Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van organotypische coupes uit het embryonale middenhersenen van E 12.5 neuronen voor de analyse van in ontwikkeling zijnde dopaminerge neuronen. Dit wordt bereikt door eerst de embryonale hersenen te dissekeren. Vervolgens worden de hersenen ingebed in laagsmeltende aeros.

De derde stap is het snijden van de hersenplakken met behulp van een vibratoom. De laatste stap is het selecteren van de juiste hersenplak voor kweek en time-lapse imaging. Ten slotte worden time-lapse imaging en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de vroege stadia van dopaminerge neuronen, het migratiegedrag en de differentiatie aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neuro-ontwikkeling, zoals het volgen van neuronen en migratiegedrag tijdens de ontwikkeling van de ventrale hersenen. Eén dag voor de dissectie wordt de 1X Krebs-buffer bereid, en het kweekmedium wordt ongeveer twee uur voor de dissectie klaargemaakt volgens het bijbehorende manuscript. Bereid 100 milliliter 4% low melting agarose in Krebs-buffer door de oplossing in de magnetron te verhitten tot de agarose volledig is opgelost.

Plaats vervolgens de aros in een waterbad van 45 °C. Vul daarna de bufferbak van de Vibram met ijskoude Krebs-buffer. Schakel het koelelement in en houd dit op vier °C.

Bevestig daarna een scheermesje in de meshouder. Bereid een scalpel, een fijn penseel en een kleine geperforeerde lepel voor om de plakjes in het vibratiegebied op te pakken voor de latere sectie. Voeg vervolgens Krebs-buffer toe aan de steriele Petrischalen en bewaar deze op ijs.

Bereid in het dissectiegebied drie grote steriele Petrischalen voor de dissectie en twee kleine steriele Petrischalen voor het inbedden voor, samen met een klein schaartje, twee fijne pincetten, een mini geperforeerde lepel, een vuurgepolijste glazen Pasteurpipet met een ronde gesloten tip en één liter Krebs-buffer op ijs. Veeg alle dissectie-instrumenten af met 70% ethanol. Voeg vervolgens kweekmedium toe aan de wells van een six-well plaat en incubeer deze twee uur lang bij 37 °C.

Voeg vervolgens onder steriele omstandigheden 1,5 milliliters Krebs-buffer met penicilline streptomycine toe aan elke put van een andere zesputjesplaat. Plaats milli-celmembraaninserts in de putjes. Plaats de zesputjesplaat naast de vibrato, zodat de hersensnijjes kunnen worden overgebracht naar de filtermembranen.

Offer direct na het maken van de coupes een drachtige vrouwelijke muis met embryo's in stadium E 12.5 en verwijder de uterus door deze met een pincet op te tillen. Gebruik vervolgens een tweede pincet om het myometrium van de uterus te scheuren. Plaats de uterus daarna onder de microscoop in ijskoude Krebs-buffer.

Gebruik een fijne pincet om de spierwand van de uterus, het vliez van Riker en de viscerale dooierzak van het embryo te scheiden. Verwijder vervolgens de embryo's uit de uterus en breng het embryo over naar een aparte Petrischaal met steriele Krebs-buffer. Snijd daarna de kop van elk van de embryo's af.

Fixeer de kop door deze op ooghoogte te doorboren met een fijne pincet. Gebruik een tweede pincet om voorzichtig de huid en de schedel te verwijderen. Til vervolgens de hersenen voorzichtig op en breng deze over naar een Petrischaal met steriele Krebs-buffer.

Was daarna de hersenen in 4% Low melting point agarose. Bed your twee tot drie hersenen tegelijk in 4% verse, low melting point agarose. Gebruik hiervoor een Pasteurpipet met een vuurgepolijste ronde punt.

Plaats vervolgens de inbeddingsschalen zo gelijkmatig mogelijk op ijs. Til de hersenen daarna op totdat de bodem van de aros is gestold, zodat de hersenen gelijkmatig kunnen bezinken en parallel komen te liggen aan de bodem van het aros-blok. Wanneer de aros volledig is gestold, wordt de aros rondom de hersenen weggesneden.

Lijm daarna het blok op de objecttafel van het vibratoom. Zorg bij het vastlijmen van het blok dat de ventrale zijde van de hersenen parallel aan het platform ligt. Neem horizontale coupes van 300 micron dikte bij een frequentie van 50 hertz, een mesamplitude van 1,1 millimeter en een snelheid van 25 millimeter per seconde.

Verzamel de hersensecties door met het fijne penseel de sectie naar een kleine geperforeerde lepel te duwen. Draag ze vervolgens onder de microscoop over naar een schaaltje met steriele, ijskoude Krebs-buffer. Selecteer de sectie die ventraal middenhersenweefsel bevat.

Gebruik bij deze stap een kleine geperforeerde lepel en een fijn penseel om de hersensecties over te brengen naar milli cell-membraaninserts in een zes-wells plaat met Krebs-buffer die eerder is bereid. Breng vervolgens de membranen met de secties over naar een andere zes-wells plaat met kweekmedium; houd de bovenkant van de membranen droog, zodat de hersensecties medium van onderen en lucht van boven ontvangen.

Plaats de plakjes in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C. Het is zeer belangrijk dat de plakjes binnen twee uur na de eerste stap van de dissectie in de incubator worden geplaatst. Deze plakjes kunnen gedurende drie tot vier dagen in vitro worden onderhouden.

Na vier tot vijf uur herstel kunnen de coupes vlak voor de beeldvorming worden gebruikt voor time-lapse imaging. Voeg 1,5 µL 200 mM ascorbinezuur toe aan de schaal om de coupes te beschermen tegen fototoxiciteit.

Incubeer de coupes in een environmental chamber bij 37 °C met 5% koolstofdioxide tijdens de time-lapse imaging. Hier is een acute coupe die de normale locatie van dopaminerge neuronen in de ventrale middenhersenen laat zien, waarin de projecties naar de voorhersenen zich nog niet hebben ontwikkeld. Na één dag in cultuur beginnen de projecties naar de voorhersenen zich te vormen, zoals aangegeven door de gele pijl.

Witte pijlpunten geven de locatie aan van de cellichamen die met een hogere vergroting in de insets worden getoond. Hier is de migratieroute van YFP-gelabelde neuronen te zien. In een acute horizontale coupe is de initiële positie van de cellen gemarkeerd met een rode pijlpunt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u genotypische coupes bereidt van het embryonale middenbrein van een marien organisme in stadium E 12.5 om levensvatbare en intacte coupes te verkrijgen. Het is belangrijk om de dissectie van het embryonale brein zorgvuldig uit te voeren en na het vibratoomsnijden de juiste breincoupe te kiezen voor cultivering en time-lapse-beeldvorming.