Name: De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer hoe u een kosteneffectief laseraxotomiesysteem bouwt om axonregeneratie in C. elegans te bestuderen. Deze methode maakt precieze axon doorsnijding mogelijk met minimale collaterale schade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation, het McKnight Endowment Fund for Neuroscience, de Christopher and Dana Reeve Foundation en de Amerisure Charitable Foundation.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li>
<li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li>
<li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Chem.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling gemeld.

Er zijn verschillende goede discussies over laser-microschirurgie met verschillende lasersystemen3,5-11. Femtoseconde-IR-lasers zijn de "gouden standaard" voor subcellulaire laserablatie12 en zijn handig als ze gekoppeld zijn aan een beeldvormingsfaciliteit, maar ze zijn vaak te kostbaar voor individuele gebruikers. Als u een femtoseconde-IR-laser nodig heeft voor de beeldvorming van uw monster vanwege de beelddiepte, dan heeft u er waarschijnlijk ook een nodig voor laser-axotomie. Transparante weefsels met doelaxonen binnen 30-50 µm van het oppervlak zijn waarschijnlijk haalbaar met blauwe en groene pulslasers in het bereik van 20 µJ/puls, gericht via een immersielens met een hoge na. Er zal meer collaterale schade zijn met nano- en picoseconde-lasers vergeleken met de femtoseconde-laser, vooral naarmate de diepte van het doelaxon toeneemt. C. elegans is transparant en alle axonen bevinden zich binnen 20-30 µm van het oppervlak. Wij snijden routinematig motorische axonen die zich binnen 5 µm van het oppervlak bevinden. We hebben ook met gemak axonen binnen de zenuwring gesneden die ongeveer 20 µm van het cuticulaoppervlak afliggen. We stelden vast dat de grens voor het doorsnijden van axonen ongeveer 30-50 µm is door de diameter van een volwassen worm. Het is waarschijnlijk dat het hier beschreven laserablatiesysteem goed zou werken bij veel verschillende preparaten die voldoen aan de criteria van transparantie en diepte van de doelaxonen. Toch is het enigszins verrassend, gezien de theoretische voordelen van femtoseconde-IR-lasers, dat nano- en picoseconde 355 nm en 532 nm lasers zo goed presteren voor laser-axotomie in C. elegans6,13. We zien geen verschillen in axonregeneratie als reactie op laser-axotomie met nanoseconde 440 nm, nanoseconde 532 nm en femtoseconde-IR-lasers.
Solid-state 355 nm UV-lasers kosten ongeveer hetzelfde als de 532 nm diode-gepompte passief Q-geswitchte solid-state laser, maar vereisen ofwel hogere vermogens of optica die deze kortere golflengten efficiënt doorlaten. De meeste optica zijn ontworpen om goed te functioneren met zichtbaar licht van 400-700 nm. 355 nm lasers zouden enkele voordelen bieden6, zoals een verlaagde plasmadrempel, een kleinere spotgrootte, en een long-pass dichroïsche spiegel zou 100% van de ablatielaser efficiënt naar het doel richten en gelijktijdige beeldvorming van GFP mogelijk maken zonder verlies van het monstersignaal. Blauwe 440 nm lasers zouden de voordelen van het werken met een zichtbaar lichtlaser behouden (goede prestaties met standaardoptica en veiligheid). Helaas zijn de kosten van een DPP Q-geswitchte solid-state 440 nm laser op dit moment 3 maal zo hoog als die van een 355 nm of 532 nm laser met vergelijkbaar vermogen. Als we een nieuw systeem zouden ontwerpen voor C. elegans, waarbij de doeldiepte minimaal is, zouden we kiezen voor een UV-transparante lens (kosten ongeveer $3.000 voor een 40X 1.3na olie-lens met 50-70% transmissie bij 355 nm) en een 355 nm laser die 5-10 uJ/puls produceert bij 1-20 kHz.
Men gaat ervan uit dat axon-ablatie het gevolg is van plasmavorming. Kortere pulsen genereren plasmadrempels bij een lager vermogen en de plasmavolumes zullen kleiner zijn6. Het doel is om het kleinste en kortstlevende plasma te creëren door de pulsenergie naar het laagste vermogen aan te passen. Grotere, langdurige plasma's genereren cavitatiebellen die de omringende cellen beschadigen. Over het algemeen hebben we vastgesteld dat ablatie met ongeveer 50-100 pulsen bij de hoogste frequentie (d.w.z. 2,5kHz) de beste resultaten geeft. Dit suggereert dat schade geleidelijk kan worden opgebouwd over een reeks pulsen om de omvang van de schade beter te beheersen. Het hier beschreven laserablatiesysteem is zeer vergevingsgezind, mits de bundel nauwkeurig is uitgelijnd en uitgebreid. We beginnen met het doorsnijden van axonen in volwassen wormen bij 10% laservermogen (gemiddeld 0,3 mW gemeten bij 2500 Hz en geschat op 1 uJ/puls) en kunnen doorsnijden met beperkte lokale schade tot 14% vermogen. Vanaf 15-39% laservermogen kunnen grotere beschadigde gebieden worden waargenomen, maar pas boven 40% vermogen (gemiddeld ongeveer 1 mW gemeten bij 2500 Hz) exploderen de wormen door grote cavitatiebellen en schade aan de cuticula van de worm.
Het artikel van Steinmeyer et al. 20102 is een uitstekende bron voor het construeren van een laserablatiesysteem. Leon Avery heeft ook een mooie praktische beschrijving van een laserablatiesysteem gebaseerd op een goedkope N2-gaslaser van 337 nm en hij geeft enkele goede praktische adviezen (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Bij het ontwerpen van uw eigen systeem moet u eerst overleggen met uw microscoopvertegenwoordiger om te bepalen hoe de ablatielaser op het microscoopobjectief kan worden gericht. Uw microscoop moet worden geplaatst op een trillingsisolatietafel (Newport, TMI, Thor). Een breadboard-blad is optimaal, maar een massief stalen blad kan nog steeds worden gebruikt met magnetische positioneers. Een speciale tussenmodule op een rechtopstaande microscoop is handig omdat alle optische elementen op hun plaats kunnen blijven. Het kan echter goedkoper en praktischer zijn om een cameraport (geïnverteerd) of een "combiner" te gebruiken die is bevestigd aan een epi-fluorescentieport. U moet de grootte van de achteropening en de transmissie (bij de golflengte van de ablatielaser) van de objectieflens die u wilt gebruiken, weten. Zodra u een laser heeft gekozen (bijv. Crylas, TEEM, Crystal of CRC), dient u contact op te nemen met Thor of Newport voor hulp bij het selecteren van de juiste optische elementen, hardware en veiligheidsapparatuur. Wij hebben gekozen voor een dubbele Galileïsche straalexpander om ruimte te besparen, maar een eenvoudigere Kepleriaanse expander is ook een optie (f2/f1=expansiefactor). Een op maat gemaakte straalexpander is het goedkoopst, maar Newport, Thor en verschillende laserfabrikanten bieden commerciële straalexpanders van uitstekende kwaliteit aan. Sommige laserfabrikanten bieden ook handmatige en elektronisch gestuurde attenuatoren aan die kosteneffectief en ruimtebesparend kunnen zijn, maar niet zo veelzijdig als de Glan-Thompson-polarisator en de halve-golfplaat. U moet ook beslissen hoe u de laser wilt aansturen. U kunt een LabView-gebaseerde controller ontwerpen, een commerciële TTL-generator gebruiken of software gebruiken die door het laserbedrijf wordt geleverd. Bespreek de opties met de specifieke laserfabrikant.
We hebben een lijst van de gebruikte hardware bijgevoegd, uitsluitend als algemene richtlijn. Het hier beschreven systeem kostte ongeveer $15,000 toen het aan ons bestaande imagingsysteem werd toegevoegd. Uw lokale afdeling Natuurkunde heeft vaak iemand die bereid is een praktische introductie te geven over het veilig werken met vrije-straal lasers.
Alternatieve methoden voor immobilisatie en time-lapse imaging van C. elegans zijn onlangs beschreven.14
Probleemoplossing
De meest moeilijke en kritische stap is de uitlijning van de gecentreerde, uitgebreide bundel op de optische as van de microscoop. Zodra de bundel gecentreerd en uitgebreid is via de Galileï-lenzen, moet u er alles aan doen om deze binnen 5 um van de optische as van de microscoop uit te lijnen VOORDAT u de stuurspiegels gebruikt voor de uiteindelijke uitlijning op het centrum. Overmatig gebruik van de stuurspiegels om de bundel op de microscoop uit te lijnen, zal deze uit de as van de bundeluitbreider verschuiven. MET UITERSTE VOORZICHTIGHEID kunt u de laserbundel attenueren met het juiste ND-filter en het laserbundelprofiel direct bekijken op een reflecterend doel (front-surface spiegel). U kunt de microscoop voorzichtig verschuiven om de bundel precies in het gezichtsveld van het 60X objectief te centreren (als dit in het op/neer-bereik niet kan worden gecentreerd, moet de railhoogte worden aangepast). Het bundelprofiel kan worden gebruikt om de optische as van de microscoop nauwkeurig uit te lijnen, zodat een gecentreerde bundel ontstaat die cirkelvormig is en symmetrisch "uitwaaiert". Een asymmetrische uitwaaiering is een indicatie dat de microscoopas niet perfect is uitgelijnd (of dat de rail niet waterpas staat). Ten slotte moet u L3 aanpassen, waarbij een gelijkmatige en symmetrische expansie en contractie van de bundel zichtbaar moet zijn. Stel de microscoop nauwkeurig scherp op het doeloppervlak en pas vervolgens L3 aan om de laserbundel te focussen tot de kleinste spot. U zult nu merken dat de laserbundel zich binnen 5 um van het centrum bevindt wanneer deze wordt afgebeeld via LSCM of een CCD-systeem, en dat de ablatiespot zich binnen 1um van de Z-focus bevindt.
Als u merkt dat u wormen "opblaast" of consistent grote cavitatiebellen genereert bij het doorsnijden van axonen, ligt het probleem zeer waarschijnlijk bij de fijne uitlijning van de ablatielaser. Zorg ervoor dat de minimale (&lt;500nm) ablatiespot gelokaliseerd is op de Z-focus (pas de convergentie aan met de L3-lens) en op het XY-fiduciaire punt (pas aan met de laatste kinematisch gemonteerde spiegel).
Het targeten van axonen die dichter bij het oppervlak liggen, vereist minder laservermogen. Op dezelfde manier zullen kleinere dieren (L1 en L2) minder laservermogen nodig hebben voor axotomie in vergelijking met het targeten van dezelfde axonen bij volwassenen.
Als uw wild-type axonen niet regenereren of als de axonen bleken, dient u te proberen het vermogen van de beeldvormingslaser te verlagen of de bemonsteringssnelheid te verkleinen. Als uw wormen sterven of ziek worden, probeer dan het agarosepercentage in stappen van 1% te verlagen. Zorg ervoor dat u het dekglas niet verschuift na het monteren van de wormen, aangezien dit vaak tot hun dood leidt bij gebruik van een hoog agarosepercentage en microsferen.
Als uw wormen knappen of sterven tijdens een time-lapse sessie, is dit te wijten aan: 1. Het percentage agarose is te hoog. 2. Beschadiging van de cuticula door de ablatielaser. 3. Verschuiving van het dekglas na het monteren. Indien beschadiging van de cuticula de oorzaak is, zal dit alleen invloed hebben op gemonteerde wormen die met de ablatielaser zijn behandeld.
Als uw worm te veel beweegt tijdens een time-lapse-sessie, probeer dan het agarosepercentage in stappen van 0,5% te verhogen. Gezonde axonen in gezonde wormen zijn altijd "actief" en vertonen een constant fluorescentieniveau. Als u een plotselinge afname in fluorescentie of activiteit ziet, is de worm stervend of dood. Meerdere gekraalde of gefragmenteerde axonen zijn een zeker teken van een stervende of dode worm.
Als u problemen heeft om uw axonen gedurende de gehele time-lapse-sessie in focus te houden, kunnen daar verschillende oorzaken voor zijn. Controleer eerst de drift van uw tafel door gedurende 10 hrs een inert monster op een glazen objectglas te beeldvormen. Een drift van enkele microns kan worden veroorzaakt door thermische instabiliteit, maar meer dan 5 um is waarschijnlijk te wijten aan mechanische problemen met uw microscoop. Problemen met de montage komen vaker voor. Laat uw gemonteerde wormen 30 minuten equilibreren op uw microscooptafel voordat u met de time-lapse begint. Controleer of de Vaseline-afdichting geen lekken heeft ontwikkeld tijdens uw time-lapse-sessie.

<table><tbody><tr><td>Naam van het reagens</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen (optioneel)</td></tr><tr><td>535 nm Laser</td><td>Crylas</td><td>FDSS532Q3</td><td>(TEEM, Crystal en CRC bieden ook vergelijkbare lasers aan)</td></tr><tr><td>Alle optica en hardware</td><td></td><td></td><td>(Thor biedt vergelijkbare optica en hardware aan)</td></tr><tr><td>SUPREMA optische houder, 1,0-inch diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>SS100-F2KN</td><td>2</td></tr><tr><td>Stang van 1&quot; diameter, 1&quot; hoogte</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Stangvork van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Achromatische nulde-orde golfelplaat, &amp;frac12; golfvertraging, 400-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10RP52-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Rotatietrap, 1&quot; opening</td><td>Newport Corp.</td><td>RSP-1T</td><td>1</td></tr><tr><td>Stang van 1&quot; diameter, 1&quot; hoogte</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Stangvork van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Glan-Laser calciet polarisator, 430-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10GL08AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Rotatiehouder voor polarisator</td><td>Newport Corp.</td><td>RM25A</td><td>1</td></tr><tr><td>&amp;#188;&quot; spacer voor stang van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.25</td><td>1</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&quot; hoogte, stang van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.5</td><td>1</td></tr><tr><td>Vork, stang van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Beam dump</td><td>Newport Corp.</td><td>PL15</td><td>1</td></tr><tr><td>Houder voor microscoopobjectief</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-OBJ1</td><td>1</td></tr><tr><td>Stang van 1&quot; diameter, 1&quot; hoogte</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Stangvork van 1&quot; diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>High-Energy Nd:YAG laserspiegel, 25,4 mm diameter, 45&amp;#x00B0;, 532 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10Q20HE.2</td><td>4</td></tr><tr><td>SUPREMA optische houder, 1,0 inch diameter, montagegat met speling</td><td>Newport Corp.</td><td>SN100C-F</td><td>2</td></tr><tr><td>Hoge precisie knop-instelbout, 12,7 mm slag, 100 TPI</td><td>Newport Corp.</td><td>AJS100-0.5K</td><td>4</td></tr><tr><td>Schroefdrapadapter, &amp;#188;-20 mannelijk, 8-32 vrouwelijk</td><td>Newport Corp.</td><td>SS-1-B</td><td>2</td></tr><tr><td>Stangklem voor stang van 1,5 inch diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>340-RC</td><td>2</td></tr><tr><td>Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>1</td></tr><tr><td>Raildrager voor X26, vierkant 40 mm lengte</td><td>Newport Corp.</td><td>CN26-40</td><td>4</td></tr><tr><td>Stalen rail, 384 mm (15&quot;) lengte</td><td>Newport Corp.</td><td>X26-384</td><td>1</td></tr><tr><td>Stangplatform voor stang van 1,5 inch diameter</td><td>Newport Corp.</td><td>300-P</td><td>2</td></tr><tr><td>Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>2</td></tr><tr><td>Plano-concave lens, 12,7 mm diameter, -25 mm EFL, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPC025AR.14</td><td>2</td></tr><tr><td>Plano-convexe lens, 25,4 mm diameter, 50,2 mm EFL, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX082AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Plano-convexe lens, 25,4 mm diameter, 62,9 mm EFL, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX085AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Vaste lenshouder, 0,5&quot; diameter, 1,0&quot; ashoogte</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-0.5</td><td>2</td></tr><tr><td>Vaste lenshouder, 1,0&quot; diameter, 1,0&quot; ashoogte</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-1</td><td>2</td></tr><tr><td>Microsferen 0,1 µm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td>EEO-kwaliteit</td></tr><tr><td>Muscimol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1523</td><td></td></tr></tbody></table>

de bouw van een low-budget laser axotomy systeem om axon regeneration study in c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse microscopie is een gevoelige assay voor axonale regeneratie-fenotypen in C. elegans1. De belangrijkste moeilijkheid van deze assay is de waargenomen kostprijs ($25-100K) en de technische expertise die vereist is voor de implementatie van een laserablatiesysteem2,3. Echter, solid-state gepulseerde lasers tegen bescheiden kosten (&lt;$10K) kunnen robuuste prestaties leveren voor laserablatie in transparante preparaten waarbij de doelaxonen "dicht" bij het weefseloppervlak liggen. De constructie en uitlijning van een systeem kan in één dag worden voltooid. Het optische pad, gevormd door het licht van de gefocuste condensor naar de ablatielaser, dient als een handige uitlijningsgids. Een tussenmodule waarin alle optica zijn verwijderd, kan specifiek worden gewijd aan de ablatielaser, waardoor wordt gegarandeerd dat er geen optische elementen verplaatst hoeven te worden tijdens een laserablatiesessie. Een dichroïsche spiegel in de tussenmodule maakt gelijktijdige beeldvorming en laserablatie mogelijk. Het centreren van de laserstraal ten opzichte van de uitgaande straal van de gefocuste microscoopcondensorlens leidt de initiële uitlijning van het systeem. Diverse lenzen worden gebruikt om de laserstraal te conditioneren en uit te breiden zodat de achteropening van de gekozen objectieflens wordt gevuld. De uiteindelijke uitlijning en testen worden uitgevoerd met een glazen objectglas met een front-surface spiegel als doelwit. Het laservermogen wordt aangepast om een ablatieplek van minimale grootte te verkrijgen (&lt;1um). De ablatieplek wordt gecentreerd door middel van fijne aanpassingen van de laatste kinematisch gemonteerde spiegel ten opzichte van kruisdraadjes die in het beeldvenster zijn gefixeerd. Het laservermogen voor axotomie zal ongeveer 10X hoger zijn dan nodig voor de minimale ablatieplek op het doelglasplaatje (dit kan variëren afhankelijk van het gebruikte doelwit). Wormen kunnen worden geïmmobiliseerd voor laser-axotomie en time-lapse beeldvorming door ze te monteren op agarose-pads (of in microfluïdische kamers4). Agarose-pads worden eenvoudig gemaakt met 10% agarose in gebalanceerde zoutoplossing, gesmolten in een magnetron. Een druppel gesmolten agarose wordt op een glazen objectglas geplaatst en met een ander objectglas platgedrukt tot een pad van ongeveer 200 um dik (een enkele laag tijdtape op aangrenzende glasplaatjes wordt als afstandhouder gebruikt). Een "Sharpie"-dop wordt gebruikt om een cirkelvormig pad met een uniforme diameter van 13mm uit te snijden. Anestheticum (1ul Muscimol 20mM) en microsferen (persoonlijke communicatie Chris Fang-Yen) (1ul 2,65% polystyreen 0,1 um in water) worden aan het centrum van het pad toegevoegd, gevolgd door 3-5 wormen die zo zijn georiënteerd dat ze op hun linkerzij liggen. Een glazen dekglas wordt aangebracht en vervolgens wordt vaseline gebruikt om het dekglas af te dichten en verdamping van het monster te voorkomen.

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse-imaging is een gevoelige methode om de effecten van mutaties in C. elegans op axonregeneratie te analyseren. Een hoogwaardig, maar goedkoop laserablatiesysteem kan eenvoudig aan de meeste microscopen worden toegevoegd. Time-lapse-imaging over een periode van 15 uur vereist een zorgvuldige immobilisatie van de worm.

De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans</em

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse microscopie is een gevoelige assay voor axonale regeneratie-fenotypen in C. elegans1. De belangrijkste moeilijkheid van deze assay ...

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe een laserablatiesysteem moet worden geassembleerd en uitgelijnd voor het bestuderen van axonale regeneratie in CL gans. Dit wordt bereikt door eerst een laser-gland Thompson polarisator, een halfgolfplaat, een draaispiegel, een periscooprail en een railspiegel op een breadboard te monteren. De volgende stap van de procedure is het uitlijnen van de laserstraal op de uitgaande straal van de condensorlens van de microscoop.Vervolgens wordt de lens van de laserstraaluitbreider gemonteerd, uitgelijnd en gepositioneerd om de laserstraal te centreren en deze divergentievrij te maken. De laatste stap van de procedure is om de laserablatieplek congruent te maken met de beeldfocus door middel van fijne aanpassingen. Uiteindelijk is het mogelijk om met de diffractiebeperkte laserstraal axonen van een halve micron nauwkeurig door te snijden met minimale collaterale weefselschade, zelfs wanneer er sprake is van een imperfecte XY NC-uitlijning.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals femtosecondelasers, is dat deze met een prijs van 15.000 relatief goedkoop is. De methode is relatief onderhoudsvrij en maakt zeer nauwkeurige axonsectie mogelijk. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de axonregeneratie van de zeepijpworm, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals vliegen, zebravissen, muizen, het perifere zenuwstelsel en in vitro cellen.In principe elke cel die zich binnen 30 tot 50 µm van het oppervlak bevindt. Begin met de componenten op het breadboard en bout de laserperiscoophouder en de verhoogde railssteunen vast. Dit systeem maakt gebruik van een klasse 3B laser die uw ogen gemakkelijk kan beschadigen, dus neem de laserveiligheid serieus.Bespreek met iemand van uw lokale vakgroep natuurkunde hoe u veilig met open laserstralen kunt werken. Zet de laser tijdens het uitlijningsproces altijd op het laagste vermogen. Wanneer u door de oculairs kijkt, dient u er zeker van te zijn dat de laser mechanisch is afgesloten en is uitgeschakeld.Positioneer nu de microscoop: richt deze eerst uit met de as van de rail. Richt hem vervolgens uit met de doorgelaten lichtbundel van de condensorlens van de microscoop. Richt tenslotte beide uiteinden van de rail uit op de condensorbundel met behulp van een instelbare diafragma of lens die aan de rail is bevestigd.Gebruik een waterpas en laboratoriumkrikken om de hoogte van de rail aan te passen voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de rail zijn uitgelijnd. Controleer vervolgens of de laserstraal door de gland, de Thompson-polarisator en de halfgolveplaat gaat en niet tegen de randen slaat tijdens het draaien.De halfdoorlatende plaat wordt gebruikt om het vermogen van de laser aan te passen, terwijl alle componenten stevig op de optische tafel zijn bevestigd. Zet de laser aan, stel de pulsfrequentie in op 100 in continue modus en verminder het vermogen tot een minimum met behulp van de halfdoorlatende plaat. Gebruik een post-it of lenspapier om de laserstraal zichtbaar te maken.Breng nu de laserstraal vanaf het breadboard omhoog. Stel de kinematisch gemonteerde spiegels in volgorde vanaf de laser af en fixeer deze om de straal naar de spiegel te leiden die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. Wanneer dit is voltooid, moet de laserstraal ongeveer in het centrum van de spiegels zijn uitgelijnd, en moeten de spiegels ongeveer 45 graden ten opzichte van de as van de laserstraal zijn georiënteerd voordat de laserstraal wordt uitgelijnd met de doorgelaten lichtstraal van de microscoop.Verwijder of open alle ND-filters en diafragma's in de tussenmodule. We beginnen nu met de meest kritische stap om axonen nauwkeurig door te snijden zonder overmatige collaterale schade. We gaan de laser precies uitlijnen op de x-, y- en z-as bij het laagste laservermogen om de kleinste ablatiespot te verkrijgen.De laser en de doorgelaten lichtbundels kunnen gelijktijdig tegen papier worden waargenomen. Plaats ter beginfase het papier nabij de poort van de microscoop. Begin nu met het uitlijnen van de laser met behulp van de grove instellingen op de spiegel bovenop de periscoop en de spiegel aan het uiteinde van de rail.Plaats een vel papier tussen de uitgelijnde condensorlens en de open objectieftorens. Gebruik de fijnafstellingen op de spiegelrail om de laserstraal verder uit te lijnen met het midden van de grotere doorgelaten lichtbundel. Zet de microscoop nu vast met klemmen.Aanvullende stappen voor het beoordelen van de uitlijning van de laser zijn te vinden in het geschreven manuscript. Dubbele Galileïsche straaluitbreiders moeten worden geïnstalleerd om de laserstraal van 300 micron 33 keer uit te breiden, zodat de achteropening van het 10 millimeter objectief wordt gevuld. Begin met het monteren van de vier lenzen op dragers.Bevestig vervolgens de lenzen aan de rail zodanig dat ze zich allemaal op dezelfde optische as bevinden en exact loodrecht op de laserstraal staan. Zet de laser aan en stel deze in op het minimumvermogen en op de continue modus. Pas de uitlijning van de straal door elke lens grofweg aan.Gebruik papier om de straal zichtbaar te maken. Zet de laser nu uit. Plaats een veiligheidssluiter op de laser en verwijder de microscoop uit het pad van de laserstraal.Zet de laser weer aan en visualiseer deze tegen een nabijgelegen muur. Gebruik de fijninstelling van de lenzen om de bundel uit te breiden. Stel vervolgens de laatste twee kinematisch gemonteerde spiegels af om de bundel uit te lijnen tot een cirkel van uniforme helderheid op de geschatte positie van de achteropening van het objectief.Bekijk de grootte en uniformiteit van de bundel tegen papier. Stel vervolgens de bundel in op nulconvergentie door te observeren hoe de bundelgrootte verandert naarmate het papier verder van de lens wordt bewogen. Schakel de laser uit en sluit het mechanische sluitergedeelte.Schuif de microscoop met behulp van de vaste klemmen terug in het pad van de laserstraal om de juiste uitlijning te bepalen. Plaats de klemmen aan de vrije zijde van de microscoop, maar draai ze nog niet vast. Zet nu de laser aan.Verwijder de veiligheidssluiter en draai de objectiefrevolver naar een open positie met behulp van papier op de tafel; een uitgebreide en uniforme laserstraal gecentreerd op de doorgelaten lichtstraal van de condensor moet zichtbaar zijn. Als de stralen niet gecentreerd zijn, centreer deze dan door de microscoopklemmen te versoepelen en de microscoop voorzichtig te verschuiven. Sluit nu de veiligheidssluiter en zet de laser in de trigger-modus.Draai het 60-keer objectief op zijn plaats. Neem nu een beeld op van de oppervlaktekrasjes op een target-objectglas. Verwijder de veiligheidssluiter, activeer de ablatielaser en stel het laservermogen in voor de minimale ablatiespot.De spot moet cirkelvormig zijn en zich binnen vijf tot 10 microns van het midden van het beeld bevinden, het centrum van de ablatiespot. Met behulp van de fijne instellingen van de kinematisch gemonteerde railspiegel moet de spot gecentreerd en het bundelprofiel uniform worden gehouden, waarbij het noodzakelijk zal zijn om de railspiegel en de bovenste periscoopspiegel iteratief af te stellen. Evalueer de Z-focus van de laser door de focus systematisch in stappen van één micron omhoog en omlaag te bewegen en bij elke stap de ablatielaser te triggeren.Als de bundel correct is uitgebreid en uitgelijnd en de convergentie juist is ingesteld, dan moet de ablatie maximaal zijn in de beeldbrandpuntsafstand en zwak of helemaal niet één micron boven of onder het brandpunt. Als de maximale ablatieplek zich boven of onder het beeldbrandpunt bevindt, moeten de laatste aanpassingen aan de Z-focus van de uitgebreide bundel worden gemaakt door lens L3 van de Galileïsche telescoop te verplaatsen totdat de laserablatie congruent is met het beeldbrandpunt. Nematoden werden gemonteerd op een aangepast objectglas en axonen werden geablateerd met behulp van het geconstrueerde systeem Laser exo somy; time-lapse imaging van axonale regeneratie was zeer robuust.Met behulp van een gemotoriseerde tafel was het mogelijk om routinematig en nauwkeurig vijf axonen in vijf verschillende dieren te snijden en te beelden op één enkele objectglas. De beeldvormingstijd voor de axonen was hierbij de limiterende factor.Ongeveer 10% van de experimenten resulteerde in time-lapsefilms van hoge kwaliteit. De overige experimenten leverden allemaal goede gegevens op, maar waren esthetisch minder aantrekkelijk vanwege kleine schokbewegingen van de worm die over het algemeen na vijf tot acht uur immobilisatie begonnen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het altijd belangrijk om de uitlijning van de laser in de x-, y- en z-as nauwkeurig te evalueren.Het meest voorkomende probleem bij het proberen door te snijden van axonen is collaterale schade of het volledige onvermogen om axonen door te snijden, en dit komt bijna altijd door een verkeerd uitgelijnde laser. Dit laserablatiesysteem en deze techniek voor het visualiseren van axonale regeneratie in c Agains stellen u in staat om routinematig het effect van elke genetische mutatie op axonale regeneratie te analyseren. NCL Agains.

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

In vivo Laser axotomy in C. elegans

Deze video beschrijft twee-foton laser ablatie van axonen in een Drosophila melanogaster larve en een voorbeeld protocol om letsel te induceren en beeld de verwonding site.

Twee-Foton Laser-Geïnduceerde Neurale Verwonding: Een Methode om Axon Degeneratie en Regeneratie in Drosophila Larven te observeren

Deze video introduceert een methode van laserwonden, die wordt gebruikt om zeer nauwkeurige verwondingen in de wormepidermis te veroorzaken.  Het monsterprotocol is afkomstig van een onderzoek naar wondrespons en herstel.

Epidermale laserwonden: gelokaliseerde schade veroorzaken om reparatieprocessen in C. elegans te onderzoeken

Deze video beschrijft de methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden met behulp van twee fotonlaseraxotomie en het observeren van axonale herstel van letsel.

Twee-Foton Laser Axotomie: Een methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden en axonale herstel te observeren

This video demonstrates a method for inducing targeted neuronal injury in Drosophila larvae using a high-power laser. After positioning the larva under a microscope, a low-power laser scans for fluorescent neurons, and then the laser power is increased to induce localized damage. The injury is confirmed by increased fluorescence and a crater at the injury site.

Inducing Targeted Neuronal Injury Using a High-Power Laser in a Drosophila Larva

Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

De huid van de volwassen C. elegans is een hanteerbaar model voor studies van epitheliale wondreacties, inclusief wondgenezing, littekenvorming en aangeboren immuniteit.

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in C. elegans

Hier presenteren we een protocol met de Drosophila sensorisch neuron - dendritische arborization (da) neuron letsel model, dat in vivo combineert wonen imaging, twee-foton laser axotomy/dendriotomy en de krachtige vliegen genetische werkset, als een platform voor de screening potentiële initiatiefnemers en remmers van neuroregeneration.

Een Drosophila In Vivo letsel Model voor het bestuderen van de Neuroregeneration in de perifere en centrale zenuwstelsel

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Leer hoe u een kosteneffectief laseraxotomiesysteem bouwt om axonregeneratie in C. elegans te bestuderen. Deze methode maakt precieze axon doorsnijding mogelijk met minimale collaterale schade.

De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans

Meer video's verkennen