De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans
15 november 2011
Laser axotomie gevolgd door time-lapse beeldvorming is een gevoelige manier om de effecten van mutaties in C. elegans op axonregeneratie te onderzoeken. Een hoogwaardig, maar goedkoop, laserablatiesysteem kan gemakkelijk aan de meeste microscopen worden toegevoegd. Time-lapse beeldvorming gedurende 15 uur vereist zorgvuldige immobilisatie van de worm.
Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe een laser ablatiesysteem kan worden geassembleerd en uitgelijnd voor het bestuderen van axon regeneratie in CL gans. Dit wordt bereikt door eerst een laserklier Thompson polarisator halfgolfplaat draaispiegel, periscopenrail en railspiegel op een breadboard te monteren. De volgende stap van de procedure is om de laserstraal uit te lijnen met de uitgaande straal van de microscoop condensorlens.
Vervolgens wordt de laserstraaluitbreiderlens gemonteerd, uitgelijnd en gepositioneerd om de laserstraal te centreren en hem nul-divergent te maken. De laatste stap van de procedure is om de laser ablatiespot congruent te maken met de beeldfocus door fijne aanpassingen te maken. Uiteindelijk is het mogelijk om precies een halve micron axons te snijden met minimale zijdelingse weefselschade met behulp van de diffractie-beperkte laserstraal wanneer deze imperfecte XY NC-uitlijning heeft.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals Femto second lasers, is dat deze relatief goedkoop is voor 15.000. Het is relatief onderhoudsvrij en biedt zeer nauwkeurige axonsneden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regeneratie van axons in zee-elgan, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals vliegen, zebravismuis, perifeer zenuwstelsel en in vitro cellen.
Kortom, elke cel die zich binnen 30 tot 50 micrometer van het oppervlak bevindt. Begin met de componenten die op het breadboard zijn geplaatst en schroef de laser-periscooppilaar en verhoogde railsteunen vast. Dit systeem gebruikt een Klasse drie B-laser die gemakkelijk uw ogen kan beschadigen, dus neem de veiligheid van lasers serieus.
Praat met iemand in uw lokale natuurkundeafdeling over hoe u veilig met free beam lasers kunt werken. Zet altijd tijdens het uitlijningsproces de laser op het laagste vermogen. Wanneer u door de oculairen kijkt, zorg er dan voor dat de laser mechanisch gesloten is en dat de laser is uitgeschakeld.
Positioeer eerst de microscoop, lijn hem uit met de railas. Ten tweede, lijn hem uit met de getransmitteerde lichtstraal van de microscoop condensorlens. Ten derde, lijn beide uiteinden van de rail uit met de condensorstraal met behulp van een verstelbare diafragma of lens die aan de rail is bevestigd.
Gebruik een niveau en laboratoriumkwartels om de hoogte van de rail aan te passen voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de rail zijn uitgelijnd. Zorg er nu voor dat de laserstraal door de klier, Thompson-polarisator en halve plaat passeert en niet hun randen raakt tijdens het draaien.
De halve plaat zal het vermogen van de laser aanpassen met alle componenten bevestigd aan het breadboard. Schakel de laser in, stel de pulsfrequentie in op 100 continue modus en verlaag het vermogen tot een minimum met behulp van de halve plaat. Gebruik een post-it notitie of lenspapier om de laserstraal te visualiseren.
Nu om de laserstraal vanaf het breadboard omhoog te brengen. Pas en bevestig de kinematische gemonteerde spiegels in volgorde van de laser aan om de straal omhoog te brengen naar de spiegel die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. Wanneer u klaar bent, zou de laserstraal grofweg uitgelijnd moeten zijn met het centrum van de spiegels, en de spiegels zouden grofweg 45 graden ten opzichte van de laserstraal-as moeten zijn gericht voordat de laserstraal wordt uitgelijnd met de getransmitteerde lichtstraal van de microscoop.
Verwijder of open eventuele ND-filters en diafragma's in de tussenmodule. We beginnen nu met de meest cruciale stap om nauwkeurige snijdingen van axons te geven zonder overmatige zijdelingse schade. We gaan de laser precies uitlijnen in de x-, y- en Z-as bij het laagste laservermogen om de kleinste ablatiespot te geven.
De laser en de getransmitteerde lichtstralen kunnen tegelijkertijd tegen papier worden gezien. Plaats het papier in de buurt van de microscooppoort om te beginnen. Begin nu met het uitlijnen van de laser met behulp van de grove aanpassingen op de spiegel bovenop de periscoop en de spiegel aan het uiteinde van de rail.
Plaats een papier tussen de uitgelijnde condensorlens en de open objectieftoren. Ga door met het gebruik van de fijne aanpassingen op de railspiegel om de laserstraal uit te lijnen met het centrum van de grotere getransmitteerde lichtstraal. Bevestig nu het microscoop op zijn plaats met klemmen.
Aanvullende stappen voor het beoordelen van de uitlijning van de laser zijn te vinden in het geschreven manuscript. Dual galilean straalvergroters moeten worden geïnstalleerd om de 300 micron laserstraal 33 keer uit te breiden om de achterapertuur van de 10 millimeter objectief te vullen. Begin met het monteren van de vier lenzen op dragers.
Bevestig vervolgens de lenzen aan de rail zodat ze allemaal op dezelfde optische as staan en exact loodrecht op de laserstraal. Schakel de laser in en stel deze in op minimaal vermogen en continue modus. Pas de straaluitlijning grof aan door elke lens heen.
Gebruik papier om de straal te zien. Schakel nu de laser uit. Plaats een veiligheidssluiter op de laser en verwijder de microscoop uit het pad van de laserstraal.
Schakel de laser weer in en visualiseer deze tegen een nabijgelegen muur. Gebruik de fijne aanpassing van de lenzen om de straal uit te breiden. Pas vervolgens de laatste twee kinematische gemonteerde spiegels aan om de straal uit te lijnen in een cirkel van uniforme helderheid op de geschatte positie van de achterapertuur van het objectief.
Bekijk de grootte en uniformiteit van de straal tegen papier. Pas vervolgens de straal aan tot nul convergentie door op te merken hoe de straalgrootte verandert naarmate het papier verder van de lens wordt verplaatst. Schakel de laser uit en activeer de mechanische sluiter.
Schuif de microscoop terug in het pad van de laserstraal met behulp van de vaste klemmen om de juiste uitlijning te definiëren. Plaats de klemmen op de vrije kant van de microscoop, maar draai ze niet vast. Schakel nu de laser in.
Verwijder de veiligheidssluiter en draai de objectieftoren naar een open posit
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het assembleren en uitlijnen van een laserablatiesysteem om axonale regeneratie in C. elegans te bestuderen. De techniek maakt het mogelijk om axonen nauwkeurig door te snijden met minimale collaterale schade, waardoor het een waardevol instrument is voor onderzoekers in de neurowetenschappen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Celbiologie
Achtergrond
- Axonregeneratie is cruciaal voor het begrijpen van neurale herstelmechanismen.
- Traditionele methoden voor het doorsnijden van axonen kunnen aanzienlijke collaterale schade veroorzaken.
- Laserablatie biedt een nauwkeurig alternatief voor het bestuderen van regeneratie.
- C. elegans dient als modelorganisme voor het onderzoeken van deze processen.
Doel van de studie
- Om de assemblage en uitlijning van een laserablatiesysteem te demonstreren.
- Om een protocol te bieden voor het bestuderen van axonale regeneratie bij C. elegans.
- Om de voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande technieken te belichten.
Gebruikte methoden
- Assemblage van lasercomponenten op een optische tafel.
- Uitlijning van de laserstraal met het optische pad van de microscoop.
- Gebruik van een klasse 3B-laser voor precieze axonsnijding.
- Time-lapse imaging om axonregeneratie gedurende 15 uur te monitoren.
Belangrijkste resultaten
- Het laserablatiesysteem maakt het mogelijk om axonen door te snijden met minimale schade.
- Een nauwkeurige uitlijning is essentieel voor het bereiken van optimale resultaten.
- De methode kan worden aangepast voor gebruik in diverse modelorganismen.
- Time-lapse imaging legt het regeneratieproces effectief vast.
Conclusies
- Deze laserablatietechniek is een kosteneffectief instrument voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het biedt inzicht in de mechanismen van axonregeneratie.
- De aanpasbaarheid van de methode maakt deze geschikt voor een breed scala aan biologische systemen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Betaalbare laser-axotomiesystemen maken schaalbare, kwantitatieve analyse van axonale regeneratiemechanismen in transparante modelorganismen mogelijk. Deze aanpak ondersteunt vroege target-validatie en mechanistische risicoreductie voor neuroregeneratieportefeuilles door het bieden van precieze, reproduceerbare letselmodellen. De betaalbaarheid en aanpasbaarheid van het systeem vergemakkelijken een bredere adoptie door discovery-teams, wat hypothese-gestuurd onderzoek naar neuraal herstel versnelt.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt gecontroleerde axonale beschadiging mogelijk voor functionele validatie van regeneratiepaden.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering door collaterale weefseleffecten tijdens axotomie te minimaliseren.
- Faciliteert snelle hypothesetoetsing van genetische of farmacologische interventies bij neuraal herstel.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor het kwantificeren van fenotypes van axonale regeneratie.
- Zorgt voor ablatie met hoge precisie en minimale variabiliteit, wat robuuste screening-workflows ondersteunt.
- Maakt integratie van time-lapse imaging mogelijk, waardoor dynamische beoordeling van regeneratieve responsen mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Biedt een platform dat aanpasbaar is aan meerdere modelsystemen, waardoor translationele continuïteit wordt ondersteund.
- Maakt vergelijkende studies tussen soorten mogelijk voor de preklinische validatie van neuroregeneratieve targets.
- Ondersteunt de afstemming van fenotypische uitkomsten met ziekterelevante neurale letselmodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit laser-axotomiesysteem past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor iteratieve targetvalidatie en mechanistische studies mogelijk zijn voordat er tot leadidentificatie wordt overgegaan.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en het onderzoeken van signaalpaden bij neurale regeneratie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor axonale teruggroei onder verschillende experimentele condities.
- Analytics: Maakt nauwkeurige meting van regeneratieve resultaten en statistische vergelijking van interventies mogelijk.
- Translational Research: Faciliteert aanpassing aan diverse modelorganismen voor validatie tussen verschillende soorten.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulair, kosteneffectief platform voor herhaaldelijk gebruik in R&D-programma's binnen de neurobiologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitten voor neuraal herstel door het mogelijk maken van nauwkeurige, kwantitatieve letselmodellen.
- Operationele waarde: Vermindert technische en financiële barrières voor high-throughput axon-regeneratiestudies.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door de beoordeling van het regeneratieve fenotype te standaardiseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroregeneratieve activa via robuuste vroege validatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning en laserveiligheidsprotocollen.
- Vereist toegang tot basisinfrastructuur voor microscopie en breadboard-assemblage.
- Vraagt om strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare letsel- en beeldvormingscondities.
- Aanpasbaar aan verschillende transparante modelsystemen binnen 30–50 microns van het weefseloppervlak.
- De precisie is afhankelijk van nauwkeurige uitlijning en regelmatige kalibratie om collaterale schade te voorkomen.
