Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Hallo, ik ben Tim Duso van Agriculture and AgriFood Canada. In deze video laten we een protocol zien om de aanwezigheid en abundantie van specifieke micro-organismen in een complex klinisch of omgevingsmonster te bepalen met behulp van een bio plex instrument. Dit protocol gebruikt fluorescerende polystyreenkralen die chemisch gekoppeld zijn aan een soortspecifiek oligonucleotide sonde.

Een amplicon wordt gegenereerd uit het monster met behulp van universele PCR-primers en het amplicon wordt gehybridiseerd aan de sonde gekoppelde kralen. Twee signalen worden gegenereerd met het bio plex instrument. Een identificeert de kraal en een kwantificieert het hybridisatie signaal.

Het algemene doel van de procedure is om een profiel van de microbiële flora van belang snel en semi-kwantitatief te bepalen. We hebben deze techniek toegepast om bacteriële profielen in vaginale swabs te bepalen en gebruiken de gegenereerde gegevens om bacteriële vaginose te diagnosticeren, een klinische aandoening die wordt gekenmerkt door een verandering in de microbiële flora waarbij lactobacillen minder prevalent worden en andere organismen zoals Gardnerella, vais en apoian vae detecteerbaar worden in vaginale swabs. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat deze techniek echter kan worden toegepast op elke andere microbiële flora waarvoor een snelle multiplex-test wenselijk is.

Laten we beginnen met het beschrijven hoe de procedure werkt. Een microbieel profiel wordt gegenereerd door een eiwit en coaten van gen chaperone in 60 van alle organismen aanwezig in een DNA extract van de swab. Een van de universele amplificatieprimers is gemodificeerd door de toevoeging van biotin, evenals de opname van fosfo ate gemodificeerde basen.

Aan het vijf prime uiteinde wordt het amplicon enkelstrengs gemaakt met behulp van T zeven exon nuclease, dat alleen de antisense streng degradeert. Omdat de sense streng beschermd is door een fosfo ate gemodificeerde PCR-primer, worden oligonucleotide sondes complementair aan de resterende streng covalent gekoppeld aan fluorescerende polystyreenkralen. Met elke unieke kraalkleur die een sonde bevat die een ander organisme detecteert, kunnen tot honderd verschillende kralen worden gebruikt voor een enkel monster.

Het enkelstrengse PCR-product van de vaginale swab wordt gehybridiseerd aan een sonde gekoppelde kraalmengsel dat sondes bevat voor alle organismen van belang. Een fluorescerende reporter FICO etin wordt toegevoegd die bindt aan de biotinylerende sondes via een strep din conjugaat. Ten slotte wordt het hybridisatiemengsel geanalyseerd op een luminex of bio plex instrument, dat elke kraal afzonderlijk onderzoekt op identiteit en hybridisatie signaal.

De resultaten van deze analyse geven de aanwezigheid van specifieke micro-organismen aan en de intensiteit van het hybridisatie signaal correleert met de abundantie van dat organisme. In het monster kan de aanwezigheid van BV-gerelateerde organismen worden gebruikt om bv te diagnosticeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de grand stain, is dat informatie wordt gegenereerd over de aanwezigheid van specifieke micro-organismen en hun abundantie.

Het demonstreren van de procedure zal Jennifer Town zijn, een onderzoeksassistent in ons laboratorium, Re suspendeert de microspheres door ongeveer 20 seconden te vortexen. Breng 400 microliter microspheres over naar een einor buis, centrifugeer bij 14.000 keer G gedurende één minuut, verwijder en gooi de snat Resus weg. Suspendeer de microspheres in 50 microliter 0.1 molair MES pH 4.5.

Voeg een animo van capture oligo toe aan de microspheres en mix door te vortexen. Voeg 2,5 microliter verse EDC-oplossing toe aan de microspheres. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.

Gooi de EDC-oplossing die eerder werd bereid weg en bereid een verse monstersteek van 10 milligram per milliliter EDC in water. Voeg zoals hierboven nog eens 2,5 microliter verse EDC-oplossing toe aan de microspheres en vortex gedurende vijf seconden. Incubeer opnieuw bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.

Was de kralen door één milliliter 0.02% Tween 20 toe te voegen, vortex om de kralen op te schorten, centrifugeer bij 14.000 keer G gedurende één minuut, verwijder en gooi de supernatant weg. Was de kralen opnieuw door één milliliter 0.1% SDS toe te voegen. Suspendeer de kralen in 100 microliter te buffer.

Tel de kralen in een hemo cytometer om de stockconcentratie te bepalen. Bereid een microsphere master mix door elke kraal te verdunnen tot een eindconcentratie van 100 kralen per microliter in te buffer, pool de gekoppelde kralen volgens de gewenste plex van de test. Bewaar de microsphere master mix bij vier graden in het donker. Dit mengsel kan maanden worden bewaard als het onder deze omstandigheden wordt bewaard, genereer PCR product voor elk monster.

Voeg de fosfolaat en biotin gemodificeerde vijf prime primer set onmiddellijk toe nadat de PCR voltooid is. Voeg twee microliter T zeven exonuclease toe aan elke PCR buis, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Voeg aan het einde van deze incubatie 12,5 microliter 0.5 molair E-D-T-A-P-H 8.0 toe in mix.

Dit geeft een totaal van ongeveer 64,5 microliter enkelstrengs PCR product. Resus Bend Microsphere master mix met een pipet. Doseer een geschikte hoeveelheid in een einor buis.

Dicht de buis af en soniceer in een waterbad voor twee minuten. Doseer 17 microliter enkelstrengs PCR product in de juiste putjes van een laag profiel 96. Well plaat, voeg 33 microliter Resuspended Sonicated bead mengsel toe aan elk.

Dek de plaat af met een siliconen deksel en tik. Plaats de plaat voorzichtig in de thermocycler met een programma van 95 graden gedurende vijf minuten, 60 graden gedurende 10 minuten, 60 graden houden of pauze, 60 graden gedurende vijf minuten. Einde, start het programma.

Maak een verse strep Aden FICO Ethin oplossing. Je hebt 25 microliter per putje nodig. Maak strep en FICO etin door de stam te verdunnen tot één milligram per milliliter.

Een in 50 tot 20 microgram per milliliter met één keer tmac buffer. Wanneer de Thermocycler bij de 60 graden houdstap aankomt, open de