Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Het algemene doel van dit protocol is het gebruik van brightfield intravitale microscopie en time-lapse videografie om dynamische interacties tussen neutrofielen en endotheelcellen te bestuderen tijdens de rekrutering van neutrofielen als reactie op een chemoattractant voor neutrofielen in vivo. In deze video demonstreëren we de procedures voor het gebruik van brightfield intravitale videomicroscopie om intraluminaal kruipen van neutrofielen, transendotheliale migratie en chemotaxis in het spierweefsel van de muis te visualiseren en te bepalen. Leukocytenrekrutering is het kenmerk van ontsteking.

Dit rekruteringsproces begint wanneer leukocyten in de bloedbaan gaan rollen op het endotheel van postcapillaire venen op de plaats van de ontsteking. Als reactie op chemokinen of andere chemo-attractanten op het luminale oppervlak stoppen deze rollende leukocyten en hechten ze zich stevig aan het endotheel. Na de adhesie kruipen veel leukocyten over het luminale oppervlak en lijken ze te zoeken naar een optimale plaats voor transmigratie.

Na het kruipen bewegen leukocyten zich over het endotheel, een proces dat T-endotheliale migratie wordt genoemd. Daarna migreren neutrofielen in het extravasculaire weefsel naar de bron van de chemo-attractant op de ontstekingplaats, een proces dat chemotaxis MOI's wordt genoemd. Deze video laat het experiment zien over hoe brightfield intravitale video, microscopische time-lapse fotografie en ImageJ worden gebruikt om neutrofiel intraluminaal kruipen, T-endotheliale migratie en migratie bij chemotaxis in spierweefsel te visualiseren, te volgen en te bepalen, en de respons op de bron van een neutrofiele chemo-attractant.

Hallo, ik ben Lis Liu van de afdeling Farmacologie van de College of Medicine aan de University of Saskatchewan. Vandaag gaan we u laten zien hoe u de neutrofiel-chemotaxis in agarosegel uitvoert. Hoe u muis cremasterspieren voorbereidt voor intravitale microscopie.

Hoe celbeweging kan worden gevolgd met behulp van MEGJ. En tot slot, hoe de parameters voor de rekrutering van neutrofielen kunnen worden geanalyseerd. Twee promovendi in ons laboratorium, ngel Naja, sh, en Chile zullen u de gedetailleerde experimentele procedures tonen. Hallo, ik ben Naja Sh. Hallo, ik ben Chile.

Om dit experiment te starten, bereid dan eerst de neutrofiele chemo-attractant in agrogel voor; pipetteer 10 milliliter tweevoudige PBS in een conische buis van 50 milliliter. Warm de buis op door deze in een bekerglas met warm water te plaatsen. Pipetteer 10 milliliter gedestilleerd water.

Voeg 0,4 gram agrosepoeder toe aan een andere conische buis van 50 milliliter. Verhit het mengsel in een magnetron tot het net kookt om 2% agrose in PBS te maken. Voeg de warme tweevoudige PBS toe aan de buis met de agrosesolutie.

Wervel de gemengde oplossing en houd deze warm in het bekerglas met warm water. Meng de chemo-attractantoplossing grondig met drie µL India Ink in de dop van een 1,5 mL eppendorfbuisje. Voorkom dat er tijdens het mengen een luchtbel ontstaat.

Snijd het uiteinde van een 200 µL pipetpunt en micropipet af. Voeg 110 µL agro-oplossing bij 42 °C toe aan het deksel en meng dit onmiddellijk goed. Bewaar deze gel met chemo-attractant met een andere pipetpunt in de koelkast tot gebruik. Anestheseer een volwassen mannelijke muis via een IP-injectie van een mengsel van xylazine en ketamine.

Scheer het gebied boven de rechter vena jugularis externa en het anterieure aspect van het scrotum. Gebruik hiervoor een elektrische scheerplanner na de anesthesie; het is belangrijk om bijzondere aandacht en zorg te besteden aan de geanestheseerde muis. Een warmtelamp kan worden gebruikt om hypothermie bij de muis te voorkomen.

De muis moet vrij zijn van pijnreflexen. Maak een horizontale incisie, lokaliseer de jugulaire vene en catheteriseer deze met PE 10 tubing gevuld met 100 units per milliliter heparine-zoutoplossing. Sluit de tafel aan op een watercirculator van 37 °C om de cremasterspier en het lichaam van de muis warm te houden.

Fixeer de achterpoten van de muis met navelstrenglinten waarbij de muis met de buikzijde naar boven op het cremasterspierbord wordt geplaatst. Maak een incisie in de scrotale huid om de linker cremasterspier bloot te leggen. Disseceer de spier voorzichtig weg van de bijbehorende fascia.

Spoel de m. cremaster doorSpoel de m. cremaster met op 37 °C voorverwarmde bicarbonaatgebufferde zoutoplossing. Zet een 4.0 hechting in het distale uiteinde van de m. cremaster om deze vast te zetten op het transparante glazen platform van het cremasterbord. Coaguleer de m. cremaster in de lengte met een cauterisator en een 4.0 hechting.

Houd de spier plat en zet deze langs de randen vast op het plateau. Scheid de testikel en de epididymis van de onderliggende spier en verplaats deze naar de buikholte. Breng een dunne laag vacuümvet aan op tegenovergestelde randen van een glazen dekglas van 22 bij 22 millimeter.

Dek vervolgens de blootgestelde spier af met het glazen dekglas. Plaats de spierplank op de objecttafel van de microscoop. Onderzoek de spier onder de microscoop en zoek een geschikte postcapillaire vene.

Selecteer het vat dat een normale afschuifsnelheid en een diameter van 25 tot 40 micrometers heeft. Stel de videocamera zo in dat het vat in een verticale positie aan weerszijden, rechts of links, van de tv-monitor kan worden gevisualiseerd. Neem na 30 minuten de videobeelden van het geselecteerde postcapillaire vat op als baseline-controledata met behulp van een video-opnameapparaat, zoals een dvd-recorder.

Dit zijn de baseline controlevideo-beelden van de postcapillaire vene. Voordat de gel met chemoattractant op het oppervlak van de m. cremaster wordt geplaatst, wordt de superfusie gestopt en het glazen dekglas verwijderd. Punch een stukje gel met chemoattractant van 1 mm³ uit het dopje van de eppendorfbuis. Plaats de gepunchte gel met chemoattractant met behulp van een afgesneden punt van een 200 µL pipetpunt op het oppervlak van de m. cremaster in een vooraf geselecteerd gebied, 350 µm vanaf de waargenomen postcapillaire vene.

Plaats een dekglas om de gel op zijn plek te houden en perfuseer het spierweefsel met een zeer lage snelheid, gelijk aan of kleiner dan 10 µL per minuut, om de vorming van een gradiënt van chemoattractant mogelijk te maken die langzaam uit de gel vrijkomt. Neem het videobeeld 90 minuten na toevoeging van de gel die de chemoattractant bevat op. Pas tijdens de opname de focus van de microscoop aan en houd deze gericht op de hechtende, kruipende, transmigrerende en chemotactisch reagerende leukocyten binnen de vene en in het spierweefsel.

Importeer na het experiment het videobestand naar een computer. Voor analyse op een computer moet de video worden geëxtraheerd en worden geconverteerd naar een AVI-formaat. Gebruik bijvoorbeeld de gratis computersoftware Bit Ripper om DVD-video te converteren naar een AVI-bestand.

Gebruik videobewerkingssoftware, bijvoorbeeld Windows Movie Maker, om een time-lapse-film te maken van de oorspronkelijke realtime-video; converteer en sla de time-lapse-film op in DV A VI-formaat. Leg de beelden van de kalibratiemicrometer vast onder dezelfde microscoopinstellingen. Importeer de beelden naar de computer.

Open de afbeeldingen met ImageJ. Meet de grootte van het scherm op zowel de x- als de y-as en bereken het aantal pixels per micrometer. Om de film te importeren, opent u ImageJ. Klik opnieuw op 'File', vervolgens op 'Import' met behulp van de QuickTime movies-plugin, selecteer de te analyseren film en klik op 'OK' in de interface van de QT-filmopener. Klik op 'Plugins'. Gebruik 'Manual tracking' om cellen te volgen; vul de relevante informatie in de velden onderaan het scherm in voordat u met het volgen begint. De volgende parameters moeten vóór het volgen van de tijd worden bepaald.

Het interval in seconden is de totale tijdsduur gedeeld door 30; de xy-kalibratie is de micrometer-per-pixel meting vanuit de kalibratie van het beeld van de micrometer; de Z-kalibratie is ingesteld op nul; de zoekvierkantgrootte voor centrering is gelijk aan één. Het is noodzakelijk om in de opgenomen video een stabiel en duidelijk punt als referentiepunt te selecteren. Dit referentiepunt kan elk duidelijk en klein structureel punt zijn dat ongewijzigd en stabiel blijft gedurende het gehele experiment.

Klik op 'add track' om het referentiepunt van het eerste tot het laatste frame te volgen. Klik vervolgens op en volg kruipende en migrerende neutrofielen één voor één. Klik op 'add track' om de cel te volgen vanaf het moment dat deze in het weefsel verschijnt tot het moment dat deze in elk frame verdwijnt.

Klik vervolgens op track om de procedure te voltooien en sla de resultaten op in Microsoft Excel. Open het resultatenbestand in Microsoft Excel. Begin met het analyseren van de gegevens.

Het is belangrijk om de bewegingen van het referentiepunt mee te nemen in de analyse. Bij het volgen van het kruipen van neutrofielen en het lumen bepalen we de kruipafstand en de kruipsnelheid van de neutrofielen en het lumen. Bij het analyseren van de transendotheliale migratie van neutrofielen meten we de transmigratietijd van de neutrofielen en de loslaat-tijd.

Bij het bepalen van de neutrofiele chemotaxis in spierweefsel meten we de afstand en snelheid van de migratie en chemotaxis van neutrofielen in de spier, en bepalen we daarnaast de chemotaxisindex tijdens de neutrofiele chemotaxis in spierweefsel. De definities van deze parameters, zoals weergegeven op het scherm, worden gedetailleerd beschreven in ons geschreven protocol. In dit experiment demonstreren we de procedures voor het gebruik van brightfield intravitale microscopie om het intraluminale kruipen, de endotheliale migratie en de migratie bij chemotaxis van neutrofielen te visualiseren en te bepalen.

In reactie op neutrofiel chemoattractantia in vivo, gebruikten we ofwel MIP two CX CL two, of het synthetische peptide W-K-Y-M-V-M bereid in een agaro-gel om neutrofielrekrutering in muis-CMA-spierweefsel te induceren. Zoals we in deze figuur kunnen zien, veroorzaakten MIP two bij 0,5 MICROMOLAR en W-K-Y-M-V-M bij 0,1 millimolar intraluminaal kruipen van neutrofielen met vergelijkbare snelheden. De transendotheliale migratie van neutrofielen en het loskoppelen van de vene waren vergelijkbaar wat betreft de tijdsduur.

Deze twee chemoattractanten induceerden ook neutrofielmigratie en chemotaxis in spierweefsel met bijna dezelfde snelheid en vergelijkbare neutrofiele chemotaxis-indexen. Intravitale microscopie is een waardevol hulpmiddel voor directe observatie van het proces van neutrofielrekrutering en voor kwantitatieve bepaling van de functies van cellen en moleculen in elke stap van de rekrutering. Door gebruik te maken van time-lapse videofotografie en ImageJ kunnen de intraluminale kruipende endotheelmigratie en de migratie bij chemotaxis van leukocyten in weefsel worden gemeten onder helderveld- intravitale microscopie met selectieve remmers, transgene muizen en selectieve chemoattractanten.

Het assaysysteem kan ons helpen de functies van specifieke eiwitten bij de rekrutering van leukocyten te onthullen.