Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro

Het algemene doel van deze procedure is om organotypische plakjes te genereren uit de E 12.5 neuron embryonale middenhersenen voor de analyse van zich ontwikkelende dopaminerge neuronen. Dit wordt bereikt door eerst het embryonale brein te dissekeren. Vervolgens wordt het brein ingebed in low melting aeros.

De derde stap is om de hersenplakjes te snijden met behulp van een vibrator. De laatste stap is om de juiste hersenplak voor het kweken en time-lapse beeldvorming te kiezen. Uiteindelijk worden time-lapse beeldvorming en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de vroege stadia van dopaminerge neuronen, migratiegedrag en differentiatie te laten zien.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het neurodevelopmentale veld te beantwoorden, zoals het volgen van neuronen en migratiegedrag tijdens de ontwikkeling van de ventrale hersenen. Een dag voor de dissectie, bereid één X Krebs buffer en het kweekmedium voor volgens de bijbehorende handleiding ongeveer twee uur voor de dissectie. Bereid 100 milliliter van 4% low melting aros in Krebs buffer door de oplossing te magnetronnen tot de aros volledig is opgelost.

Plaats vervolgens de aros in een waterbad van 45 graden Celsius. Vul vervolgens de Vibram bufferlade met ijskoud Krebs buffer. Zet het koelelement aan en houd het op vier graden Celsius.

Bevestig vervolgens een scheermesje in de meshouders. Bereid een scalpel, een fijne verfkwast en een mini geperforeerde lepel voor om de plakjes op te pakken in het vibratorgebied voor latere sectie. Voeg vervolgens Krebs buffer toe aan de steriele petrischalen en bewaar ze op ijs.

In het dissectiegebied, bereid drie grote steriele petrischalen voor de dissectie en twee kleine steriele petrischalen voor het inbedden van een paar kleine schaar, twee paar fijne pincetten, een mini geperforeerde lepel, een glazen pipet gepolijst met een ronde gesloten punt en één liter Krebs buffer op ijs. Veeg alle dissectiegereedschappen af met 70% ethanol. Voeg vervolgens kweekmedium toe aan de putjes van een zes-putjesplaat en incubeer het gedurende twee uur op 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 1,5 milliliter Krebs buffer met penicilline-streptomycine toe aan elk putje van een andere zes-putjesplaat onder steriele omstandigheden. Plaats milli cell membraan inserts in de putjes. Plaats de zes-putjesplaat naast de vibrato zodat de hersenplakjes op de filtermembranen kunnen worden overgebracht.

Onmiddellijk na het snijden, offer een zwangere vrouwelijke muis met embryo's in stadium E 12,5 aan en verwijder de baarmoeder door deze met een paar pincetten omhoog te tillen. Gebruik vervolgens een ander paar pincetten om het myometrium van de baarmoeder los te scheuren. Plaats vervolgens de baarmoeder in ijskoud Krebs buffer onder de microscoop.

Gebruik een paar fijne pincetten om de spierwand van de baarmoeder, riker's membraan en de viscerale dooierzak van het embryo te scheiden. Verwijder vervolgens de embryo's uit de baarmoeder en verplaats het embryo naar een aparte petrischaal met steriele Krebs buffer. Knip vervolgens het hoofd van elk van de embryo's af.

Bevestig het hoofd door het op het oogniveau te prikken met een paar fijne pincetten. Gebruik een ander paar pincetten om voorzichtig de huid en de schedel te verwijderen. Til vervolgens de hersenen voorzichtig op en breng ze over in een petrischaal met steriele Krebs buffer.

Was vervolgens de hersenen in 4% Low melting point aros. Bedenk twee tot drie hersenen tegelijk in 4%verse, low melting point aros. Gebruik hiervoor een Pasteur pipet met ronde punt.

Plaats vervolgens de inbeddingsschalen zo gelijkmatig mogelijk op ijs. Til vervolgens de hersenen op totdat de onderkant van de aros is gestold, zodat de hersenen gelijkmatig kunnen bezinken en evenwijdig zijn aan de onderkant van de aros blok. Wanneer de aros volledig is gestold, trimt u de aros rond de hersenen.

Lijm vervolgens de aros blok op het monsterstadium van de vibrator. Zorg ervoor dat de ventrale kant van de hersenen evenwijdig is aan het platform. Snijd 300 micron dikke horizontale plakjes met een frequentie van 50 hertz, een mesamplitude van 1,1 millimeter en een snelheid van 25 millimeter per seconde.

Verzamel de hersenplakjes door de fijne verfkwast te gebruiken om de plak naar een mini geperforeerde lepel te duwen. Breng ze vervolgens onder de microscoop over naar een schaal met steriele ijskoude Krebs buffer. Kies de plak die ventrale middenhersenweefsel bevat.

Gebruik in deze stap een mini geperforeerde lepel en een fijne verfkwast om de hersenplakjes over te brengen naar milli cell membraan inserts in een zes-putjesplaat met Krebs buffer die eerder is voorbereid. Breng vervolgens de membranen met de plakjes over naar een andere zes. Putjesplaat met kweekmedium, houd de bovenkant van de membranen droog zodat de hersenplakjes medium van onderen en lucht van boven ontvangen.

Plaats de plakjes in een incubator met 5%kooldioxide op 37 graden Celsius. Het is erg belangrijk dat de plakjes binnen twee uur na de eerste stap van de dissectie in de incubator worden geplaatst. Deze plakjes kunnen drie tot vier dagen in vitro worden bewaard.

Na vier tot vijf uur herstel. De plakjes kunnen direct voorafgaand aan de beeldvorming worden gebruikt in time-lapse beeldvorming. Voeg 1,5 microliters, 200 millimolair ascorbinezuur toe aan de schaal om de plakjes te beschermen tegen fototoxiciteit.

Incubeer de plakjes in een omgevingskamer op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide tijdens time-lapse beeldvorming. Hier is een acute plak die de normale locatie van dopaminerge neuronen in de ventrale middenhersenen laat zien, waarin de projecties naar de voorhersenen nog niet zijn ontwikkeld. Na één dag in cultuur beginnen de projecties naar de voorhersenen zich te vormen, zoals aangegeven door de gele pijl.

Witte pijltjes wijzen op de locatie van de cellichamen die in hogere vergroting in de inzetstukken zijn getoond. Hier is de migratiewortel van YFP gelabelde neuronen. In een acute horizontale plak is de oorspronkelijke positie van de cellen gemarkeerd met een