Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca ^{2 +} Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Het algemene doel van deze procedure is om agar-ingebedde retinale plakjes voor te bereiden voor de studie van de microcircuits die zich in de presynaptische bipolaire celzenuwuiteinden bevinden. Dit wordt bereikt door eerst de retina van een in het donker aangepaste goudvisoog te verkrijgen en een klein rechthoekig stukje van deze retina te snijden. Het retinale stukje wordt vervolgens ondergedompeld in een transparante agaroplossing met een laag smeltpunt, die vervolgens wordt gesolidificeerd in een lekker koude plaksoplossing.

De volgende stap is om de vaste agarblok die het rechthoekige stukje retina bevat, met een vibrator te snijden. De laatste stap is om een bipolaire celzenuwuiteinden te visualiseren, identificeren en patch. Klem.

Uiteindelijk laten de resultaten de pre-synaptische calciumstroom en synaptische fysieke exocytose zien met metingen van membraancapaciteit van geatomiseerde en intacte bipolaire celuiteinden. Hallo, mijn naam is Han Kim. Ik ben postdoc in PCO van het lab bij het Burham Institute.

Vandaag ga ik de AGA-ingebedde plakbereiding van koude gezichtsretina introduceren en de patch-clamp-capaciteitsmeting demonstreren bij een enkele pijplijn van. Om deze procedure te beginnen, hemis elk oog van een goudvis door gelijkmatig rond de voorkant van het oog te snijden met een paar veerscharen. Plaats vervolgens de oogbekers in gekoelde plakoplossing zonder calcium.

Verwijder indien nodig de lens met een pincet. Verwijder vervolgens het pigmentepitheel dat aan de retina is bevestigd door de retina van de oogbeker af te pellen met een paar 45 graden gebogen tip fijne forceps. Snijd daarna de oogzenuw door met een paar fijne forceps of veerscharen.

Breng vervolgens zuiging toe met een aangepaste pastapipet of een grote tip transferpipet. Om de retina te verwijderen, verwijdert u voorzichtig de rest van het pigmentepitheel dat aan de retina is bevestigd. Het oppervlak van de schoongemaakte en gezonde retina moet glad zijn.

Behandel vervolgens de geïsoleerde retina met ongeveer 0,03% hogere IDE gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Let erop dat de procedure moet worden uitgevoerd bij weinig licht om het glasvocht te verwijderen. In de volgende stap, snijdt u een rechthoekig stukje retina van ongeveer twee bij twee millimeter, dat de volledige dikte van de retina bevat door de gebogen randen met een scheermesje te verwijderen.

Breng vervolgens het retinale stukje over in een kleine container gevuld met agaroplossing en probeer de hoeveelheid oplossing rond de retina te minimaliseren terwijl deze in de vloeibare agar wordt geplaatst. Dompel vervolgens de retina met de agar direct in de ijskoude plakoplossing om de agar te solidificeren. Snijd vervolgens de vaste agarblok die het rechthoekige stukje retina bevat in een kubus van een bij een bij een centimeter.

Lijm de blok op het oppervlak van de snijplak in de preco-snijkamer. Snijd vervolgens de blok in plakken met een dikte van 200 tot 250 micron in de ijskoude plakoplossing. Met behulp van een vibrato kunnen in totaal vijf tot 10 plakken worden verkregen, die ongeveer vijf tot zes uur levensvatbaar zijn.

Breng vervolgens een van de plakken over naar de opnamekamer. Plaats een U-vormige platina frame met een raster van nylon draden op de plak. Perfundeer de plak continu met een snelheid van een tot twee milliliters per minuut met opnameoplossing gebubbeld met carbogen.

Gebruik in deze stap een spuit met een filtertip van 0,2 micron om de glazen patchpijp te vullen met interne oplossing tot een niveau van een tot twee centimeters van de achterkant van de pijp. Verwijder vervolgens de luchtbellen uit de tip. Bevestig de pijp in de houder.

Breng positieve druk aan op de pijp en beweeg deze naar het doelgerichte uiteinde met behulp van een micro manipulator terwijl de tip naar beneden door de plak wordt bewogen. Beweeg de pijptip in een zijwaartse zwaaiende richting om ervoor te zorgen dat de plak niet samen met de tip wordt getrokken. Beweeg vervolgens de pijptip rond het uiteinde om het membraanoppervlak te reinigen.

Duwt de tip naar beneden tegen de rand van het uiteinde om een kuiltje te maken en laat de positieve druk los. Als er geen giga ohm-afdichting onmiddellijk wordt gevormd, brengt u lichte negatieve druk aan op de pijp. Zodra een giga ohm-afdichting is gevormd, schakelt u de E PC negen patch clamp versterker naar de onsell-opnamemodus en verandert u het holdingpotentiaal naar min 60 of min 70 millivolts.

Pas de snelle capaciteitscorrectie toe en wacht tot de afdichting is gestabiliseerd tussen vijf tot 10 giga ohms. Scheur vervolgens het membraan met scherpe, zachte zuiging. Om een gehele celopnameconfiguratie tot stand te brengen.

U kunt ook mondzuiging gebruiken in plaats van een spuit. Nadat de gehele celconfiguratie is vastgesteld op een geatomiseerde MB-terminaal, past u een stapdepolarisatie van 200 milliseconden toe van min 70 tot nul millivolts. Onthoud dat een twee kilohertz sinusgolf in een spanningsklemmenmodus wordt toegepast voor en na deze depolarisatie. Om de membraancapaciteit te meten, maakt de depolarisatie de directe meting van inwaartse calciumstromen mogelijk die worden geactiveerd door het openen van spanningsafhankelijke L-type calciumkanalen met een cesium-gebaseerde interne oplossing.

Parallel kan men de capaciteitssprong monitoren die wordt veroorzaakt door de calciumafhankelijke exocytose van synaptische blaasjes, die het membraanoppervlak verhoogt. Als een intacte MB bipolaire cel is aangesloten met de pijp op het synaptische uiteinde, zullen er geen waarneembare calciumstromen worden waargenomen vanwege de grote lekkagestromen als gevolg van de gap junction-koppeling in de do rights van de MB bipolaire cellen. Wat men waarneemt, is een grote uitwaartse lekkage-achtige stroom.

Men kan echter nog steeds de capaciteitssprong monitoren met een hoge frequentie sinusvormige stimulus geactiveerd voor en na de gedepolariserende stap zoals getoond. Hier zijn de voorbeelden van I-R-D-I-C, afbeeldingen van M bipolaire celuiteinden. De intacte uiteinden zullen waarschijn