Voordat de oogst begint, reinigt IMSA de roestvrijstalen vijzel in een bad van vloeibare stikstof.

Euthanaseer vervolgens een zes tot acht weken oude C3 HHEN-muis die is gekoloniseerd met Pseudomonas aerogen, plaats het dier in rugligging op een piepschuimplaat en besprenkel het abdomen met 95% ethanol. Maak daarna een longitudinale middenincisie door de huid van het sternum tot het perineum. Trek vervolgens de huid en het peritoneum terug en leg de buikholte bloot.

Resect nu het volledige caecum met een pincet. Houd het caecum boven de vijzel van roestvrij staal en knip vervolgens beide uiteinden van het caecum door met dissectiescharen. Vul een P 1000 pipetpunt met één milliliter sequel flush eight-buffer en steek de punt vervolgens in het proximale uiteinde van het caecum.

Spoel de inhoud van de sequel flush eight buffer en de sequel lumeninhoud in de roestvrijstalen vijzel. Maal vervolgens de inhoud van de sequel flush eight fijn met een steriele stamper.

Giet vervolgens ethanol in een container met droge ijs en plaats een conische polypropylene buis van 50 milliliter in het bad van droge ijs en ethanol. Breng de gemalen bevroren inhoud van de sequel luminal over in de conische buis en bewaar de buis bij minus 80 °C. De volgende reeks stappen zijn de meest kritieke van de procedure.

Gezien de complexe aard van materialen die uit het caecum van de MI worden verkregen, zijn herhaalde koude filoform-extracties absoluut noodzakelijk om een acceptabele homogeniteit en integriteit te bereiken; er kunnen drie tot vijf extracties nodig zijn voordat de brede interface tussen de waterige en organische fasen is geëlimineerd. Breng één volume zuur fenolchloroform over in een centrifugebuis van 50 milliliter van Oak Ridge. Sluit de dop stevig en warm de buis vervolgens op in een waterbad van 65 °C.

Voeg een half volume lysisbuffer toe aan een conische polypropylene buis van 50 milliliter en kook de buffer vervolgens vijf minuten. Haal de sequel luminale inhoud uit de opslag bij -80 °C, warm de buis kort op door deze stevig tussen de handen te wrijven en voeg vervolgens de kokende lysisbuffer toe aan de buis. Schud het mengsel om de SQL luminale inhoud-oplossing van de lysisbuffer te homogeniseren.

Kook de lysisbuffer en de inhoud van de SQL-luminale fractie gedurende vijf minuten. Ontdooi, met periodiek vortexen, de Oak Ridge-centrifugebuis met de fenol-chloroformoplossing en breng het lysaat van de SQL-inhoud over in de buis. Sluit vervolgens de dop opnieuw af met Parafilm en plaats de buis gedurende 10 minuten terug in het waterbad van 65 °C, waarbij de buis elke twee minuten wordt geschud.

Was het monster 15 minuten bij 2.500 ×g bij vier graden Celsius. Draag nu voorzichtig de waterige fase over naar een nieuwe centrifugebuis van 50 ml van Oak Ridge, waarbij de witte interface wordt vermeden. Voeg vervolgens een gelijk volume zuur fenol-chloroform toe aan de nieuwe buis.

Sluitt de dop af met Parafilm en meng de inhoud goed door de buis op hoge snelheid te vortexen. Centrifugeer het monster verder en breng de waterige fase over naar een centrifugebuis. Als het volume van de bovenste waterige fase te klein wordt, kan deze worden overgebracht naar een buis met een kleinere diameter.

Zet dit proces voort totdat er geen zichtbare witte interface meer aanwezig is tussen de waterige en organische fasen. Wanneer de witte interface is verdwenen, wordt de waterige fase voorzichtig overgebracht naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg vervolgens een gelijk volume chloroform-isoamylalcohol toe aan de buis, sluit de dop en meng de inhoud goed door middel van vortexen.

Centrifuge vervolgens het monster opnieuw en breng de waterige fase over naar een conische polypropyleen buis van 15 milliliter en voeg een gelijk volume isopropanol toe. Incubeer de oplossing vervolgens bij -20 °C gedurende ten minste twee uur of overnacht. Centrifugeer de buis na incubatie van het monster 45 minuten.

Nadat het gelachtige pellet onderin de buis is geïdentificeerd, wordt het supernatant verwijderd. Was het pellet vervolgens met één milliliter ijskoud, 70%ethanol door de buis te vortexen, en centrifugeer de sample daarna bij 10 000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C. Verwijder tot slot het supernatant en keer de buis om om het pellet 10 minuten aan de lucht te laten drogen bij kamertemperatuur.

Resuspendeer vervolgens het RNA-pellet in 200 µL RNase-vrij water. Voeg eerst 20 µL 10x Turbo DNA-buffer en twee µL Turbo DNAse toe aan de microcentrifugebuis en meng de oplossing voorzichtig. Incubeer de buis vervolgens 20 minuten bij 37 °C, voeg daarna 20 µL geresuspendeerd DNAse-inactiveringsreagens toe aan de buis en meng dit goed.

Incubeer de buis nu nog vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen. Centrifugeer vervolgens het pellet in een microcentrifuge bij 10.000 ×g gedurende 1,5 minuut en breng daarna het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg één volume koud zuur fenol-chloroform toe aan het pellet en meng de oplossing vervolgens grondig door één minuut te vortexen.

Na het centrifugeren van de oplossing gedurende twee minuten bij 12 500 ×g, brengt u de waterige fase over naar een nieuwe buis en voegt u één volume chloroform-isoamylalcohol toe. Meng vervolgens de oplossing door te vortexen en centrifugeer de oplossing opnieuw onder dezelfde condities. Breng de waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.

Voeg vervolgens 0,1 volume drie molar natriumacetaat en 2,5 volumes ijskoude, 100% ethanol toe. Vortex de buis om te mengen. Incubeer het monster bij minus 80 °C gedurende 30 minuten.

Centrifuge vervolgens 30 minuten bij 12, 000 ×g bij vier °C en verwijder de supernatant. Was daarna de pellet met 1 mL ijskoud 70% ethanol. Verwijder de supernatant en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen.

Resuspendeer vervolgens het pellet in 100 µL RNase-vrij water. De Agilent Bioanalyzer is een op microfluïdica gebaseerd platform voor het bepalen van de grootte, kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA, RNA, eiwitten en cellen, en maakt gebruik van een maatstaf voor RNA-integriteit die bekend staat als het RNA integrity number of RIN. RNA dat met dit protocol is geëxtraheerd, levert 260/280-ratio's op variërend van 1,7 tot 2,0 en RIN-waarden groter dan of gelijk aan 7,0.

Een voorbeeld van een Agilent bioanalyzer electroferogram van het bacteriële RNA wordt hier links getoond, en een gel-achtig beeld van pseudomonas arosa teruggewonnen uit murine SQL-inhouden wordt hier rechts getoond. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve PCR of RNA-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals verfijnde genexpressieprofilering.