Name: Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en milieumonsters met behulp van oligonucleotide-gekoppelde fluorescerende microsferen en Bio-Plex analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Alberto Severini en Vanessa Goleski voor hulp bij assay ontwikkeling en kritische reacties op dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Public Health Agency of Canada en het Industrieel Onderzoeksfonds Assistance Program (National Research Council van Canada). Aanvullende ondersteuning werd verkregen van de Universiteit van Saskatchewan Publicatie Fonds.

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Dumonceaux et al.. J. Clin. . Microbiol 47, 4067 tot 4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Een schematisch diagram dat de totale procedure is weergegeven in figuur 1. 1. Bead koppeling Dit beschrijft de methoden die moeten worden gebruikt voor het koppelen van oligonucleotide probes om polystyreen Luminex kralen (zie tabel 2). Volumes zijn licht aangepast voor de evaluatie van nieuwe vangprobes op proef, deze volumes zijn tussen haakjes vermeld. <ol><li> Verwijder een-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) poeder van -20 ° C exsiccator en warm op kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de microsferen door sonciation in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 20 seconden, dan te vortexen ongeveer 20 seconden. </li><li> Transfer 400 ul (100 pi) van microsferen aan een Eppendorf buis (dit komt overeen met 5x10 6 of 1,25 x10 6 microsferen). Luminex suggereert het gebruik van een lage eiwitbinding microcentrifugebuizen (bijv. Eppendorf Protein LoBind buizen, catalogus nummer 0030 108.094) om het afgekoppeld kralen te voorkomen dat het vasthouden aan de buizen en bemoeien met kraal herstel. We hebben niet gemerkt dat dit een probleem is met behulp van standaard polypropyleen microcentrifuge buizen, die meestal gebruiken we (bijv. VWR catalogus nummer 87003-298) zijn. </li><li> Pellet bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant. </li><li> Resuspendeer de microsferen in 50 ul (12,5 ul) van de ruimte-temperatuur 0,1 M 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES) pH 4,5. </li><li> Bereid een verse oplossing van EDC bij 10 mg / ml in water. <ol><li> Bereid minder dan 1 ml van deze oplossing door het wegen 5-10 mg van EDC op een analytische schaal, dan is het toevoegen van water tot 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Voeg 1 nmol van 5'-amino C12-gemodificeerde oligonucleotide capture (tabel 2) aan microsferen en door vortexen gemengd. 1 nmol is 5 pi van 200 uM oligonucleotide. </li><li> Voeg 2,5 ul van verse EDC oplossing voor de microsferen en door vortexen gemengd gedurende 5 seconden. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Gooi de EDC-oplossing (stap 1.6) en bereiden een nieuw monster van 10 mg / ml EDC in het water, zoals hierboven (stap 1.6). </li><li> Voeg nog een 2,5 ul van verse EDC oplossing voor de microsferen en vortex gedurende 5 seconden. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Was de kralen door het toevoegen van 1 ml van 0,02% Tween 20. Vortex (optioneel ultrasone trillingen gedurende 20 seconden ook) om de kralen resuspenderen. </li><li> Centrifugeer 14.000 xg 1 minuut. Verwijder de supernatant. </li><li> Was weer de kralen door het toevoegen van 1 ml van 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS). Vortex (optioneel ultrasone trillingen gedurende 20 seconden ook) om de kralen resuspenderen. </li><li> Centrifugeer 14.000 xg 1 minuut. Verwijder de supernatant. </li><li> Resuspendeer de kralen in 100 pi (25 ul) van Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0]. </li><li> Inventariseer de kralen in een hemocytometer of Coulter strijd zijn met de voorraad concentratie te bepalen. </li><li> Bereid een Microsphere Master Mix door verdunning van elke kraal tot een uiteindelijke concentratie van 100 kralen / ul in TE buffer. Pool gekoppeld kralen die overeenkomt met de gewenste samenstelling van de test (bijv. voor een 10-plex test, 10 verschillende gekoppeld kralen mix bij een uiteindelijke concentratie van 100/μl van elke kraal). </li><li> Bewaar de Microsphere Master Mix bij 4 ° C in het donker. Het mengsel kan worden opgeslagen voor de maanden indien bewaard onder deze omstandigheden. </li></ol> 2. Chaperonine 60 universele target (cpn60 UT) amplicon de productie en de generatie van enkele strengen. <ol><li> Het genereren van polymerase chain reaction (PCR) product voor elk monster. Neem de fosforothioaat-en biotine-gemodificeerde 5 'primer set (tabel 1). Zie tabel 3 voor volumes te mengen en concentraties. </li><li> Direct na de PCR is voltooid, voeg 2 pl (20 eenheden) van de T7 exonuclease aan elke PCR-buis (de PCR-buffer zal volstaan ​​voor de T7-reactie). Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (~ 22-25 ° C) gedurende 40 minuten. </li><li> Aan het einde van deze incubatie toe te voegen 12,5 pl van 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 en meng. Dit geeft een totaal van ~ 64.5μl van enkelstrengs PCR-product. </li></ol> 3. Hybridisatie van enkelstrengs PCR-product aan oligonucleotide-gekoppelde polystyreen parels. <ol><li> Voorverwarmen van het instrument tot 60 ° C tot hybridisatie temperatuur te handhaven tijdens de analyse. Zet op het platform verwarming met behulp van het instrument software en zorg ervoor dat de koperen verwarmingsblok dat de PCR-stijl plaat die de gehybridiseerd kraal mengsel bevat past gebruiken. </li><li> Resuspendeer Microsphere Master Mix (stap 1.20) met een pipet, afzien van een passend bedrag in een eppendorfbuisje, cap de buis, en ultrasone trillingen in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 2 minuten. U kunt ook de absolute consistentie in de kraal resuspe zorgennsion, kan de microsfeer master mix worden geresuspendeerd en door vortexen en pipetteren, dan sonicatie zoals hierboven, dan is het afgeven van de gewenste hoeveelheid in een polypropyleen Eppendorf buis. </li><li> Doseer 17 ul van enkelstrengs PCR-product (stap 2.2) in de juiste wells van een low-profile 96-well Beschermbuis PCR-plaat (tabel 2). Voeg 33 ul van de geresuspendeerde, sonciated kraal mengsel aan elke well. Bedek met siliconen cover (tabel 2) en tik voorzichtig. </li><li> Zet de plaat in de thermocycler met een programma van: 95 ° C gedurende 5 min, 60 ° C gedurende 10 min, 60 ° C te houden, 60 ° C gedurende 5 minuten, te beëindigen. Start het programma. </li><li> Het maken van verse streptavidine-phycoerythrin (SA-PE)-oplossing, je wordt 25 ul per putje nodig (maak meerdere putten extra). Maak SA-PE-oplossing door verdunnen voorraad SA-PE (1 mg / ml) 01u50 tot 20 pg / ml met 1x tetramethylammoniumchloride (TMAC) buffer (3 M TMAC; 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Wanneer de thermocycler krijgt om de 60 ° C te houden stap,Open het deksel, verwijder de siliconen cover en direct toe te voegen SA-PE-oplossing aan elk putje (NIET neem de plaat uit de thermocycler). Vervang de siliconen cover, sluit het deksel en thermocycler hervatten van het programma. </li><li> Wanneer het programma klaar is, nemen de plaat uit en snel over te dragen aan de Bioplex machine om te lezen. Plaat moet worden gelezen binnen 10 minuten. Lees bij 60 ° C; ervoor te zorgen dat de Bioplex is voorverwarmd tot deze temperatuur. Zeker te zijn dat de sonde hoogte is aangepast aan gebruik gemaakt van de plaat, zoals beschreven in de handleiding voor het gebruikte instrument tegemoet te komen. </li><li> Voor nauwkeurige parel en signaal-detectie, moet de poort instellingen op de Bioplex worden ingesteld afhankelijk van het soort van de microsferen wordt gebruikt. BioRad polystyreen parels vereisen een poort instelling van 4,335-10,000 terwijl de magnetische microsferen vereisen een instelling van 5,000-25,000. Er is ook de mogelijkheid van het uitvoeren van de plaat met behulp van de High PMT instelling die de verslaggever gain-waarde toeneemt. Dit kan ikncrease de intensiteit van de lagere signalen echter is het van belang ook een passende negatieve controle als achtergrond signaal zal ook worden verhoogd. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een van onze doelen in de ontwikkeling en uitvoering van deze test was om het zo eenvoudig en gestroomlijnd mogelijk te maken. Wij zijn dan ook optimaal de kritische post-versterking stappen, waaronder T7 exonuclease behandeling tijd en hybridisatie tijd om een ​​test waarmee kan worden voltooid binnen een redelijke termijn te ontwikkelen. Zoals getoond in Figuur 2A, T7 behandeling van de amplicon is essentieel voor het signaal generatie, zoals de meeste sondes weinig of geen signaal met korte of geen T7 behandeling was. Het signaal lineair toe tot ongeveer 40 minuten, op welk moment het signaal te verhogen vertraagd. Geen degradatie van het signaal werd zelfs waargenomen 2 uur van T7 de behandeling de tijd, wat aangeeft dat de fosforothioaat wijziging van de primers is zeer effectief in het voorkomen van target streng degradatie, zoals beschreven 15. We hebben gekozen voor 40 minuten voor T7 behandeling de tijd om de totale protocol te minimaliseren, maar het is duidelijk uit figuur 2A dat T7 behandeling door kan gaan veel langer. We hebben ook het effect van hybridisatie tijd op het signaal generatie (figuur 2B) bepaald en vond dat 10 minuten was voldoende voor een maximale signaal, was geen verdere toename van het signaal waargenomen, zelfs na vier uur van hybridisatie. Daarom werd een 10 minuten hybridisatie stap gekozen, weer aan de algemene test te minimaliseren. Met deze resultaten in het achterhoofd, en met een snelle DNA-extractie technieken zoals InstaGene (Bio-Rad), kan de totale test met inbegrip van DNA-extractie, PCR, en Luminex analyse worden afgerond in 4-5 uur. Op een kritische noot, kan het niveau van aggregatie van de polystyreen parels tijdens een Luminex of Bioplex lopen een grote impact hebben op de efficiëntie van de test. De Bioplex software zal geven het niveau van de kraal aggregatie, die optreedt wanneermeer dan een kraal wordt gedetecteerd in de laser pad en resulteert in de uitsluiting van de hybridisatie signaal van de aggregaat. Schijnbare kraal aggregatie kan ook worden veroorzaakt door een fijn stof dat is niet de juiste maat voor een kraal, en kan zelfs worden veroorzaakt door luchtbellen. In elk van deze gebeurtenissen, is het signaal van de kraal aggregaat, luchtbel, of deeltje weggegooid. In de meeste gevallen vinden we dat kraal aggregatie minimaal is (Figuur 3A) en het beoogde niveau van 100 tellen van evenementen voor elke kraal is gemakkelijk haalbaar. Soms, echter, de kralen geven een matige (Figuur 3B) of ernstige (Figuur 3C) niveau van aggregatie. In deze gevallen, aangezien de meeste van de data wordt verwijderd, kan het instrument moeite hebben met het bereiken van 100 evenementen per kraal type en de resultaten kunnen twijfelachtig zijn. De ultrasoonapparaat stap (stap 3.2) is bedoeld om kraal aggregatie te minimaliseren. Daarnaast kan het opslaan van de kralen als een verdunde microsfeer master mix (stap 1.20) te helpen. We hebben gemerkt dat de uitsluiting van TMAC van de hybridization buffer - toe te voegen aan de SA-PE oplosmiddel in plaats daarvan (stap 3.5) - helpt bij het minimaliseren kraal aggregatie. Bovendien, terwijl wij niet over deze getest, zijn de nieuwere magnetische korrels die beschikbaar zijn vanaf Luminex of BioRad gedacht dat minder de neiging te aggregeren weer te geven. De resultaten van de toepassing van een 5-plex Luminex reeks gericht op G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, en L. gasseri samen met de bijbehorende Gram gekleurde vaginaal uitstrijkje uitstrijkjes zijn weergegeven in figuur 4. Deze monsters werden genomen van een enkel individu op verschillende tijdstippen. Op tijdstip 0, was de persoon met de diagnose BV op basis van Gramkleuring (Figuur 4A) en de Luminex resultaten van deze hetzelfde monster (Figuur 4B) tonen aan dat van de organismen vertegenwoordigd in de array, G. vaginalis was het meest voor, terwijl A. vaginae en L. iners waren ook positief. Negen dagen later, het individu nog steeds BV positief en de signal voor G. vaginalis aanzienlijk waren toegenomen, terwijl A. vaginae en L. iners waren nog steeds positief. Belangrijk is dat na deze tijd de individuele begon de overgang naar een normale microbiota als Gram-positieve bacillen werd detecteerbaar in de uitstrijkjes (Figuur 4A), terwijl het signaal voor G. vaginalis afnam en het signaal voor L. iners toegenomen (Figuur 4B). Door onze oorspronkelijke definitie van BV met deze methode (monsters positief voor G. vaginalis en / of A. vaginae werden beschouwd BV positief) 13, deze persoon was BV positief op alle tijdstippen, hoewel de Gramkleuring niet aan G. te detecteren vaginalis in de laatste twee tijdstippen. Met de Luminex hier beschreven methode, kunnen trends eenvoudig worden vergeleken met sequentie-gebaseerde methoden, en de resultaten van de Luminex assay typisch bevestigen Gramkleuringen 13, terwijl het verstrekken van aanvullende informatie over organisme identiteit en overvloed. <img src='"/' files alt='"Afbeelding'> Figuur 1. Schematische weergave van de Luminex protocol voor het bepalen van de microbiota profiel van een complexe klinische of milieu-monster. Het protocol begint met template-DNA dat is geëxtraheerd uit het monster van belang. (1) Genereer PCR-product van template DNA met behulp van streng-specifieke gebiotinyleerde, fosforothioaat gemodificeerde cpn60 UT PCR-primers in combinatie met niet-gemodificeerde cpn60 UT PCR-primers (Tabel 1), (2) Dit genereert een PCR-product pool die de microbiota met de biotine- fosforothioaat wijziging op een streng, (3) de double-stranded PCR-product Digest met T7 exonuclease, die niet kan degraderen de fosforothioaat-gemodificeerde streng en daarom genereert enkelstrengs DNA dat is gewijzigd op het 5'-uiteinde met biotine, (4) Koppel polystyreen bolletjes aan soortspecifieke cpn60 UT probes - Elke kraal heeft een unieke spectrale adres (aangegeven door kraal kleur) dat is te onderscheiden door de Luminex of Bio-Plex instrument; (5) hybridiseren het enkelstrengs PCR-product gegenereerd uit de steekproef van belang zijn voor de suite van soort-specifieke oligonucleotide-gekoppelde beads, (6) Add-streptavidine conjugaat phycoerythrin dat zich bindt aan de gebiotinyleerde enkelstrengs PCR-product en fungeert als een indicator van hybridisatie, (7) Bepaal de spectrale adres (kraal identiteit) en hybridisatie intensiteit van het signaal met behulp van een Luminex of Bio-Plex instrument. Ten minste 100 kralen zijn geteld voor elke kraal identiteit en de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) van de phycoerythrin signaal wordt gerapporteerd als de output. Tot 100 verschillende soorten kralen tegelijkertijd kunnen worden geëvalueerd, maar een test met de discriminatie van de drie types kraal is geïllustreerd. (8) Wanneer de MFI van PCR repliceert gegenereerd op basis van hetzelfde monster is significant groter dan de negatieve controle voor een bepaalde kraal (eenzijdige Student's t-test, p &lt;0,05), wordt het monster als positief voor dat organisme.<img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Optimalisatie van Luminex test parameters. Vijf verschillende probes gericht op Peptostreptococcus anaerobius werden gebruikt met amplicons gegenereerd op basis van een gemengd model, bestaande uit plasmiden die de gekloonde cpn60 UT van 20 bacteriën bekend dat zij samenhangen met de vagina, waaronder P. anaerobius. (A). Effect van de T7 exonuclease de behandeling de tijd. Het protocol hierboven beschreven werd gevolgd, maar de tijd van de behandeling met T7 exonuclease was voorafgaand aan hybridisatie en de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) werd bepaald voor alle sondes gevarieerd. (B). Effect van hybridisatie tijd. Het protocol hierboven beschreven werd gevolgd met een verscheidenheid van hybridisatie tijden. Dezelfde sets van probes werden gebruikt met een amplicon gegenereerd op basis van dezelfde sjabloon als in A en de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) werd bepaald voor alle sondes. "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Bepaling van de kraal aggregatie gebruik Bioplex software. Drie voorbeelden worden gegeven van Bioplex runs, waarin het niveau van de kraal aggregatie is (A) acceptabel (5%), (B) borderline (50%), en (C) onaanvaardbaar (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Toepassing van een 5-plex Luminex array om BV diagnose in opeenvolgende monsters van hetzelfde individu. (A). Gram-gekleurde dia's met de traditionele diagnose gebruikt worden om elk monster te beoordelen voor de BV. (B). Toepassing van een 5-plex Luminex reeks voorbereid en uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol om dezelfde vier monsters getoond in (A). Bacteriële van doelstellingen waarvan de MFI-signaal werd significant positief door onze definitie (eenzijdige Student's t-test, p &lt;0,05) zijn aangegeven met een asterisk (*).

<ol><li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li>
<li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+the+littoral+zone%3A+lactobacilli+losing+the+plot%5BTitle%5D)+AND+%22Sex.+Transm.+Infect%22%5BJournal%5D)">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li>
<li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+vaginosis%3A+a+public+health+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li>
<li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+practices%2C+bacterial+vaginosis%2C+and+women%27s+susceptibility+to+HIV+infection%3A+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+recurrent+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sex.+Transm.+Infect%22%5BJournal%5D)">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li>
<li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li>
<li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Sex.+Transm.+Infect%22%5BJournal%5D)">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li>
<li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Infect.+Dis.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li>
<li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li>
<li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li>
<li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+not%3A+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li>
<li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li>
<li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li>
<li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480%3A+Application+in+viral+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li>
<li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PCR.+Methods.+Appl%22%5BJournal%5D)">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li>
<li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cpnDB%3A+A+Chaperonin+Sequence+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li>
<li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li>
<li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De specificiteit van het signaal generatie is van cruciaal belang, je moet erop kunnen vertrouwen dat het signaal waargenomen werkelijk weerspiegelt de detectie van amplicon gegenereerd op basis van dat organisme. Software zoals PrimerPlex (Premier Biosoft) kan helpen om probes die efficiënt zal hybridiseren het ontwerp, maar ze kunnen wel of niet cross-hybridiseren niet-doelsoorten. Indien een universele PCR-primers worden gebruikt zoals beschreven in dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de geg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide naam </td><td> Vennootschap </td><td> Sequence een </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, of andere </td><td> Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotine-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, fosforothioaat-C, E, fosforothioaat-G, F, fosforothioaat-A, I, inosine, Y, C of T, R, A of G; K, T of G, S, C of G. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Sequenties van de gemodificeerde oligonucleotiden voor universele cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens</td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Doorboren </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerende polystyreen parels: MicroPlex microsferen (Luminex), of Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex of Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx waarbij xxx staat voor de hiel identifier </td><td> Magnetische kralen zijn steeds beschikbaar voor oligonucleotide koppeling en kan bepaalde voordelen. Niet zijn berecht door deze auteurs. </td></tr><tr><td> Capture oligonucleotiden (5 &#39;amino C12 gewijzigd) </td><td> Invitrogen, IDT, of andere </td><td> verschillende </td><td> Ontzout zuiverheid niveau acceptabel is. Sequenties van de vangprobes gebruikt om de vaginale swabs karakteriseren zijn te vinden in het manuscript waarop dit protocol is gebaseerd 13. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-R-phycoerythrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Wees voorzichtig met hoge zuiverheid SA-PE te verkrijgen; deze catalogus nummer is aan te bevelen </td></tr><tr><td> Beschermbuis 96 goed PCR-platen </td><td> Visser </td><td> CS006509 </td><td> passen in zowel de 96-wells thermocycler en Bioplex machine </td></tr><tr><td> Beschermbuis afdichting mat </td><td> Visser </td><td> CS006555 </td><td> Kan worden hergebruikt; wassen met water en zeep, goed afspoelen en droog </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex of Luminex instrument </td><td> Bio-Rad of Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex software voor probe ontwerp </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Aanbevolen voor Luminex sonde deteken, hoewel andere software platformen kan worden gebruikt </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur. <table border="1"><tbody><tr><td> bestanddeel </td><td> ul / test </td><td> μl/100 assays </td><td> uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM elk </td></tr><tr><td> H279BP, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Water </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totalen </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Aanbevolen mengsels voor PCR met gemodificeerde cpn60 UT primers (tabel 1). De test is opgezet voor 5 pi van template DNA en 0,5 pl (2.5U) van Taq DNA-polymerase (Invitrogen). Normaal gesproken grote volumes worden bereid (bv. voldoende voor 100 tests) en opgeslagen bij -20 ° C.

multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescent microsferen

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacteriële vaginose (BV) is een terugkerend polymicrobiële syndroom dat wordt gekenmerkt door een verandering in de &quot;normale&quot; microbiota van Lactobacillus gedomineerde naar een microbiota gedomineerd door een aantal bacteriesoorten, zoals Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, en anderen 1-3. Deze voorwaarde wordt in verband gebracht met een reeks van negatieve gevolgen voor de gezondheid, met inbegrip van HIV acquisitie 4, en het kan moeilijk zijn om klinisch 5 beheren. Bovendien heeft de diagnose van BV zich op het gebruik van Gramkleuringen van vaginale uitstrijkje uitstrijkjes die worden gescoord op verschillende numerieke criteria 6,7. Terwijl deze diagnose is eenvoudig, goedkoop, en goed geschikt voor gebieden met beperkte middelen, kan het last hebben van problemen met betrekking tot subjectieve interpretaties en het niet geven een gedetailleerd profiel van de samenstelling van de microbiota vaginale 8. Recente diepe sequencing inspanningen hebben aangetoond een rijke, gevarieerde vaginale microbiota metduidelijke verschillen tussen de monsters genomen van individuen die met BV gediagnosticeerd in vergelijking met de personen die worden beschouwd als normaal 9,10, hetgeen heeft geresulteerd in de identificatie van een aantal potentiële doelwitten voor moleculaire diagnose van BV 11,12. Deze studies hebben een schat aan nuttige informatie, maar diep sequencing is nog niet praktisch als een diagnostische methode in een klinische setting. We hebben onlangs een werkwijze beschreven voor het snel profilering van de vaginale microbiota in een multiplex formaat met behulp van oligonucleotide-gekoppeld fluorescerende kralen met detectie op een Luminex platform 13. Deze methode, als de huidige Gramkleuring-gebaseerde methoden, is snel en eenvoudig, maar voegt het extra voordeel van de exploitatie van moleculaire kennis die voortvloeit uit sequencing studies in probe design. Deze methode geeft daarom een ​​manier om de belangrijkste micro-organismen die aanwezig zijn in een vaginale uitstrijkje dat kan worden gebruikt om de BV diagnose met een hoge specificiteit en sensitiviteit comp profielared om Gramkleuring terwijl aanvullende informatie over de soorten aanwezigheid en overvloed in een semi-kwantitatieve en snelle manier. Deze multiplex methode is uit te breiden tot ver buiten het bereik van de huidige kwantitatieve PCR assays voor bepaalde organismen, die momenteel beperkt tot 5 of 6 verschillende assays in een enkel monster 14. Belangrijk is dat de methode niet beperkt tot de detectie van bacteriën in vaginale swabs en kan eenvoudig aangepast worden om snel het profiel van bijna alle microbiële gemeenschap van belang. Zo hebben we onlangs begonnen met deze methodiek van toepassing zijn op de ontwikkeling van diagnostische tools voor het gebruik in waterzuiveringsinstallaties.

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Bacteriële vaginose (BV) is een recidiverend polymicrobieel syndroom dat wordt gekenmerkt door een verandering in de "normale" microbiota, van een dominantie van Lactobacillus naar ...

Hallo, ik ben Tim Duso van Agriculture and AgriFood Canada. In deze video demonstreren we een protocol voor het bepalen van de aanwezigheid en overvloed van specifieke micro-organismen in een complexe klinische of milieu-monster met behulp van een Bio-Plex-instrument. Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende polystyreenkralen die chemisch gekoppeld zijn aan een soortspecifieke oligonucleotide-sonde.Er wordt een amplicon uit het monster gegenereerd met behulp van universele PCR-primers, waarna het amplicon wordt gehybridiseerd aan de probe-gekoppelde beads. Met het BioPlex-instrument worden twee signalen gegenereerd. Eén signaal identificeert de bead en het andere kwantificeert het hybridisatiesignaal.Het algemene doel van de procedure is om op een snelle en semi-kwantitatieve manier een profiel van de microbiota van belang te bepalen. We hebben deze techniek toegepast om bacteriële profielen in vaginale swabs te bepalen en de gegenereerde gegevens te gebruiken voor het diagnosticeren van bacteriële vaginose, een klinische aandoening die wordt gekenmerkt door een verandering in de microbiota waarbij lactobacillus-organismen minder prevalent worden en andere organismen, zoals Ga

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Source:Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company, Austin.This video demonstrates multiplexed quantitative bacterial detection employing carboxylated magnetic polystyrene microspheres dyed into distinct sets. The procedure encompasses the formation of bead-bacteria complexes, magnetic separation, and flow-based analysis, enabling precise and simultaneous quantification of multiple bacteria in the same reaction well.

Multiplexed Quantitative Bacterial Detection using Dye-Labeled Magnetic Microspheres

We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

Leer multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en milieumonsters met behulp van oligonucleotide-gekoppelde fluorescerende microsferen en Bio-Plex analyse.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen (Video) | JoVE Journal

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Meer video's verkennen