Oprichting van Epstein-Barr Virus Growth-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van Epstein-Barr virus-getransformeerde lymfoblastcellijnen, of LCL, vanuit menselijke B-cellen. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen uit perifeer bloed te isoleren uit menselijk bloed.

Vervolgens worden de cellen geïnfecteerd met het Epstein-Barr virus in aanwezigheid van FK 5 0 6 en immunosuppressiva. Drie tot vier dagen na infectie met het Epstein-Barr virus ontstaat een subpopulatie cellen die wordt gekenmerkt als CD 23-hoog en CD 58-positief, en waarvan wordt voorspeld dat deze zal prolifereren. CD 23-hoge, CD 58-positieve cellen kunnen via flowcytometrie worden geteld als voorspeller voor een succesvol resultaat. Prolifererende cellen kunnen verder microscopisch en macroscopisch worden geïdentificeerd aan de clusters van lymfoblast-cellijnen die zich vormen in succesvol getransformeerde celculturen.

De laatste stap is het expanderen van lymfoblastcellijnen voor cryopreservatie. In mijn laboratorium genereren we lymfoblastcellijnen of LCL's om de interacties tussen de gastheer en het Epstein-Barr-virus te begrijpen. Lymfoblastcellijnen zijn daarnaast van breed algemeen belang voor de wetenschappelijke gemeenschap, in het bijzonder voor virologen, immunologen en kankerbiologen.

Als postdoctoraal onderzoeker in het Macintosh-laboratorium zal ik de procedure demonstreren voor het genereren van lymfoblasten-cellijnen. Nadat er 10 milliliter bloed bij een donor is afgenomen, voegt u het gehepariniseerd bloed toe aan een conische buis van 50 milliliter en verdunt u dit vervolgens één op twee. Voeg nu 20 milliliter PBS op kamertemperatuur toe aan de buis, leg het verdunde bloed vervolgens op een laag van 15 milliliter FICO HIA lymfocyten-scheidingsmedium en centrifugeer het bloed daarna 30 minuten lang op kamertemperatuur bij 225 ×g zonder rem om een gradiënt te vormen.

Verwijder vervolgens de buffy coat en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Vul het volume aan tot 50 milliliter met PBS en pellet vervolgens de cellen bij 600 ×g gedurende 10 minuten. Giet het supernatant af, resuspendeer de pellet in 50 milliliter PBS en was de cellen daarna nog twee keer onder dezelfde condities.

Resuspendeer de cellen nu in één milliliter compleet RPMI. Ik gebruik vijf microliter cellen om een verdunning van 1:10 in trypanblauw te maken en om de levende cellen te tellen met behulp van een hemocytometer; gebruik vervolgens compleet RPMI om het volume aan te passen tot een celconcentratie van 2 x 10⁶ cellen per milliliter en breng de cellen over naar een weefkweekfles van 25 cm².

Om de cellen voor te bereiden op infectie met het Epstein-Barr-virus, voeg FK 506 toe aan de weefkweekfles tot een eindconcentratie van 20 µM. Plaats de fles vervolgens gedurende één uur in een incubator met 5% kooldioxide bij 37 °C. Wanneer de incubatie van de cellen bijna is voltooid, ontdooi snel een aliquot van het Epstein-Barr-virus, geoogst uit B 95 8-cellen. Verwijder vervolgens de fles uit de incubator en voeg het Epstein-Barr-virus toe aan de cellen in een verdunning van 1:10. Schud de fles nu om het Epstein-Barr-virus goed te mengen en plaats de fles vervolgens rechtop in de incubator met de dop erop, maar iets losgelaten indien er een niet-geventileerde fles wordt gebruikt, voor twee tot drie weken voorafgaand aan de expansie van de cultuur voor cryopreservatie.

Een week na eps, infectie met het Epstein-Barrvirus, zijn clusters van cellen zichtbaar via lichtmicroscopie, zoals te zien is in deze representatieve afbeelding van vroege microscopische clusters. Naarmate de tijd verstrijkt, worden de microscopische clusters groter, waardoor klonten macroscopisch zichtbaar worden in de fles, zoals te zien is in deze afbeelding waar grotere clusters van LCL kunnen worden waargenomen bij het voeden van de cellen, waarbij het volume van het ondersteunende medium in de kweekfles op dag 12 wordt verdubbeld. Wanneer het kweekmedium geel wordt, doorgaans ongeveer eens per week, is het over het algemeen tijd om de cellen te voeden om de cellen uit te breiden en het volume van de kweek twee tot drie keer te vergroten.

Breid de cultuur gedurende de komende weken uit naar 70 tot 100 milliliters in een 75 centimeter vierkante kolf met behulp van compleet RPMI om cellen voor cryopreservatie te genereren; een succesvolle uitkomst wordt voorspeld door de aanwezigheid van CD 23, hoge CD 58 positieve cellen zoals te zien in deze scatterplot; ongeveer twee tot 3% van de levende cellen op dag drie tot vier na blootstelling aan eps Epstein-Barr virus hebben dit profiel; andere subpopulaties van CD 23 positieve, CD 23 negatieve, CD 58 positieve en CD 58 negatieve cellen die worden waargenomen na blootstelling aan eps. Epstein-Barr virus vertonen minimale proliferatie en niet-geïnfecteerde cellen of cellen geïnfecteerd met een niet-immortaliserende stam van ep. Epstein-Barr virus vertonen geen CD 23 high.

CD 58-positieve cellen. De cellen kunnen ook worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie. Zoals vermeld, zijn binnen een week na infectie met het Epstein-Barr-virus kleine groepjes cellen in de fles zichtbaar via lichtmicroscopie.

Naarmate de tijd verstrijkt en de cellen zich ontwikkelen tot LCL, worden de microscopische clusters groter, waardoor klonten macroscopisch zichtbaar worden in de kolf. Goed. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u perifere mononucleaire bloedcellen uit menselijk bloed isoleert en hoe u Epstein-Barr virus-getransformeerde lymfoblastencellijnen genereert uit menselijke B-cellen, hoewel de generatie van lymfoblastencellijnen ook is beschreven door andere laboratoria.

Het voordeel van ons protocol is dat het onderzoekers een methode biedt om een succesvolle uitkomst al drie tot vier dagen na infectie van B-cellen met het Epstein-Barr-virus te voorspellen.