De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe een laserablatiesysteem moet worden geassembleerd en uitgelijnd voor het bestuderen van axonale regeneratie in CL gans. Dit wordt bereikt door eerst een laserklier Thompson-polarisator, halve golfplaat, draaispiegel, periscooprail en railspiegel op een breadboard te monteren. De volgende stap van de procedure is het uitlijnen van de laserstraal op de uitgaande straal van de condensorlens van de microscoop.

Vervolgens werd de lens van de laserstraaluitbreider gemonteerd, uitgelijnd en gepositioneerd om de laserstraal te centreren en deze divergentievrij te maken. De laatste stap van de procedure is om de laserablatiespot congruent te maken met de beeldfocus door middel van fijne afstellingen. Uiteindelijk is het mogelijk om met de diffractiegelimiteerde laserstraal axonen van een halve micron nauwkeurig door te snijden met minimale collaterale weefselschade, zelfs wanneer er sprake is van een imperfecte XY NC-uitlijning.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals femtoseconde-lasers, is dat deze met een prijs van 15.000 relatief goedkoop is. De methode is vrijwel onderhoudsvrij en maakt zeer nauwkeurig doorsnijden van axonen mogelijk. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de regeneratie van axonen bij C. elegans, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals vliegen, zebravissen, muizen, het perifere zenuwstelsel en in vitro cellen.

In principe elke cel die zich binnen 30 tot 50 µm van het oppervlak bevindt. Begin met de componenten op het breadboard en schroef de post voor de laserperiscoop en de verhoogde railsteunen vast. Dit systeem maakt gebruik van een laser van klasse 3B die uw ogen gemakkelijk kan beschadigen, dus neem de laserveiligheid serieus.

Overleg met iemand van uw lokale afdeling natuurkunde over hoe u veilig met vrije laserstralen kunt werken. Zet de laser tijdens het uitlijnproces altijd op het laagste vermogen. Wanneer u door de oculairs kijkt, moet u ervoor zorgen dat de laser mechanisch is afgeschermd en dat de laser is uitgeschakeld.

Positioneer nu eerst de microscoop en richt deze uit met de as van de rail. Richt de microscoop vervolgens uit met de doorgelaten lichtstraal van de condensorlens van de microscoop. Richt tot slot beide uiteinden van de rail uit met de condensorstraal met behulp van een instelbare diafragma of lens die aan de rail is bevestigd.

Gebruik een waterpas en labkrikken om de hoogte van de rail aan te passen voordat u verdergaat. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de rail zijn uitgelijnd. Controleer nu of de laserstraal door de gland, de Thompson-polarisator en de halve-golfplaat gaat en niet tegen de randen aan slaat bij het roteren.

De halve-lambda plaat wordt gebruikt om het vermogen van de laser aan te passen wanneer alle componenten op het optische breadboard zijn bevestigd. Zet de laser aan, stel de pulsfrequentie in op 100 continue modus en reduceer het vermogen tot een minimum met behulp van de halve-lambda plaat. Gebruik een post-it of lenspapier om de laserstraal zichtbaar te maken.

Breng nu de laserstraal vanaf het breadboard omhoog. Stel de kinematisch gemonteerde spiegels opeenvolgend af, beginnend bij de laser, om de straal naar de spiegel te leiden die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. Na voltooiing moet de laserstraal ongeveer in het midden van de spiegels zijn uitgelijnd en moeten de spiegels ongeveer 45 graden ten opzichte van de as van de laserstraal zijn georiënteerd, voordat de laserstraal wordt uitgelijnd met de doorgelaten lichtstraal van de microscoop.

Verwijder of open alle ND-filters en diafragma's in de tussenmodule. We beginnen nu met de meest kritische stap om axonen nauwkeurig door te snijden zonder overmatige collaterale schade. We gaan de laser nauwkeurig uitlijnen op de x-, y- en z-as bij het laagste laservermogen om de kleinste ablatiespot te verkrijgen.

De laser en de doorgelaten lichtbundels kunnen gelijktijdig tegen papier worden waargenomen. Plaats het papier bij de microscoopopening om te beginnen. Begin nu met het uitlijnen van de laser met behulp van de grove instellingen op de spiegel bovenop de periscoop en de spiegel aan het uiteinde van de rail.

Plaats een stuk papier tussen de uitgelijnde condensorlens en de openstaande objectiefrevolver. Gebruik vervolgens de fijne instellingen op de railspiegel om de laserstraal uit te lijnen met het centrum van de grotere doorgelaten lichtbundel. Zet de microscoop nu met klemmen vast.

Aanvullende stappen voor het beoordelen van de uitlijning van de laser zijn te vinden in het geschreven manuscript. Dubbele galileïsche straaluitbreiders moeten worden geïnstalleerd om de 300 micron laserstraal 33 keer uit te breiden, zodat de achteropening van het 10 millimeter objectief wordt gevuld. Begin met het monteren van de vier lenzen op dragers.

Bevestig vervolgens de lenzen aan de rail, zodanig dat ze zich allemaal op dezelfde optische as bevinden en exact orthogonaal staan op de laserstraal. Zet de laser aan en stel deze in op het minimale vermogen en op de continue modus. Stel de uitlijning van de straal door elke lens grofweg af.

Gebruik papier om de straal zichtbaar te maken. Zet nu de laser uit. Plaats een veiligheidssluiter op de laser en verwijder de microscoop uit het pad van de laserstraal.

Zet de laser weer aan en visualiseer de straal op een nabijgelegen muur. Gebruik de fijne instelling van de lenzen om de straal uit te breiden. Stel vervolgens de laatste twee kinematisch gemonteerde spiegels af om de straal uit te lijnen tot een cirkel met een uniforme helderheid op de geschatte positie van de achterste apertuur van het objectief.

Controleer de grootte en uniformiteit van de bundel op papier. Stel vervolgens de bundel in op nulconvergentie door te observeren hoe de bundelgrootte verandert wanneer het papier verder van de lens wordt bewogen. Schakel de laser uit en sluit het mechanische sluiter.

Schuif de microscoop terug in het pad van de laserstraal en gebruik de vaste klemmen om de juiste uitlijning te bepalen. Plaats de klemmen aan de vrije zijde van de microscoop, maar draai ze nog niet vast. Zet nu de laser aan.

Verwijder de veiligheidssluiter en draai het objectiefrevolver naar een open positie met behulp van papier op de tafel; een uitgebreide en uniforme laserstraal gecentreerd op de doorgelaten lichtstraal van de condensor moet nu zichtbaar zijn. Indien deze niet gecentreerd is, centreer de stralen dan door de microsceekklemmen te versoepelen en de microscoop voorzichtig te verschuiven. Sluit nu de veiligheidssluiter en stel de laser in op de trigger-modus.

Draai het 60x objectief op zijn plaats. Maak nu een afbeelding van de oppervlakkige krassen op een target-preparaat. Verwijder de veiligheidssluiter, activeer de ablatielaser en stel het laservermogen in voor de minimale ablatiespot.

De spot moet cirkelvormig zijn en zich binnen vijf tot 10 microns van het midden van het beeld bevinden, het centrum van de ablatiespot. Gebruik de fijne instellingen van de kinematisch gemonteerde railspiegel om de spot gecentreerd en het straalprofiel uniform te houden; het zal nodig zijn om de railspiegel en de bovenste periscoopspiegel iteratief af te stellen. Evalueer de Z-focus van de laser door de focus systematisch in stappen van één micron omhoog en omlaag te bewegen en bij elke stap de ablatielaser te activeren.

Als de straal correct is uitgebreid en uitgelijnd en de convergentie juist is ingesteld, dan moet de ablatie maximaal zijn in het beeldbrandpunt en zwak of helemaal niet één micron boven of onder het brandpunt. Als de maximale ablatieplek boven of onder het beeldbrandpunt ligt, moeten de laatste aanpassingen aan de Z-focus van de uitgebreide straal worden gedaan door lens L3 van de Galileïsche telescoop te verplaatsen totdat de laserablatie samenvalt met het beeldbrandpunt. Nematoden werden gemonteerd op een op maat gemaakt objectglas en axonen werden geablateerd met behulp van het geconstrueerde systeem Laser exo somy; time-lapse imaging van axonale regeneratie was zeer robuust.

Met behulp van een gemotoriseerde tafel was het mogelijk om routinematig en nauwkeurig vijf axonen in vijf verschillende dieren te snijden en te beelden op één enkele objectglas. De beeldvormingstijd voor de axonen was de beperkende factor.

Ongeveer 10% van de experimenten leverde time-lapsefilms van hoge kwaliteit op. De overige experimenten leverden allemaal goede gegevens op, maar waren esthetisch minder aantrekkelijk vanwege kleine trillende bewegingen van de worm die over het algemeen na vijf tot acht uur immobilisatie begonnen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het altijd belangrijk om de uitlijning van de laser in de x-, y- en z-as nauwkeurig te evalueren.

Het meest voorkomende probleem bij het proberen door te snijden van axons is collaterale schade of het volledige onvermogen om axons door te snijden, wat bijna altijd wordt veroorzaakt door een verkeerd uitgelijnde laser. Dit laserablatiesysteem en deze techniek voor het visualiseren van axonale regeneratie in c Agains stellen u in staat om routinematig het effect van elke genetische mutatie op axonale regeneratie te analyseren. NCL Agains.