Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de proteasoomactiviteit in levende cellen met behulp van een GFP Deron-fusie-eiwit. Kloon eerst de aangepaste oligonucleotiden voor Deron en Deron frameshift. Voeg deze in de P-E-G-F-P-C one-vector in en volg vervolgens de protocollen voor het gateway-systeem van Vitrogen; produceer daarna virussen voor elk construct met behulp van HEK 2 93 FT-cellen. Bepaal de titer, transduceer de cellen met het virus en pas antibiotische selectie toe, om vervolgens de resulterende stabiele GFP DRON- of GFP Dron frameshift-expresserende cellen uit te breiden.

Deze techniek faciliteert experimenten waarbij celresponsen op specifieke behandelingen worden gemonitord via fluorescentiesignaalmetingen. Zo kan proteasoomactiviteit eenvoudig worden beoordeeld met behulp van epifluorescentie of flowcytometrie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals luminogene of fluorogene assays met behulp van hele cellen, is dat de proteasoomactiviteit in levende cellen wordt gemeten. Verdun voor de transfectie 36 µL Lipofectamine 2000-reagens in 1,5 mL DMEM; verdun in een andere 15 mL Falcon-buis de DNA-constructen in 1,5 mL DMEM.

Combineer de twee na vijf minuten en incubeer deze 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervang nu het medium van een confluente cultuur van HEK 2 93 FT-cellen in een T 75-fles door zeven milliliter DMEM. Voeg vervolgens het DNA-lipo-mengsel toe aan de fles en meng door deze voorzichtig heen en weer te bewegen.

Incubeer de kolf gedurende de nacht bij 37 °C in een incubator met 5% CO2. Vervang de volgende dag het medium door 10 mL DMEM. Oogst na 48 uur het supernatant. Filtreer het virushoudende supernatant door een 0,45 µm PVDF-filter.

Om het virus te concentreren, wordt één volume PEG-oplossing toegevoegd aan vier volumes supernatant, waarna het twee uur wordt geïncubeerd bij vier graden Celsius met periodiek mengen door inversie. Oogst het virus door centrifugatie. Na het aspireren van de supernatant van de witte pellet wordt er opnieuw gecentrifugeerd om eventuele resterende PEG-oplossing te verwijderen. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in PBS met een pipet en vortex vervolgens krachtig gedurende 20 tot 30 seconden.

Bewaar aliquots van 100 µL virus bij -80 °C. Zaai U2 OS-cellen uit in platen met zes putjes en incubeer deze overnight. Vervang voor transfectie het kweekmedium door 1 mL DMEM dat 8 µg/mL polybrene bevat. Zet één putje apart als positieve controle en test een reeks virale concentraties in de overige putjes.

Incubeer de volgende dag gedurende de nacht. Vervang het medium door twee milliliter DMEM en incubeer gedurende 24 uur. Begin de selectie met 10 micrograms per milliliter blasticine en vervang het antibioticumhoudende medium vervolgens om de tweede dag.

Verifieer na ongeveer zes tot zeven dagen de celdood van de niet-getransduceerde cellen. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS om de cellen te kleuren. Bedek met kristalviolet en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur, aspireer daarna de kleurstof, spoel de wells twee keer met dubbel gedestilleerd water en laat de plaat aan de lucht drogen.

Tel tot slot de kolonies om de transfectie-eenheden van het virus per milliliter te berekenen. Menselijke diploïde fibroblasten op platen met zes putjes met acht microgram per milliliter Polybrene als transductie-enhancer.

Gebruik een multiplicity of infection van twee in een totaalvolume van 1 mL. Vervang het medium. De volgende dag, wanneer de cultuur voor 70 tot 80% confluent is.

Begin de chronische selectie met 10 micrograms per milliliter. Monitor gedurende de volgende dagen de volledige celdood, wat aangeeft dat de selectie is voltooid. Breid de stabiel getransduceerde cellen uit om een stabiele cellijn te genereren die GFP DERON of GFP Deron Frameshift fusie-eiwitten tot expressie brengt. Begin met het uitplaten van cellen die GFP DRON of GFP DRON frameshift dragen, de volgende dag, drie uur vóór de facts.

Behandel controlecellen met een proteasoeminhibitor. Was twee keer met PBS en oogst de cellen met 0,5 milliliters trypsine. Om de trypsine te stoppen.

Gebruik 4,5 milliliters kweekmedium en overbreng de cellen naar een 15 milliliter Falcon. Oogst de cellen door middel van centrifugatie. Na één keer wassen met PBS wordt het pellet改めて opgelost in 400 microliter fax-buffer. Overbreng de cellen naar fax-buisjes en plaats deze op ijs.

Meet nu de monsters via flowcytometrie. Het GFP Deron-fusie-eiwit bevat een sequentie die gericht is op het proteasoom voor onmiddellijke degradatie. In tegenstelling hiermee wordt de frameshift-mutant GFP Deron FS niet door proteasomen afgebroken.

Wanneer ze worden getransduceerd met GFP Deron, vertonen jonge menselijke gedeployeerde fibroblasten met de verwachte hoge proteasomale activiteit een zwak fluorescent signaal onder epi-fluorescentie. Dezelfde cellen die zijn getransduceerd met GFP Deron Frameshift vertonen 39,7% positieve cellen. Behandeling van de cellen met proteasoomremmer ll en L resulteert in verhoogde signalen tot een maximum van ongeveer 63% in zowel GFP dron- als GFP Dron frameshift-cellen.

Vergelijkbare metingen in dermale fibroblasten, geïsoleerd van jonge, middelbare en oudere donoren, onthullen een duidelijke toename van het GFP-signaal tussen jonge individuen en donoren van middelbare leeftijd, wat wijst op een afname van de proteasoomactiviteit in monsters verkregen van oudere donoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u lentivirale particles produceert, cellen transfecteert en de proteasoomactiviteit in levende cellen bepaalt.