Name: Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Leer hoe je verrijkte oligodendrocytprecursorcellen afleidt uit neonatale muizenhersenen en myelinerende co-culturen opzet met dorsale wortelganglionneuronen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar myelinisatie en demyeliniserende ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada naar RKRWO is een ontvanger van een studententijd van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada. SDR is een ontvanger van Post-Doctoral beurzen van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada en de Canadese Institutes of Health Research.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit rapport beschrijft een methode voor het isoleren van muizen-OPC&#39;s voor differentiatie in de OL-verrijkte culturen of OL / DRGN co-culturen. Wanneer alleen gekweekt, de OPCs differentiëren tot MBP + ve OLS, het produceren van myeline-achtige membraneuze vellen. Wanneer toegevoegd aan neurieten bedden DRGN, OLS omhullen de DRGN neurieten met MBP + ve membraan. Dit biedt voordelen voor de onderzoek naar de complexe onderbouwing voor OL-gemedieerde axonale ensheathment. Terwijl van grote waarde, de oprichting van dergelijke culturen is technisch gezien een uitdaging. In het bijzonder veeleisende aspecten omvatten een efficiënte spijsvertering weefsel / dissociatie, het onderhoud van een evenwichtige cultuur media pH en DRGN media veranderingen. Het is belangrijk om te oordelen dat de lengte van de spijsvertering, de hoeveelheid weefsel worden verteerd en de hoeveelheid van fijnwrijving invloed op de effectiviteit en eindresultaat van het weefsel dissociatie. Het is niet ongebruikelijk voor ervaren onderzoekers om een ​​lage cellulaire rendement te verkrijgen uit gedissocieerd zenuwstelsel weefsels. Daarnaast, muizen OPC&#39;s zijn vaak gevoelig voor veranderingen in de pH van de cultuur media, met name onder alkalische omstandigheden. Het onderhoud van culturen op 8,5% CO 2 heeft tot doel dit te voorkomen, omdat OPC&#39;s lijken beter te licht zure omstandigheden tolereren meer dan basic. Met betrekking tot het voeden DRGNs-, media-aanpassingen moeten snel worden uitgevoerd als om niet de neuronen uitdrogen, moet echter worden voorzichtig om niet de zich ontwikkelende neurieten bed verstoren. Abrupte media veranderingen kunnen verjagen de neurieten bed van het substraat, en waarschijnlijk resulteren in de volledige dissociatie van het dekglaasje. De potentiële verdienste van dit model systeem overschaduwt sterk zijn technisch veeleisend karakter. Een voordeel van dit systeem is het gebruik van postnatale muizen voor celkweek afleiding, omzeilen de noodzaak om de voedsters te offeren aan embryonaal weefsel oogst. Een ander voordeel is het ontbreken van een vereiste voor de groei factoren (SBO) voor de uitbreiding van OPCs. Gemengde gliale culturen zorgen voor een omgeving die de verspreiding van OPCs, waarschijnlijk door de aanwezigheid van astrocyte afgeleide trofische factoren ondersteunt. Andere methoden, zoals afleiding via neurospheres 7,8, vertrouwen op de mitogene eigenschappen van GFS, zoals basic fibroblast groeifactor (bFGF), epidermale groeifactor (EGF) en platelet-derived growth factor (PDGF) voor OPC expansie. Op dezelfde manier, met behulp van postnatale (P5-10) muizen voor DRGNs vermijdt de eis van aanvulling van de cultuur media met een zenuw groeifactor (NGF), een neurotrofe factor die nodig is voor de in vitro embryonale overleving van DRGNs 9, 10. Het is van belang om te voorkomen dat met behulp van NGF als het negatief van invloed op de capaciteit van myelinating OLS bij gekweekt met DRGNs 4. Vermijden van het gebruik van de GF-aangevuld met de media ook economische voordelen heeft, omdat deze reagentia worden kostbaar bij gebruik op grote schaal. Misschien wel het belangrijkste voordeel van deze cultuur model is de afleiding van de muis alleen weefsels, en zo de kansen af ​​te leiden zowel de OPC&#39;s en DRGNs uit de grote verscheidenheid van transgene muis lijnen. Dit maakt voor de studie van zowel DRGN en / of OPC-specifieke eigenschappen die myelinisatie regeren. Dit zal vooral van belang voor het ophelderen van de receptor / ligand-interacties reguleren van OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Met al deze techniek is van grote waarde met betrekking tot neurowetenschappelijk onderzoek als gevolg van de applicaties naar het begrijpen van de moleculaire signalen die ten grondslag liggen myelinisatie.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Product Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Productnummer </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319 tot 005-CL </td></tr><tr><td> Balanced Salt Hank&#39;s Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Human merosine gezuiverde eiwit (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Recombinant rat ciliaire neurotrofe factor (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-thyroxine </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 supplement </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Runderen insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Natrium Seleniet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluor-2&#39;-deoxyuridine (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papaïne oplossing </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cysteïne </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-well kultuur gerechten </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25-weefselkweek flessen met ontluchting dop </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm weefselkweek gerechten </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm petrischaal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 um filter (optioneel) </td><td> Partec </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Myeline Basic Protein (MBP) antilichaam </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 antilichaam </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Myeline-Associated glycoproteïne (MAG) antilichaam </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cyclische nucleotide 3&#39;-fosfodiësterase (CNP) antilichaam </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actine pan Ab-5 antilichaam </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament-200 (NF) antilichaam </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubuline beta-3-keten (Tuj1) antilichaam </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (H + L) secundair antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 geit anti-muis IgG (H + L) secundair antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 geiten-anti-rat (IgG) (H + L) secundair antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Geit anti-muis IgG (H + L)-HRP geconjugeerd secundair antilichaam </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Geit-anti-rat IgG (H + L)-HRP geconjugeerd secundair antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Media Recepten 100X OL-Supplement * <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Bedrag toe te voegen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Natrium Seleniet </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Bewaren bij -80 ° C in 250 ui aliquots t &quot;&gt; OL media <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Bedrag toe te voegen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> 100X OL-Supplement </td><td> 250 ui </td></tr><tr><td> Runderen insuline (van 1 mg / ml voorraad) </td><td> 125 uL </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 ui </td></tr><tr><td> Holo-transferrine (van 33 mg / ml voorraad) </td><td> 37,5 uL </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> 500 pL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 uL </td></tr><tr><td> CNTF (van 50 ng / ul voorraad) </td><td> 25 il </td></tr></tbody></table> Gemengde gliale cultuur media (gemaakt in DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% uit voorraad) </td><td> 33 eenheden / ml penicilline en 33 ug / ml streptomycine </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN media (gemaakt in DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% uit voorraad) </td><td> 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine </td></tr></tbody></table> Spijsvertering Oplossing Recepten: OPC papaïne oplossing (opgemaakt in MEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> Papaïne oplossing </td><td> 1,54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-cysteïne </td><td> 360 ug / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 ng / mL </td></tr></tbody></table> DRG papaïne oplossing (opgemaakt in HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> Papaïne </td><td> 1,54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-cysteïne </td><td> 360 ug / ml </td></tr></tbody></table> DRG Collagenase Een oplossing (opgemaakt in HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> 4 mg / ml </td></tr></tbody></table>

afleiding van verrijkt oligodendrocyt culturen en oligodendrocyt / neuron myelinating co-culturen van post-natale murine tissues

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Het identificeren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen OL ontwikkeling is niet alleen van cruciaal belang voor het bevorderen van onze kennis van OL biologie, maar heeft ook implicaties voor het begrijpen van de pathogenese van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose (MS). Ontwikkeling van de cellen wordt vaak bestudeerd met primaire celcultuur modellen. Primaire celcultuur vergemakkelijkt de evaluatie van een bepaald celtype door middel van een gecontroleerde omgeving, vrij van de externe variabelen die aanwezig zijn in vivo. Terwijl de OL culturen afkomstig van ratten hebben een grote hoeveelheid inzicht in de OL biologie, heeft vergelijkbare pogingen tot oprichting van OL culturen van muizen is voldaan met grote obstakels. Ontwikkelen van methoden om de cultuur van muizen primaire OLS is noodzakelijk om te profiteren van de beschikbare transgene muis lijnen. Meerdere methoden voor de extractie van OPC&#39;s van knaagdieren weefsel zijn beschreven, variërend van neurosphere afleiding, differentiële hechting zuivering en immunopurification 1-3. Hoewel veel methoden bieden succes, de meeste vereisen uitgebreide cultuur tijden en / of dure apparatuur / reagentia. Om dit te omzeilen, is zuiverend OPC&#39;s van muizen-weefsel met een aanpassing van de methode die oorspronkelijk beschreven door McCarthy &amp; de Vellis 2 de voorkeur. Deze methode houdt in het fysiek scheiden van OPC&#39;s uit een gemengde cultuur gliale afgeleid van neonatale knaagdieren cortex. Het resultaat is een gezuiverd OPC bevolking die kan worden onderscheiden in een OL-verrijkte cultuur. Deze aanpak is te wijten aan de relatief korte tijd de cultuur en de onnodige vereiste voor groeifactoren of immunopanning antilichamen aantrekkelijk. Tijdens het verkennen van de mechanismen van OL ontwikkeling in een gezuiverde cultuur is informatief, is het niet de meest fysiologisch relevante omgeving voor de beoordeling van myelineschede formatie. Co-kweken OLS met neuronen zou geven inzicht in de moleculaire onderbouwing reguleren OL-gemedieerde myelinisatie van axonen. Voor veel OL / neuron co-cultuur studies, hebben dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs) bewezen dat het neuron soort keuze. Ze zijn ideaal voor co-cultuur met OLS vanwege hun gemak van de winning, minimale hoeveelheid van vervuilende cellen en de vorming van dichte neurieten bedden. Terwijl studies met rat / muis myelinating xenocultures zijn gepubliceerd 4-6, een methode voor de afleiding van dergelijke OL / DRGN myelinating co-culturen van de post-natale murine weefsel is niet beschreven. Hier presenteren wij gedetailleerde methoden over hoe je effectief te produceren dergelijke culturen, samen met voorbeelden van de verwachte resultaten. Deze methoden zijn nuttig voor de aanpak van vraagstukken met betrekking tot OL ontwikkeling / myelinating functie en zijn nuttige instrumenten op het gebied van de neurowetenschappen.

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC&#39;s) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC&#39;s op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Hoi, ik ben Ryan O'Mara, promovendus aan de University of Ottawa en het Ottawa Hospital Research Institute. In dit protocol worden de methoden beschreven om verrijkte populaties van oligodendrocyt-precursorcellen uit muizen te produceren, die afzonderlijk of in combinatie met neuronen uit het dorsale wortelganglion van muizen kunnen worden gedifferentieerd om myeliniserende cocultures te verkrijgen. Laten we beginnen met een kort overzicht van de procedure.Neonatale muizencortices worden gedissocieerd en geplaatst in T 25-flasks. Na een cultuurperiode van negen dagen vormt zich een astrocytmonolaag op de bodem van de flask, waarop oligodendrocyt-precursorcellen prolifereren. Oligodendrocyt-precursorcellen worden vervolgens verkregen en gezuiverd, waarna ze in een verrijkte cultuur kunnen worden gedifferentieerd tot mature oligodendrocyten.Indien myeliniserende cocultures gewenst zijn, worden wortelganglionneuronen van muizen van P5 tot P10 samen met de gemengde gliale culturen gekweekt. Over een periode van negen dagen vormen deze neuronen een dicht neurietenbed waarop oligodendrocyten-precursorcellen kunnen worden gezaaid.Dit maakt omwikkeling van de neurieten door oligodendrocyten mogelijk, wat resulteert in een myeliniserende koude kweek. Eerst worden complete hersenen van muizen van P nul tot P twee geplaatst in ijskoud MEM en overgebracht naar een dissectiemicroscoop; met een scalpel wordt er longitudinaal door de meningeale laag van elke cortex gesneden. Pel vervolgens de meninges van de onderliggende cortex af. Verwijder daarna de olfactory bulbs terwijl de ventrale zijde van de hersenen naar boven is gericht.Maak diepe longitudinale incisies op de plek waar de cortices de ventrale cephalon raken. Met de dorsale zijde van de hersenen naar boven worden de cortices losgepeld, waarna elke cortex in ongeveer vier stukken wordt gesneden. Breng de cortices over naar een conische buis van 15 milliliter die 350 µL ijskoud MEM per brein bevat.Hersenen van hetzelfde genotype worden in dezelfde buis samengebracht, zodat vier hersenen 1400 µL MEM vereisen. Zodra de dissectie is voltooid, worden de samengebrachte hersenen gedurende drie minuten in een waterbad van 37 °C geplaatst. Vervolgens worden de hersenfragmenten in een steriele weefselkweekkap door een P 1000 pipetpunt geleid om ze in kleinere stukjes te breken.Voeg 75 µL voorverwarmde OPC Papain per brein toe aan de conische buis. Incubeer vervolgens 20 minuten in een waterbad van 37 °C. Keer de buis elke twee minuten om om weefselaggregatie te voorkomen.Zodra de incubatie is voltooid, voegt u twee milliliter gemengde gliale cultuurmedium per brein toe aan het digestaat en laat u dit 10 minuten staan. Na 10 minuten verdeelt u de weefselsuspensie in plastic buisjes van vijf milliliter.Het aantal buisjes moet overeenkomen met het aantal hersenen in de preparatie. Gebruik een vlamgepolijste glazen Pasteurpipet om de inhoud van elk buisje te tritureren; begin langzaam en verhoog vervolgens de intensiteit zodra de stukjes weefsel beginnen te dissociëren. Stop met tritureren zodra er geen zichtbare weefselbrokken meer in de suspensie aanwezig zijn. Voeg de inhoud van elk buisje samen in een conische buis van 50 milliliter die vier milliliter gemengde gliale cultuur bevat.Medium per brein. Na het voorzichtig enkele keren omkeren van de buis, wordt de cel-suspensie verdeeld over 15 milliliter conische buizen. Het aantal buizen moet overeenkomen met het aantal breinen in de preparatie. Centrifugeer de buizen bij 300 ×g gedurende vijf minuten en resuspendeer de pellets in één milliliter gemengd glia-kweekmedium. Voeg de geresuspendeerde cellen uit elke conische buis toe aan poly-L-lysine gecoate T 25-flessen die vooraf zijn geëquilibreerd met vijf milliliter gemengd glia-kweekmedium.Het aantal kolven moet gelijk zijn aan het aantal gedissekeerde hersenen. Incubeer de kolven in een incubator op 37 °C bij 8,5% CO2. Na drie tot vier uur moeten de cellen aan het substraat zijn gehecht. Er zal echter veel debris in het medium aanwezig blijven, wat de levensvatbaarheid van de cellen nadelig kan beïnvloeden.Om dit te voorkomen, vervangt u het medium na drie tot vier uur, indien mogelijk, door vers gemengd gliaal cultuurmedium. Deze mediumwissel verwijdert een groot deel van het celresidu. De volgende dag.Er zouden veel cellen zichtbaar moeten zijn op de bodem van de kolf. Op de derde dag zou er een astrocytenmonolaag moeten ontstaan op de bodem van de kolf. Voer op dit punt een tweederde mediumverversing uit door vier milliliter medium te verwijderen en vier milliliter vers medium toe te voegen.Deze stap moet elke drie dagen worden herhaald. Op de zesde dag moet een astrocytenmonolaag duidelijk zichtbaar zijn, waarop oligodendrocyte-precursorcellen prolifereren. Voeg op dit moment insuline toe aan het kweekmedium tot een eindconcentratie van vijf µg/mL. Op de negende dag zijn de oligodendrocyte-precursorcellen klaar om van de astrocytenmonolaag te worden gescheiden.Plaats hiervoor de kolven op een orbitale schudder en in een 5%CO2-incubator. Laat de kolven gedurende één uur acclimatiseren aan de incubator. Schud de cellen vervolgens 45 minuten lang bij 50 RPM.Deze stap verwijdert veel losjes aanhechtende contaminerende cellen. Voer een volledige mediumverversing uit door al het medium te verwijderen en vier milliliter vers kweekmedium toe te voegen. Plaats de fles terug in een 5%CO2 incubator en laat deze drie uur lang equilibreren.Controleer na drie uur de kleur van het cultuurmedium. Het cultuurmedium moet rood zijn, wat duidt op een gebalanceerde pH. Als de kleur neigt naar oranje of paars, pas dan het CO2-niveau van de incubator dienovereenkomstig aan.Het behoud van een gebalanceerde pH is belangrijk voor de overleving van de oligodendrocyten-precursorcellen tijdens het schudden gedurende de nacht. Zodra een gebalanceerde pH is bereikt, schudt u de kolf gedurende ongeveer 16 uur bij 220 RPM. Verwijder de volgende ochtend de kolf uit de schudmachine en breng het medium van de kolven over naar weefselkweekschalen van 10 centimeter.Deze schalen dienen om de oligodendrocyte-precursorcellen verder te zuiveren via differentiële adhesie. Elke schaal moet medium van twee flessen ontvangen; incubeer de schalen gedurende 30 minuten bij 5%CO2. Geef elke schaal na 15 minuten een voorzichtig tikje om te voorkomen dat de oligodendrocyte-precursorcellen aan het plastic hechten.Examineer de schalen na de incubatie van 30 minuten onder fasecontrast. Oligodendrocyten-precursorcellen zijn zichtbaar als kleine clusters cellen. Sommige van deze cellen kunnen aan de schaal zijn gehecht.Maak de aangehechte oligodendrocyten-precursorcellen los van de schaal door voorzichtig te schudden. Wees voorzichtig. Te veel agitatie kan ertoe leiden dat contaminerende celtypen loslaten.Breng de cel-suspensie over naar een conisch buisje van 15 Milliliter en centrifugeer dit gedurende vijf minuten bij 300 Times gravity. Resuspendeer het pellet voorzichtig met een P 1000 pipetpunt. Tel vervolgens met een P 200 pipetpunt de cellen met een hemocytometer; de gezuiverde oligodendrocyten kunnen vervolgens op laminaat-gecoate dekglasjes worden geplaatst voor differentiatie tot verrijkte oligodendrocytenculturen op dag één.Na het uitplaten hebben de verrijkte oligodendrocyt-precursorcellen een relatief eenvoudige morfologie met slechts enkele uitlopers. Tegen dag drie hebben de differentiërende oligodendrocyten talrijke uitlopers gevormd die doen denken aan onrijpe oligodendrocyten. Tegen dag zes hebben de oligodendrocyten op enig moment gedurende deze periode myeline-achtige membraanvliezen gevormd.Dekglasjes kunnen worden gefixeerd en verwerkt voor immunocytochemie. In plaats van de gezuiverde oligodendrocyte-precursorcellen uit te zaaien op met laminine gecoate dekglasjes, kunnen ze worden uitgezaaid op neurite-bedden van dorsale wortelganglia om myeliniserende coculturen te produceren. De volgende sectie beschrijft de methoden om deze culturen te produceren.Begin met het isoleren van de volledige ruggenmergen van P5- tot P10-muizen en breng deze met dissectiescharen over naar een dissectiemicroscoop. Snijd in longitudinale richting door de ventromediale regio van de wervelkolom. Verwijder voorzichtig de dorsale wortelganglia of DRG's met fijngetippeden pincetten.Breng de ganglia over naar een Petrischaal met Hank's gebufferde zoutoplossing. Trim eventuele DRG's waarbij de wortels overmatig lang zijn. Gebruik hiervoor een P 1000 pipetteertip met een wijde opening.Kloog de ganglia over naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Bewaar de buis op ijs totdat alle muizen zijn verwerkt. Wanneer de isolatie van de DRG is voltooid, centregeer de buis bij ongeveer 300 ×g.Plaats de buis in een steriele kweekkap en verwijder het supernatant. Voeg 500 µL voorverwarmde DRG papaine toe aan de buis en incubeer deze 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Wanneer de papaine-digestie voltooid is, centrifugeert u de buis en vervangt u vervolgens de papaine-oplossing.Incubeer 500 µL van een voorverwarmde collagenase A-oplossing gedurende 10 minuten bij 37 °C. Herhaal de centrifugatiestap en vervang de collagenase A-oplossing door 1 mL DRGN-kweekmedium. Voeg na de laatste centrifugatiestap 1 mL DRGN-medium toe en gebruik een vlamgepolijste glazen Pasteurpipet.Maak de ganglia eerst langzaam kapot, en daarna met toenemende intensiteit zodra het weefsel begint te dissociëren. Wanneer er geen weefselklontjes meer zichtbaar zijn, overbrengt u de celsuspensie naar een Petrischaal met zeven milliliter DRGN-medium. Incubeer de schaal in een incubator van 37 °C bij 8,5% CO2 gedurende anderhalf uur.Observe na deze incubatie de Petrischaal. Onder fasecontrast zijn DRG-neuronen zichtbaar als cellen met een groot cellichaam. Veel contaminerende cellen zouden stevig aan de Petrischaal gehecht moeten zijn.Overbreng het medium naar een conische buis van 15 milliliter en spoel de kweekschaal met vier milliliter DRGN-medium om alle resterende neuronen te verzamelen. Centrifugeer de conische buis bij 300 ×g gedurende vijf minuten. Resuspendeer het resulterende pellet in 500 µL DRGN-medium.Tel de cellen met een HEO-cytometer. Zorg ervoor dat alleen de DRG-neuronen worden geteld; zaai 30 tot 50.000 neuronen per laminaat-gecoate dekglasplaat van 12 millimeter in één milliliter DRGN-mediumcultuur. Plaats de cellen in een weefselkweekincubator met 8,5% CO2.Voer de volgende ochtend een volledige mediumverversing uit door het DRGN-medium te vervangen door ol-medium aangevuld met 10 micromolar FUD R om de tweede dag. Voer daarna een mediumverversing van drie kwart uit met FUD r-aangevuld OL-medium. Wanneer de neuronen op dag één onder de fasecontrastmicroscoop worden bekeken, zijn ze begonnen met het uitsteken van enkele processen. Op dag drie zijn de neuronale processen langer geworden.Op dag zes is er een neurietbed ontwikkeld dat bestaat uit veel onderling vermengde uitlopers. Op dag negen is de dichtheid van dit neurietbed toegenomen en is het klaar voor de ontvangst van oligodendrocyten door middel van het kweken van gemengde hersenculturen. Gelijktijdig met de neuronenculturen kunnen oligodendrocyte-precursorecellen worden gezuiverd op dag negen van de neuronenculturen.Deze kunnen vervolgens op de neurietbedden worden geplaatst door 50.000 cellen aan elke put van een 24-well plaat toe te voegen. Op dag zes van de co-cultuur kunnen cellen die doen denken aan oligodendrocyten worden waargenomen die interageren met de DRG-neuronen.Deze culturen kunnen nu worden gefixeerd en verwerkt voor immunocytochemie. Wanneer verrijkte oligodendrocyten culturen worden gelabeld met antilichamen tegen de oligodendrocytenmarkers NG2, MAG en MVP, worden immunologisch positieve cellen aangetoond die stadiumspecifieke morfologieën vertonen. Deze culturen beginnen als een populatie NG2-positieve oligodendrocytenprecursoren en produceren gedurende de zes dagen van differentiatie MAG-positieve volwassen oligodendrocyten.Wanneer SDS-PAGE wordt uitgevoerd op lysaten verkregen uit oligodendrocyte-verrijkte culturen, is te zien dat oligodendrocyten CNPP en MVP tot expressie brengen gedurende het tijdverloop van zes dagen. Wanneer men kijkt naar DRG-neuronen voorafgaand aan de toevoeging van oligodendrocyten, zijn er op dag negen dichte Taj-1 en neurofilament-positieve neurite-bedden zichtbaar. Op dag zes van de oligodendrocyte-DRG-neuron co-cultuur kunnen bij een hogere vergroting veel MBP-positieve oligodendrocyten worden gezien die interageren met de neuronale neurieten.Er is te zien dat oligodendrocyten deze neurieten omwikkelen met een MBP-positief membraan dat doet denken aan myelinisatie; een digitaal vergroot beeld toont de mate van overlap van het MVP-positieve membraan op het neurofilament-positieve uitstulpsel. Hallo, ik ben Scott Ryan, postdoctoraal onderzoeker bij het Ottawa Hospital Research Institute. Deze technieken bieden een methode om co-cultuursystemen van microglia, endocyten en DRG-neuronen van muizen te genereren.Deze techniek is waardevol bij het bestuderen van zowel experimenteel geïnduceerde als transgene modellen van myelinatische ziekten. Het is daarnaast effectief voor het screenen van nieuwe therapeutische verbindingen.

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen...

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

This video demonstrates the process of generating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from human embryonic stem cells, followed by the maturation of OPCs to oligodendrocytes. This process of generating oligodendrocytes opens numerous avenues to improve research and treatment of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Oligodendrocytes

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

The video demonstrates a protocol for differentiating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) into oligodendrocytes and inducing myelination in a co-culture with dorsal root ganglion (DRG) neurons. The OPCs are transduced with lentiviral vectors encoding a signaling protein that regulates myelination. The transduced OPCs are co-cultured with DRG neurons to assess the differentiation into oligodendrocytes and the signaling protein-induced myelination.

An In Vitro Transduction-Induced Myelination Assay for Oligodendrocyte Precursor Cells

Oligodendrocyten zijn de myeliniserende cellen van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en kweken van hun precursoren, oligodendrocyten-voorlopercellen, uit rattencortex, evenals een snelle en betrouwbare kwantitatieve methode om oligodendrogenese in vitro te evalueren als reactie op experimentele factoren.

Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.

High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen

Leer hoe je verrijkte oligodendrocytprecursorcellen afleidt uit neonatale muizenhersenen en myelinerende co-culturen opzet met dorsale wortelganglionneuronen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar myelinisatie en demyeliniserende ziekten.

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues (Video) | JoVE Journal

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Meer video's verkennen