Name: GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Ontdek hoe GENPLAT enzymcocktails optimaliseert voor biomassa-afbraak met geautomatiseerde vloeistofhantering. Dit platform verbetert de efficiëntie van lignocellulose-omzetting naar fermenterbare suikers voor biobrandstofproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gefinancierd door het Amerikaanse Department of Energy Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) en het verlenen van DE-FG02-91ER200021 van het Amerikaanse ministerie van Energie, Bureau van Basic Energy Sciences, Division van Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences. Wij danken John Scott-Craig en Melissa Borrusch voor hun materiële en conceptuele bijdragen.

1. Productie van enzymen <ol><li> Produceren eiwitten in Pichia pastoris door het klonen van de overeenkomstige genen in vectoren pPICZ of pPICZα en transformatie in de P. pastoris. Groeien cellen in batches van 300 ml in de war van 500 ml flesjes met methanol inductie per 24 uur (Banerjee et al.., 2010a). </li><li> Concentreren en ontzouten de cultuur filtraten door tangentiële flow filtratie. </li><li> Bewaar de enzymen in kleine porties in 20% glycerol bij -80 ° C. De concentratie range is 1-10 mg / ml. </li></ol> 2. Ontwerp van Experiment <ol><li> Voer het aantal enzymen te testen, hun bovenste en onderste proporties (bijvoorbeeld een lager percentage van 5% voor kern enzymen), en het type van de experimentele opzet (bijvoorbeeld kwadratisch of kubieke) in de Design-Expertsoftware. </li><li> Bereken de hoeveelheid in ug van elk enzym worden toegevoegd aan een totale belasting van 15 mg / g glucan te maken, en dan berekenen het bedrag van elke enzym in ul toe te voegen aanelke reactie. </li><li> Het genereren van Excel-werkbladen met vermelding van de bron laboratoriumartikelen, bron putten, bestemming laboratoriumartikelen, bestemming putten, en de overdracht volumes voor het doseren van water en enzymen op basis van de experimenteel ontwerp en importeren in het Biomek FXP software met behulp van de transfer-van-file functie. </li></ol> 3. Enzymatische hydrolyse <ol><li> Hang de biomassa slurry in 50 mM natriumcitraat, pH 4,8, met 5 ug / ml tetracycline en 5 ug / ml cycloheximide, in de peddel reservoir. </li><li> Robot Pipetteer 200 ul van de slurry in elke well van een 96-wells deep-well platen reactie met behulp van Span-8 1000-il pipetpunten met de laatste 0,5 cm afgesneden. Zodra Meng de slurry op 100 ul / sec en dan zuig hetzelfde volume van de peddel reservoir en afzien in de platen. </li><li> Doseer de enzymen in de dezelfde plaat met behulp van het programma ingevoerd in de Beckman FX. </li><li> Afdichting van de platen met doorboren capmats. </li><li> Omkeren en tik opde platen een paar keer aan de oppervlakte spanning te overwinnen. Plaats de platen bij 50 ° C gedurende 48 uur in de hybridisatie incubator roterende bij 10 toeren per minuut. </li></ol> 4. Bepaling van het GLC en XYL <ol><li> Centrifugeer de reactie platen gedurende 3 min bij 1250 xg in een swingende emmer centrifuge. </li><li> Breng 100 ul van de bovenstaande vloeistof in de reguliere 96-wells platen met behulp van de AP96 pod van de Biomek FX. </li><li> Incubeer de platen bij 90-95 ° C gedurende 10 min in om de enzymen te inactiveren, en dan centrifugeer bij 1250 xg gedurende 30 sec. </li><li> Voor Glc metingen, overdracht 12 ul van de bovenstaande vloeistoffen in de reguliere 96-wells platen. Voeg 192 ul van de glucose-oxidase / peroxidase (GOPOD) reagens. Incubeer de platen bij 50 ° C gedurende 20 min en lees de absorptie bij 510 nm in een microplaat reader. Blank is reactiemengsel met geen enzym. </li><li> Voor de XYL metingen, transfer 4 pl in 384-wells platen. Voeg de assay reagentia en lees de platen bij 340 nm. Blancowordt het reactiemengsel met geen enzym. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Zet de extinctiewaarden om hun% Glc en XYL rendementen op basis van de bekende GLC en XYL inhoud van de oorspronkelijke biomassa. Importeren deze percentages als de antwoorden in de Design-Expert software. Controleer de statistische parameters, om er zeker van dat de criteria voor een robuust model is voldaan. </li><li> Experimenteel te bevestigen het beste model voorspelling. </li></ol> 6. Representatieve resultaten met GENPLAT: (1) Creatie van geoptimaliseerde mengsels van individuele pure eiwitten. De resultaten geven aan welke enzymen belangrijk zijn, en in welke verhouding, en ook welke enzymen zijn niet belangrijk. Sommige eiwitten die in overvloed zijn in de T. reesei secretoom (Nagendran et al.., 2009), zoals Cip1 en Cip2, lijken geen rol te spelen in Glc ontslag uit maïsstro voorbehandeld door ammoniak vezels expansie (AFEX) of alkalisch HYD Rogen peroxide (AHP) (Banerjee et al.., 2010b). Aan de andere kant, sommige eiwitten zijn belangrijk onverwacht. Bijvoorbeeld, endo-xylanasen van glycosyl hydrolase familie 10 en 11 zijn beide van belang voor Glc vrijlating; een xylanase kan geen vervanging zijn voor de andere (Banerjee et al., 2010b, c).. Cel61A, een klein eiwit in de T. reesei secretoom, is erg belangrijk voor Glc, maar niet XYL release. Sommige enzymen zijn belangrijk voor het vrijgeven van zowel GLC en XYL, terwijl andere zijn alleen nodig voor de ene of de andere (Banerjee et al.., 2010C). Een synthetisch mengsel dat 16 componenten, die elk bij een concentratie van 0,94 mg / ml (dwz een niet-geoptimaliseerde mengsel), vrij 38% van de beschikbare Glc van AFEX-voorbehandelde DDG. Onder identieke omstandigheden hydrolyse, een geoptimaliseerde mengsel, waarin de concentraties van de 16 componenten varieerden van 0% tot 32%, vrij 52% van de Glc (afb. 2). Dit experiment illustreert het nut van de bouw van gedefinieerde mengsels. _content "&gt; (2) Creatie van cocktails geoptimaliseerd voor verschillende voorbehandeling / substraat combinaties. De huidige commerciële cellulase voorbereidingen zijn" one-size-fits-all ". In werkelijkheid is de beste cocktail is afhankelijk van zowel de ondergrond en de voorbehandeling. Een product zoals Accellerase 1000 geeft verschillende opbrengsten uit verschillende substraten voorbehandeld op dezelfde manier, en van hetzelfde substraat blootgesteld aan verschillende voorbehandelingen (fig. 1). We hebben GENPLAT gebruikt om mengsels van pure enzymen te optimaliseren voor meerdere voorbehandelingen en mutiple grondstoffen (Banerjee et Al., 2010C). Figuur 2 laat zien hoe de optimale enzym verhoudingen van 16 pure enzymen verschilt voor AFEX-voorbehandelde maïsstro, AHP-voorbehandelde maïsstro, en AFEX-voorbehandelde DDG. Slechts 11 enzymen worden getoond in Fig. twee, omdat de optimale proporties van de andere vijf (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, en Cel12A) bleken 0% (Banerjee et al.., 2010C). (3) Nieuwe enzym ontdekking T. reesei en A. niger gekweekt op verschillende substraten. Een bijzonder extract versterkt Glc opleveren wanneer toegevoegd aan onze kern in te stellen. De verantwoordelijke eiwit werd gezuiverd en aangetoond dat het een roman glycosyl hydrolase niet aanwezig zijn in een commerciële enzympreparaat (Banerjee en Walton, niet gepubliceerde resultaten) zijn. (4) Ontdekking van een betere enzymen. Na afgebeeld met GENPLAT welke enzymen het belangrijkst zijn voor de afbraak van eenname biomassa, hebben we een beter begrip van die enzymen moet de focus voor verbetering. Betere voorbeelden van de kritieke enzymen kunnen worden gevonden door te zoeken in de natuur of door eiwit engineering. (Een enzym kan worden "beter" dan de T. reesei homoloog op verschillende manieren, afhankelijk van de gewenste eigenschap, bijvoorbeeld een hogere specifieke activiteit, meer synergie, verminderde proteolytische gevoeligheid of verbeterde thermische stabiliteit). GENPLAT levert een zinvolle platform voor het testen potentieel betere enzymen, omdat het gebruik maakt van een realistisch complexe cocktail (belangrijk omdat geen biomassa enzym werkt in isolatie) en een realistisch substraat (belangrijk omdat de resultaten met pure cellulose of andere kunstmatige substraten kunnen niet relevant zijn voor natuurlijke lignocellulose materialen). (5) Commerciële enzym optimalisatie. Voldoende grote hoeveelheden pure enzymen nog niet bestaan ​​in de echte wereld. Tot ze doen, ethanol proproducenten moeten vertrouwen op commerciële producten zoals Accellerase 1000 en MultifectXylanase. Echter, mengsels van commerciële enzymen over het algemeen beter presteren dan een individu een, en GENPLAT kan worden gebruikt om optimaal cocktails van verschillende commerciële enzymen te ontwerpen. Figuur 3 toont het gebruik van GENPLAT te optimaliseren een mengsel van vier commerciële enzympreparaten. De optimale verhouding voor het vrijgeven van Glc van AFEX-voorbehandeld DDG bleken 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, en 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al.., 2010C) zijn. Figuur 3B toont de verschillen in Glc opbrengst van AFEX-DDG met vier enzympreparaten, de geoptimaliseerde commerciële mengsel geeft een hogere opbrengst dan Glc Accellerase1000 alleen, SpezymeCP alleen, of een 16-component synthetisch mengsel. Dit experiment geeft ook aan dat de 16-component synthetisch mengsel is van een of meer enzymen die nodig zijn voor een optimale Glc release, die aanwezig zijn in een of meer van de commerciële enzymen ontbreken. GENPLAT kunnen onsed van dergelijke componenten te identificeren. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Geen enkele commerciële enzympreparaat is optimaal voor alle ondergronden en alle voorbehandelingen. Vijf substraten en drie voorbehandelingen werden vergeleken onder vergelijkbare omstandigheden voor het malen van (0,5 mm korrelgrootte), enzym laden (15 mg / g glucan), en hydrolyse omstandigheden (48 uur, 50 ° C). A. Spijsvertering van verschillende AFEX voorbehandelde substraten met Accellerase 1000. B. Spijsvertering van maïsstro voorbehandeld door drie verschillende methoden met Accellerase 1000 (zie Banerjee et al.., 2010C). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Optimale verhoudingen van 11 enzymen voor de vrijgave van Glc van AFEX-voorbehandelde maïsstro (AFEX-CS), alkalische waterstofperoxide-voorbehandelde maïsstro (AHP-CS), of AFEX-voorbehandelde gedroogde destillerenERS 'korrels (AFEX-DDG). De gegevens zijn afkomstig Banerjee et al.. (2010C). Getallen langs de bovenkant van de balken zijn de Glc levert als een procent van de totale Glc in de biomassa monster. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. A. Het gebruik van GENPLAT om een optimale mix van vier commerciële enzympreparaten voor het vrijgeven van Glc van AFEX-voorbehandelde DDG te produceren. Multifect xylanase maakte de kleinste bijdrage (4%) en is daarom weggelaten uit deze ternaire diagram. B. Glc opbrengsten van AFEX-DDG met verschillende enzym behandelingen onder identieke condities hydrolyse (15 mg / g glucan enzym, 48 h, 50 ° C) . "Vier-component commerciële" heeft de verhoudingen bepaald op basis van het experiment getoond in Fig. 3A.

<ol><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction%3A+production+and+optimization+of+a+core+set%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengineer%22%5BJournal%5D)">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment%2Fbiomass+feedstock+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li>
<li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li>
<li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li>
<li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+%28AFEX%29+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li>
<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het is algemeen erkend dat verlaging van de kosten van enzymen is belangrijk voor de ontwikkeling van een zuinige lignocellulose-ethanol industrie. Op dit moment beschikbare commerciële enzym cocktails zijn complex en slecht gedefinieerde mengsels van vele eiwitten (Nagendran et al.., 2009), en ze zijn aangepast vooral voor gebruik op zuur-voorbehandeld maïsstro. Om de ontwikkeling van betere enzym cocktails te versnellen, hebben verscheidene laboratoria ontwikkelde high-throughput platformen voor enzym ontdekking en karakterisering. Inspanningen op dit gebied hebben opgenomen van een of meer van de volgende eigenschappen ook gevonden in GENPLAT: robot afgifte van enzymen en biomassa slurries, statistische ontwerp van experiment, en / of geautomatiseerde bepaling van het GLC en XYL (Berlijn et al., 2007; Decker et. al., 2009;. Kim et al., 1998;. King et al., 2009).. GENPLAT breidt deze eerdere pogingen, wat het belangrijkst is in de complexiteit van het enzym mengsels kunnen worden geanalyseerd op de meeste zes componenten inde eerdere studies tot meer dan 16 in onze laatste werk (Banerjee et al.., 2010C). Extra belangrijkste kenmerken van GENPLAT zijn het gebruik van een kraal mengkamer (peddel reservoir) aan te kunnen houden Stover slurries opgeschort tijdens toevoer; voorzichtig mengen tijdens de spijsvertering door end-over-end rotation en geautomatiseerde colorimetrische bepaling van Glu en XYL.

Apparatuur en software gebruikt: <ol><li> Design-Expert-software, versie 8.0 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP laboratorium automatisering werkstation (Beckman Coulter-, Fullerton, CA) </li><li> Biomek FXP-software, versie 3.3 (Beckman Coulter-, Fullerton, CA) </li><li> Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V &amp; P Scientific Inc, San Diego) </li><li> Platen, 96-diep (1,5 ml) goed (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Verenigd Koninkrijk) </li><li> Doorboren capmats (USA Scientific, Ocala, FL) </li><li> Roterende hybridisatie incubator (Model 5420, VWR) </li><li> Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Duitsland) </li><li> Platen, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Verenigd Koninkrijk) </li><li> Platen, 384-wells (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Reagentia gebruikt: <ol><li> Pichia pastoris en vectoren: stam X33, en pPICZ en pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei en vectoren: stam QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Research Gebruik, Peoria, IL), en pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (lot nummer 1600844643) (Genencor, Inc, Rochester, NY) </li><li> 50 mM natriumcitraat, pH 4,8 </li><li> Tetracycline voorraad: 10 mg / ml </li><li> Cycloheximide voorraad: 10 mg / ml </li><li> GOPOD testkit, catalogus K-Gluc (Megazyme, Bray, Ierland) </li><li> Xylose testkit, catalogus K-xylose (Megazyme, Bray, Ierland) </li></ol>

genplat: een geautomatiseerd platform voor biomassa enzym discovery en cocktail optimalisatie

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

De hoge kosten van enzymen voor de afbraak van biomassa vormen een belangrijke belemmering voor de economische omzetting van lignocellulosische grondstoffen naar vloeibare transportbrandstoffen zoals ethanol. We hebben een geïntegreerd high-throughput platform ontwikkeld, genaamd GENPLAT, voor de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe enzymen en enzymcocktails voor het vrijmaken van suikers uit diverse combinaties van voorbehandeling en biomassa. GENPLAT bestaat uit vier elementen: individuele pure enzymen, statistisch experimenteel ontwerp, robotgestuurde pipettering van biomassasuspensies en enzymen, en geautomatiseerde colorimetrische bepaling van vrijgekomen Glc en Xyl. Individuele enzymen worden geproduceerd door expressie in Pichia pastoris of Trichoderma reesei, of door chromatografische zuivering uit commerciële cocktails of uit extracten van nieuwe micro-organismen. Simplex lattice (fractionele factoriële) mengmodellen worden ontworpen met behulp van commerciële statistische software voor experimenteel ontwerp (Design of Experiment). Enzymmengsels van hoge complexiteit worden samengesteld met behulp van robotgestuurde pipettering in een 96-wells formaat. De meting van vrijgekomen Glc en Xyl is geautomatiseerd met behulp van enzymgekoppelde colorimetrische assays. Geoptimaliseerde enzymmengsels bestaande uit maximaal 16 componenten zijn getest op een verscheidenheid aan combinaties van grondstoffen en voorbehandelingen.
GENPLAT is aanpasbaar voor mengsels van zuivere enzymen, mengsels van commerciële producten (bijv. Accellerase 1000 en Novozyme 188), extracten van nieuwe microben of combinaties daarvan. Om mengsels van ˜10 zuivere enzymen te maken en te testen, zijn minder dan 100 μg van elk eiwit en minder dan 100 reacties in totaal nodig, wanneer er wordt gewerkt met een uiteindelijke totale belading van 15 mg eiwit/g glucaan. We gebruiken enzymen uit diverse bronnen. Enzymen kunnen worden gezuiverd uit natuurlijke bronnen zoals schimmelculturen (bijv. Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum en Galerina marginata), of ze kunnen worden geproduceerd door expressie van de coderende genen (verkregen uit het toenemende aantal microbiële genoomsequenties) in gastheren zoals E. coli, Pichia pastoris of een draadschimmel zoals T. reesei. Eiwitten kunnen ook worden gezuiverd uit commerciële enzymcocktails (bijv. Multifect Xylanase, Novozyme 188). Een toenemend aantal zuivere enzymen, waaronder glycosylhydrolasen, celwand-actieve esterasen, proteasen en lyasen, is verkrijgbaar via commerciële bronnen, zoals Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) en PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) wordt gebruikt om simplex-lattice-ontwerpen te maken en responsen te analyseren (in dit geval de afgifte van Glc en Xyl). Mengsels bevatten 4-20 componenten, waarvan de proportie kan variëren tussen 0 en 100%. De assaypunten omvatten doorgaans de extreme hoekpunten met een voldoende aantal tussenliggende punten om een valide model te genereren. In de terminologie van experimenteel ontwerp zijn de meeste van onze studies "mengsel"-experimenten, wat betekent dat de som van alle componenten leidt tot een totale vaste eiwitbelading (uitgedrukt in mg/g glucaan). Het aantal mengsels in het simplex-lattice hangt af van zowel het aantal componenten in het mengsel als de graad van het polynoom (kwadratisch of kubisch). Bijvoorbeeld, een experiment met 6 componenten zal 63 afzonderlijke reacties vereisen met een uitgebreid speciaal kubisch model, waarmee drieweg-interacties kunnen worden gedetecteerd, terwijl slechts 23 individuele reacties nodig zijn met een uitgebreid kwadratisch model. Voor mengsels die meer dan acht componenten bevatten, is een kwadratisch experimenteel ontwerp praktischer, en naar onze ervaring zijn dergelijke modellen doorgaans statistisch valide.
Alle enzymbelastingen worden uitgedrukt als een percentage van de uiteindelijke totale belasting (die voor onze experimenten doorgaans 15 mg eiwit/g glucaan is). Voor "kernenzymen" is de ondergrens ingesteld op 5%. Deze limiet is afgeleid uit onze ervaring, waarbij de opbrengsten van Glc en/of Xyl zeer laag waren als een kernenzym op 0% aanwezig was. Slechte modellen zijn het gevolg van te veel monsters die zeer lage Glc- of Xyl-opbrengsten vertonen. Het vaststellen van een ondergrens bepaalt op zijn beurt een bovengrens. Dat wil zeggen dat voor een experiment met zes componenten, als de ondergrens voor elke individuele component op 5% wordt gesteld, de bovengrens van elke individuele component 75% zal zijn. De ondergrenzen van alle andere enzymen die als "accessoir" worden beschouwd, zijn ingesteld op 0%. "Kern" en "accessoir" zijn enigszins arbitraire aanduidingen en zullen variëren afhankelijk van het substraat, maar in onze studies bestaan de kernenzymen voor de vrijgave van Glc uit maïsloof uit de volgende enzymen van T. reesei: CBH1 (ook bekend als Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10) en BX (β-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) is een geautomatiseerd platform voor ontdekking en optimalisatie van het enzym cocktails voor biomassa degradatie. Het kan worden aangepast aan de verschillende grondstoffen en mengsels van enzymen met meerdere componenten.

GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

De hoge kosten van enzymen voor de afbraak van biomassa vormen een belangrijke belemmering voor de economische conversie van lignocellulosische grondstoffen naar vloeibare ...

In deze procedure worden enzymmengsels voor de omzetting van lignocellulose-biomassa in vrije suikers geoptimaliseerd met behulp van een geautomatiseerd systeem, bekend als het A-G-L-B-R-C enzymplatform of gen plat. Eerst wordt een mengselmodel ontworpen waarin vier tot 18 verschillende enzymen worden gecombineerd in maximaal 96 verschillende verhoudingen met behulp van software voor experimenteel ontwerp (design of experiment). De biomassa en enzymen worden vervolgens met een robotisch vloeistofbehandelingssysteem in 96 deep-well platen gepipetteerd.De platen worden afgesloten en 48 uur geïncubeerd bij 50 °C. Na de incubatie worden de wells bemonsterd met een geautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteem, en worden de vrije glucose en xylose gemeten met een colorimetrische enzymgekoppelde assay. Vervolgens wordt software voor experimenteel ontwerp gebruikt om te bepalen welke combinaties van enzymen de maximale hoeveelheid vrije glucose en xylose opleveren.Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig de efficiëntie van diverse enzymcocktails te testen voor de omzetting van lignocellulose-biomassa in fermenteerbare suikers voor ethanol, met als overkoepelend doel de productiekosten van biobrandstoffen te verlagen. Hoewel we deze methode voornamelijk gebruiken voor het analyseren van enzymcocktails op alkalisch voorbehandelde maïsstengels, is deze aanpasbaar aan elke voorbehandeling in elke grondstof, zoals zuurbehandelde populier, switchgrass en gedroogde distillers grains. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe enzymen te ontdekken die belangrijk zijn voor de afbraak van biomassa en om betere varianten van bekende enzymen te vinden.Hoewel de enzymen die voor gem plats worden gebruikt uit verschillende bronnen kunnen komen, zijn de enzymen in deze demonstratie geproduceerd door PPIC of PPIC alpha tot expressie te brengen in Pia Pastis gro-cellen in batches van 300 milliliter en gebaffelde kolven van 500 milliliter gedurende drie dagen. Voer vervolgens gedurende de volgende vier dagen elke 24 uur een methanolinductie uit na de laatste dag van methanolinductie. Giet de monsters in een tangential flow filtratiesysteem met een membraan met een cutoff van 10 kilodalton om de cultuur te concentreren en te ontzouten.Voer vervolgens een bufferuitwisseling uit op de filtraten met vijf volumes 25 millimolair natriumacetaat pH 5, en concentreer het monster om het volume tussen 10 en 25 milliliter te brengen. Meet de eiwitconcentratie met de BCA-methode met BSA als standaard; de uiteindelijke concentratie van de enzymvoorraadoplossingen moet 0,5 tot 10 milligram per milliliter zijn. Bewaar de enzymen in kleine aliquoten in 20% glycerol bij -80 °C om simplex-lattice-ontwerpen te creëren.Begin met het openen van het Design-Expert-programma op een pc. Voer het aantal te testen enzymen en de bovenste en onderste proporties in. Voor kernenzymen is dit bijvoorbeeld een onderste proportie van 5%. Geef vervolgens aan of het experimentele ontwerp kwadratisch of kubisch is.Voor mengsels met meer dan acht componenten in Excel is een kwadratische benadering noodzakelijk. Bereken de hoeveelheid in microgram van elk enzym die moet worden toegevoegd om een totaal van 15 milligram per gram glucaan per monster te laden. Bereken vervolgens, op basis van de proteïneconcentraties van de voorraden, de hoeveelheid van elk enzym in microliter die aan elke reactie moet worden toegevoegd.Genereer aanvullende Excel-werkbladen waarin de bronputjes in LabWare, de bestemmings-LabWare, de bestemmingsputjes en de transfervolumes voor het dispenseren van water en enzymen worden gespecificeerd volgens het experimentele ontwerp. Importeer tot slot het werkblad in de Biome FX-software via de functie 'transfer from file' om een voorbehandeld maïskachelbiomassa-slurry te genereren. Giet de gedroogde biomassa in een Wiley-molen en maal deze tot deze door een zeef van 0,5 millimeter past.Verzamel de gemalen biomassa in een bekerglas. Het glucangehalte wordt gemeten volgens standaardmethoden zoals beschreven in de JoVE-methode voor de uitgebreide compositionele analyse van plantencelwanden, deel één lignine. Zodra het glucangehalte is bepaald, wordt de biomassa gemengd met natriumcitraatbuffer zodat de uiteindelijke glucanconcentratie 0,5% is. Zet het roerreservoir aan en giet het biomassasuspensie erin.Terwijl de enzymen op ijs blijven, is de benodigde hoeveelheid van elk enzym afhankelijk van de omvang van het experiment om biomassa te dispenseren. Slurries worden klaargemaakt door met een scheermesje de laatste 0,5 centimeter van acht 100 µL pipetpunten af te snijden om brede openingen te creëren.De afgeknotte span eight tips kunnen worden hergebruikt. Plaats de tips na het afknotten in een pipetbox, zodat ze automatisch kunnen worden opgenomen door de SPAN eight. Dit instrument is uitgerust met een SPAN eight pod met een wegwerptipfunctie waarmee individuele oplossingen in individuele wells kunnen worden gedispenseerd en een vaste AP 96 pod, waarmee 96 identieke oplossingen tegelijkertijd in een 96-wellplaat kunnen worden overgebracht; richt vervolgens het deck van het vloeistofbehandelingssysteem in.Dit bestaat uit 1 96 deep well reactieplaat, een doppen van een tipbox gevuld met water, een enzymrek met de enzymen in 1.5 milliliter eend orph tubes, en verschillende volle tipboxen op de deckposities zoals geprogrammeerd in de instrumentinstellingen. Zodra het deck gereed is, controleert u het programma op eventuele fouten. Start de Beckman fx.De SPAN eight-arm zal eerst 200 µL van het biomassa-slurry in elke put van de 96-puts deep well reactieplaten pipetteren. De SPAN eight-pod zal vervolgens enzymen in elke put dispenseren, overeenkomstig het spreadsheet dat is geïmporteerd in de Biome FX-software. Zodra het pipetteren is voltooid, wordt de 96-puts deep well plaat van het deck verwijderd.Sluit de plaat af met een pi- of dopmat. Keer de plaat vervolgens om en tik er eenmaal of tweemaal tegen om de oppervlaktespanning te doorbreken. Plaats de plaat na de incubatiecentrifuge voor 48 uur in de hybridisatieoven.Centrifugeer de 96-well plaat met diepe putjes gedurende drie minuten bij 1.500 ×g in een centrifuge met zwaaibare rotor terwijl de plaat draait. Programmeer de Beckman FX om de AP 96-pod te gebruiken voor het pipetteren van 100 µL uit elke put in een standaard 96-well plaat. Plaats de plaat na het centrifugeren in het instrument en start het pipetteren.Wanneer het pipetteren is voltooid, worden de platen 10 minutes bij 100 °C geïncubeerd op een platenverwarmer om de enzymen te inactiveren, waarna de plaat 30 seconden wordt gecentrifugeerd bij 1.500 ×g. Voor GLC-metingen wordt eerst 192 µL van het glucose-oxidase-peroxidase-reagens toegevoegd met behulp van een programma dat is geschreven voor de AP 96-pod van de Beckman fx.Gebruik vervolgens de AP 96-pod om 12 µL van het monster over te brengen naar een standaard 96-wells plaat. Incubeer de platen bij 50 °C gedurende 20 minuten en meet de absorbentie bij 510 nm in een microplaatlezer. Voor xlo-metingen voegt u de assay-reagentia toe volgens de instructies van de kit.Gebruik vervolgens de AP 96 pod om vier microliters van elke put over te brengen naar 384-put platen en meet de absorbentie bij 340 nanometers. Voer de data-analyse uit zoals beschreven in het bijbehorende document met behulp van Design Expert-software. Vijf substraten en drie voorbehandelingen werden vergeleken onder vergelijkbare omstandigheden van malen met een partikelgrootte van 0,5 millimeter, een enzymbelading van 15 milligram per gram glucaan en hydrolyse-omstandigheden.48 uur bij 50 °C, zoals hier te zien is. Er zijn opvallende verschillen tussen de grondstoffen en tussen de voorbehandelingen. Het is duidelijk dat de enzymcocktail accelerates 1000 alleen niet in staat is om alle variabiliteit die wordt gezien in de voorbehandelingen en grondstoffen op te vangen.Dit experiment vergelijkt maïsstro met FEX-voorbehandeling, aangeduid als A-F-E-X-C-S, maïsstro met alkalische peroxide-voorbehandeling, A-H-P-C-S en gedroogde distillers grains met FEX-voorbehandeling, A-F-E-X-D-D-G. De getallen boven de staven zijn de glucoseopbrengsten als percentage van de totale glucose in het biomassa-monster. Let op dat de samenstelling van de cocktails aanzienlijk verschilt afhankelijk van de voorbehandeling en het biomassasubstraat.Hoewel het hoofddoel van gem plat het maken van synthetische mengsels van zuivere enzymen is, kan het ook worden gebruikt om geoptimaliseerde mengsels van commerciële enzympreparaten te produceren. Paneel A toont een schema van vier enzymen die zijn geoptimaliseerd voor de vrijgave van glucose uit A-F-E-X-D-D-G; paneel B toont de resulterende opbrengsten bij gebruik van dit geoptimaliseerde mengsel vergeleken met drie andere enzympreparaten. We hebben zojuist aangetoond hoe gen plat kan worden gebruikt om de afbraak van biomassa met behulp van individuele zuivere enzymen te ondersteunen.Elk enzym heeft een specifieke katalytische activiteit die bijdraagt aan de volledige afbraak van plantencelwanden tot individuele suikers. Het is echter niet nodig om de precieze katalytische activiteit van een enzym te kennen om het belang ervan bij de deconstructie van biomassa te evalueren. Met behulp van Gen pla is het essentieel om te weten welke enzymen belangrijk zijn en in welke verhoudingen, om bioprospecting gericht te kunnen sturen.Voor nieuwe enzymen voor eiwitengineering en voor de ontwikkeling van organismen voor geconsolideerde bioprocessing zijn de resultaten soms verrassend. We stelden bijvoorbeeld vast dat voor het vrijmaken van glucose uit Conover een combinatie van twee niet-verwante Xin ais superieur is aan elk van de Xin afzonderlijk. We ontdekten ook dat een betere manase belangrijk is voor het vrijmaken van glucose uit droge distillersgrain.Hoewel dit materiaal een laag rendement en gehalte heeft, zal deze methode de weg vrijmaken voor onderzoekers om nog betere enzymcocktails te ontwikkelen voor diverse omstandigheden. Men hoeft niet eens te weten wat een specifiek eiwit enzymatisch doet om de bijdrage ervan aan de afbraak van lignocellulose te testen.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

This video demonstrates an assay to screen enzymes effective in degrading complex polysaccharides in plant biomass using insoluble chromogenic biomass or ICB. The enzymes hydrolyze ICB to release soluble dye-linked oligosaccharides, and the enzyme activity is assessed by colorimetric analysis of the reaction product.

Insoluble Chromogenic Biomass-Based Enzyme Screening: An Assay to Evaluate the Degradation Activity of Plant Biomass-Degrading Enzymes

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Ontdek hoe GENPLAT enzymcocktails optimaliseert voor biomassa-afbraak met geautomatiseerde vloeistofhantering. Dit platform verbetert de efficiëntie van lignocellulose-omzetting naar fermenterbare suikers voor biobrandstofproductie.

GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

Meer video's verkennen