Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca ^{2 +} Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van in agar ingebedde retinale coupes voor de studie van de microcircuits in de presynaptische zenuwuiteinden van bipolaire cellen. Dit wordt bereikt door eerst de retina uit een donkergeadapteerd oog van een goudvis te verkrijgen en een klein rechthoekig stukje van deze retina uit te snijden. Het stukje retina wordt vervolgens ondergedompeld in een transparante agaroplossing met een laag smeltpunt, die vervolgens wordt gestold in een geschikte koude coupes-oplossing.

De volgende stap is het doorsnijden van het solide agarblok dat het rechthoekige stuk retina bevat met behulp van een vibratoom. De laatste stap is het visualiseren, identificeren en patchen van een axonale terminal van een bipolaire cel.

Uiteindelijk tonen de resultaten de presynaptische calciumstroom en de synaptische fysieke exocytose aan met membraancapaciteitsmetingen van geatomiseerde en intacte bipolaire celterminals. Hallo, mijn naam is Han Kim. Ik ben postdoc in het PCO-laboratorium van het Burham Institute.

Vandaag ga ik de voorbereiding van AGE-ingebedde coupes van de koude retinale facetten introduceren en de patchclamp-capaciteitsmeting bij een enkele pijplijn demonstreren. Om deze procedure te starten, worden de ogen van een goudvis gehalveerd door met een veerschaar gelijkmatig rond de voorkant van het oog te knippen. Plaats de oogcups vervolgens in gekoelde coupes-oplossing zonder calcium.

Verwijder indien nodig de lens met een pincet. Verwijder vervolgens het gepigmenteerde epitheel dat aan het netvlies vastzit door het netvlies met een fijne pincet met een hoek van 45 graden los te pellen van de oogbeker. Knip daarna de oogzenuw door met een fijne pincet of een veerschaartje.

Pas vervolgens zuigkracht toe met een aangepaste pasta-pipet of een grote transferpipet. Om de retina te verwijderen, verwijdert u voorzichtig de rest van het pigmentepitheel dat aan de retina vastzit. Het oppervlak van de gereinigde en gezonde retina moet er glad uitzien.

Behandel vervolgens het geïsoleerde netvlies gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur met ongeveer 0,03% IDE. Let erop dat de procedure voor het verwijderen van het glasachtig lichaam bij weinig licht moet worden uitgevoerd. Snijd in de volgende stap met een scheermesje een rechthoekig stukje netvlies van ongeveer twee bij twee millimeter uit, waarbij de gebogen randen worden verwijderd zodat de volledige dikte van het netvlies behouden blijft.

Breng vervolgens het stuk retina over naar een klein bakje gevuld met agarose-oplossing en probeer de hoeveelheid oplossing rond de retina te minimaliseren terwijl deze in de vloeibare agarose wordt geplaatst. Dompel de retina met de agarose vervolgens direct in de ijskoude slice-oplossing om de agarose te laten stollen. Snijd daarna het gestolde agaroseblok met het rechthoekige stuk retina in een kubus van één bij één bij één centimeter.

Plak het blok op het oppervlak van de snijplaat in de preco-snijkamer. Snijd het blok vervolgens in plakjes met een dikte van 200 tot 250 microns in de ijskoude snijoplossing. Met behulp van een vibrato kunnen in totaal vijf tot 10 plakjes worden verkregen, die ongeveer vijf tot zes uur levensvatbaar zijn.

Breng daarna een van de coupes over naar de registratiekamer. Plaats een U-vormig platina frame met een raster van nylon draden bovenop de coupe. Perfundeer de coupe continu met een snelheid van één tot twee milliliter per minuut met registratieoplossing waarin carbogeen is gebubbelt.

Gebruik in deze stap een spuit met een filtertip van 0,2 micron om de glazen patchpipet te vullen met interne oplossing tot een niveau van één tot twee centimeter vanaf de achterzijde van de pipet. Verwijder daarna eventuele luchtbellen uit de tip. Bevestig de pipet in de houder.

Oefen positieve druk uit op de pipet en beweeg deze met een micromanipulator naar de beoogde axonale terminal, terwijl de tip naar beneden door het weefselcoupe wordt bewogen. Beweeg de pipet in een zijwaartse vegende beweging om te voorkomen dat het weefselcoupe samen met de tip wordt meegesleept. Beweeg vervolgens de pipetpunt rond de terminal om het membraanoppervlak te reinigen.

Duw de pipetpunt naar beneden tegen de rand van de terminal om een inkeping te maken en laat de positieve druk los. Als er niet onmiddellijk een giga-ohm seal wordt gevormd, breng dan een lichte negatieve druk aan op de pipet. Zodra er een giga-ohm seal is gevormd, schakelt u de E PC nine patch clamp-versterker over naar de onsell-registratiemodus en verandert u het holdingpotentiaal naar min 60 of min 70 millivolt.

Pas de snelle capaciteitscorrectie toe en wacht tot de seal is gestabiliseerd tussen de vijf en 10 giga ohms. Ruptureer vervolgens het membraan met een korte, zachte zuigkracht om de whole-cell registratieconfiguratie vast te stellen.

U kunt ook mondzuigkracht gebruiken in plaats van een spuit. Nadat de configuratie van de gehele cel op een geatomiseerde MB-terminal is vastgesteld, brengt u een depolarisatiesprong van 200 milliseconden aan van minus 70 naar nul millivolt. Houd er rekening mee dat er vóór en na deze depolarisatie een sinusgolf van twee kilohertz in de voltage clamp-modus wordt toegepast. Om de membraancapaciteit te meten, maakt de depolarisatie de directe meting mogelijk van binnenwaartse calciumstromen die worden geactiveerd door de opening van spanningsafhankelijke L-type calciumkanalen met een cesiumgebaseerde interne oplossing.

Parallel hieraan kan men de capaciteitsprong monitoren die wordt veroorzaakt door de calciumafhankelijke exocytose van synaptische blaasjes, waardoor het membraanoppervlak toeneemt. Indien een intacte MB-bipolaire cel wordt gepatcht met de pipet op de synaptische terminal, zullen er geen waarneembare calciumstromen worden geobserveerd vanwege de grote lekstromen als gevolg van de gap-junction-koppeling in de dendrieten van de MB-bipolaire cellen. Wat men observeert, is een grote uitwaartse lekachtige stroom.

Men is echter nog steeds in staat om de sprong in capaciteit te monitoren met een hoogfrequente sinusvormige stimulus die vóór en na de getoonde depolarisatiestap wordt geactiveerd. Hier zijn de voorbeelden van I-R-D-I-C, beelden van M-bipolaire celterminals. Intacte terminals verschijnen vaker elliptisch, zoals getoond in A en B, terwijl C de geminimaliseerde terminal laat zien, die er rond en cirkelvormig uitziet.

De kleurstofvullingsmethode kan ook worden gebruikt om de celterminaties te classificeren. Hier zijn voorbeelden van fluorescentiebeelden van MBI-bipolaire celterminaties met een intact axon in D, een gedeeltelijk doorgesneden axon in e en een volledig verwijderd axon in F. Hun terminaties zijn aangegeven met de blauwe pijlen. Hier worden de directe metingen van calcium-imaging-signalen van exocytose en inhiberende feedback getoond.

In een MB-bipolaire celterminals werd een kortstondige stijging van de calciumconcentratie in de teleria van een MB-terminal geactiveerd door een voltage-clamp stapdepolarisatie; de overeenkomstige fluorescentieafbeelding van de MB-teleria is te zien in B. Voorbeelden van kortstondige synaptische depressie van neurotransmittervrijgave worden getoond in C. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de hoeveelheid oplossing rond het retina te minimaliseren wanneer deze in de kit-agar wordt geplaatst. Dit zal de hechting van de Latinized aan het agarbeblok verbeteren.