Name: Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Leer ROS-detectie in celculturen voor kankeronderzoek met fluorescentie-, colorimetrische en luminescente assays. Deze methoden meten oxidatieve stress en glutathionstatus effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (CA142664).

1. Detectie van ROS gebruik van carboxy-H 2 DCFDA Carboxy-H 2 DCFDA is niet-fluorescerende, maar in de aanwezigheid van ROS, wanneer dit reagens is geoxideerd, wordt het groen fluorescerend. <ol><li> Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, bereiden een verse voorraad oplossing van carboxy-H 2 DCFDA in steriele dimethylsulfoxide (DMSO) of 100% ethanol. Vermijd meerdere dooi / vries-cycli van de kleurstof. </li><li> Was de cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HBSS) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om sporen van de oorspronkelijke medium te verwijderen. </li><li> Laad de cellen met de kleurstof (en de controle kleurstof, zie noot sectie). In deze test gebruikten we Jurkat, een menselijke leukemie cellijn. Gebruik carboxy-H 2 DCFDA bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM in de reguliere kweekmedium met verminderde serum (2%). </li><li> Incubeer de culturen gedurende 30 minuten in het donker, in een conventionele incubator (37 ° C, 5% CO2). Gooi alle ongebruikte kleurstof oplossingen. </li><li> Verwijder carboxy-H 2 DCFDA bevattend medium en was twee keer met HBSS of PBS. Vanaf deze stap voorwaarts, beschermen je cellen tegen licht. </li><li> Voeg vers medium met uw geneesmiddel van keuze om de carboxy-H 2 DCFDA-geladen cellen en incubeer zoals gewenst. Voor dit voorbeeld gebruiken we H 2 O 2 (0.03%) gedurende 1 uur. </li><li> Beoordeel ROS door onmiddellijk het analyseren van uw cellen door flowcytometrie met behulp van de FL1 kanaal (groene fluorescentie), of met behulp van fluorescentie plaat lezer, of met behulp van fluorescentie microscopie. De fluorescentie kan worden gedetecteerd door gebruik te maken excitatie en emissie golflengtes die geschikt zijn voor groene fluorescentie. </li></ol> Let op: Controles dienen te bestaan ​​carboxy-H 2 DCFDA-geladen onbehandelde cellen en ongekleurde onbehandelde cellen. Carboxy-H 2 DCFDA is bekend om peroxiden te sporen, maar kan ook worden geoxideerd door andere ROS. Dit reagens kan ook worden gewijzigd door andere middelen, oxidatie ongevoelig controle kleurstof, zoals 5 - (en-6)-carboxy-2 ', 7'-dichloorofluorescein diacetaat (carboxy-DCFDA) moet daarom worden opgenomen in de test. 2. Meten van stikstofmonoxide (NO) productie U moet sulfanilamide en N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (NED) oplossingen, en nitriet standaard. Deze test heet de Griess test. NED oplossing: Maak een 0,1% oplossing van N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride verdund in een steriele water.Sulfanilamide oplossing: Maak een 1% oplossing van sulfanilamide verdund in 5% fosforzuur. Nitriet Standaard: Verdun de 0,1 M standaard voorraad natriumnitriet op 100 urn in een steriele medium, een seriële verdunning doen in hetzelfde medium. Opslag: Bewaren chemicaliën zoals aangegeven door de fabrikant bij kamertemperatuur. Na reconstitutie, zijn NED en sulfanilamide oplossingen opgeslagen onmiddellijk na het gebruik bij 4 ° C, in het donker, en voor een maximum van 3 maanden. <ol><li> Cultuur cellen in een 96 well plaat,gebruik triplo voor elke aandoening, en omvatten een goede controle op basis van uw experimenten. </li><li> Behandel cellen om NO productie te induceren. In ons experiment gebruiken we lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) en recombinant IL-4 naar onze cellen te behandelen. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt RAW 264,7, een muis macrofaag cellijn (Mouse leukemische monocyte macrofaag cellijn). </li><li> Op de dag van de test, brengen beide reagentia op kamertemperatuur. </li><li> Spin je bord, verzamel celsupernatanten en overdracht 50μl aan een nieuwe plaat met 96 putjes. Bereid beperkende verdunning putten van uw standaard voorraad oplossing voor een standaard curve te maken. </li><li> Voeg 50μl van sulfanilamide oplossing voor elk monster en controle goed en meng goed. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. </li><li> Voeg 50μl van N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride oplossing voor elk monster en controle goed en meng goed. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. </li><li> Meten absorbance onmiddellijk behulp van een plaat reader met filter van golflengtes tussen 520nm en 550nm. </li></ol> Als u gebruik maken van verschillende bord / schaaltje maten, gebruik 1/1/1 volume voor elke oplossing en monster supernatant. Een violette kleur verschijnt in het positieve putten. Resultaten verkregen met de standaard zal helpen u de stabiliteit van uw oplossingen. 3. Detectie van ROS actie: geoxideerde eiwitten Een andere methode om de productie van ROS te identificeren is aan het eind resultaten zien er door het detecteren van de oxidatie van eiwitten. Inderdaad, ROS wijzigen glutathion, een antioxidant die wordt uitgedrukt in de meeste cellen en speelt een beschermende rol tegen ROS. Naar aanleiding van oxidatie door ROS, wijziging van het gereduceerd glutathion (GSH) resulteert in de sulfhydryl (thiol) groep van de cysteïne wordt gekoppeld aan een seconde glutathion via een disulfide brug. Dit leidt tot de vorming van een gedimeriseerde eiwit (geoxideerd eiwit GSSG). GSH kan worden hersteld via een wijziging van GSSG door het enzym glutathion reductase. De toename van de GSSG / GSH ratio weerspiegelt oxidatieve stress. De volgende test is gebaseerd op de detectie en kwantificering van deze geoxideerde eiwitten. Deze methode is niet selectief voor specifieke ROS, maar detecteert de effecten van NO, H 2 O 2, O 2 - en andere ROS. Hier meten we de totale hoeveelheid geoxideerd (GSSG) en gereduceerd (GSH) met behulp van glutathion bioluminescente signalen. <ol><li> Seed je cellen in een 96 well plaat (wit / transparant, platte bodem), zoals gewoonlijk. Voor ons experiment gebruikten we 1x10 4 cellen per putje voor aanhanger Raw 264,7 en A549 cellen en vering Jurkat cellen. Afhankelijk van de grootte van je cellen deze nummers kunnen worden aangepast. Wij raden u aan bord hechtende cellen de dag voor de test om hen in staat stellen te hechten aan de plaat. Genoeg putten moeten worden voorbereid om geoxideerd en gereduceerd eiwitdetectie alsook voor "medium only" enonbehandelde cellen als controle. Gebruik triplo voor alle omstandigheden. </li><li> Behandel uw cellen met uw geneesmiddel voor de vereiste tijd. Hier hebben we Jurkat cellen en A549 cellen voor 1 uur behandeld met H 2 O 2 (bij 5 mm en 2,5 mm respectievelijk). Raw 264,7 cellen werden behandeld met 200ng/ml van LPS voor 16 uur Tijdens deze incubatietijd, breng al je reagentia op kamertemperatuur (RT). Maak alle reagentia niet meer dan 30 minuten voor het uitvoeren van de test. De tabel hieronder toont de volumes van de reagentia per goed. Als het mogelijk is, is het belangrijk om te verwijderen van de media die het reductiemiddel alvorens verder te gaan met de test. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> Hechtende cellen </td><td colspan="2"> Suspensie-cellen </td></tr><tr><td> Totaal Glu Lysis </td><td> Geoxideerd Glu Lysis </td><td> Totaal Glu Lysis </td><td> Geoxideerd Glu Lysis </td></tr><tr><td> NEM, 25mm </td><td> geen </td><td> 0.5μl </td><td> geen </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Luciferine-NT </td><td> 1 pi </td><td> 1 pi </td><td> 1 pi </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Passieve Lysis Buffer, 5x </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Gedistilleerd water </td><td> 39.0μl </td><td> 38.5μl </td><td> 14μl </td><td> 13.5μl </td></tr><tr><td> Eindvolume per goed </td><td> 50μl </td><td> 50μl </td><td> 25μl </td><td> 25μl </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Verwijder medium van putten met hechtende cellen. Verwijder geen medium in putten met vering cellen. </li><li> Voeg gereduceerd glutathion lysis reagens of geoxideerde glutathione lysis reagens om de corresponderende putten en schud gedurende 5 minuten bij RT. </li><li> Voeg de Luciferine generatie reagens en incubate gedurende 30 minuten bij RT. </li><li> Voeg de Luciferine detectie reagens en incubeer gedurende 15 minuten bij RT. </li><li> Lees de lichtgevende signaal op de integratie tijd van 0,25 tot 1 seconde per putje behulp van een plaat lezer luminometer. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Hechtende cellen </td><td> Suspensie-cellen </td></tr><tr><td> Aantal cellen per goed </td><td> 1x10 4 </td><td> 1x10 4 </td></tr><tr><td> Celsuspensie per goed + drugs </td><td> 100 ul, worden verwijderd voordat 3.4 </td><td> 25μl, om niet te worden verwijderd </td></tr><tr><td> Gereduceerd glutathion Lysis Reagens </td><td> 50 ul </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Geoxideerde glutathione Lysis Reagens </td><td> 50 ul </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Luciferine Generation Reagens </td><td> 50 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Luciferine Detectie Reagens </td><td> 100 pi </td><td> 100 pi </td></tr></tbody></table> 4. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Detectie van ROS gebruik van carboxy-H2DCFDA kleurstof. Jurkat cellen (humane leukemie cellijn) behandeld met H 2 O 2 werden vergeleken met niet-behandelde cellen. ROS induceert de wijziging van carboxy-H 2 DCFDA dat licht groen zoals gedetecteerd door flowcytometrie, de tl-piek in H 2 O 2 behandelde cellen verschuiving ten opzichte van de pieken in de controlegroep (H 2 O 2 behandelde cellen gekleurd met oxidatie ongevoelige kleurstof en niet- -behandelde cellen gekleurd met carboxy-H 2 DCFDA). Resultaten bevestigen de aanwezigheid van de ROS in de behandelde cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Detectie of GEEN gebruik van Griess reagentia. RAW 264.7 cellen (muis macrofaag) werden behandeld met LPS en IL-4. Een significante toename in de NO productie werd waargenomen in behandelde cellen in vergelijking met onbehandelde cellen te controleren. <table border="1"><tbody><tr><td> Cellijnen </td><td> Niet-behandelde </td><td> Behandelde </td></tr><tr><td> Raw 264,7 </td><td> 13,0 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 21,6 </td><td> 10,5 </td></tr><tr><td> Jurkat </td><td> 5.2 </td><td> 2.8 </td></tr></tbody></table> Tabel 1 Detectie van ROS gemedieerde oxidatie van eiwitten. RAW 264.7 cellen werden behandeld met LPS, Jurkat en A549 (menselijke long kanker) cellen werden behandeld met H 2 O 2. Resultaten worden uitgedrukt als de verhouding gereduceerd (GSH) / geoxideerd (GSSG) glutathion. Lagere ratio's van glutathion (GSH) / (GSSG) werden ontdekt in behandelde cellen in vergelijking metcontrole onbehandelde cellen, waaruit blijkt dat eiwitten werden meer geoxideerd in behandelde cellen.

<ol><li>Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+superoxide+in+inflammation+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation.</a> J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).</li>
<li>Perl, A., Gergely, P., Banki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+T+cells+of+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus.</a> Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).</li>
<li>Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CD4+D3-D4+membrane+proximal+extracellular+domain+for+the+inhibitory+effect+of+oxidative+stress+on+activation-induced+CD4+down-regulation+and+its+possible+role+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation.</a> Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).</li>
<li>Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+as+a+potent+activator+of+T+lymphocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions.</a> Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).</li>
<li>Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule+1+%28VCAM-1%29+activation+of+endothelial+cell+matrix+metalloproteinases%3A+role+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species.</a> Blood. 104, 2385-2393 (2004).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).</li>
<li>Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+kinase+activity+and+gene+expression+by+reactive+oxygen+species+and+their+role+in+vascular+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).</li>
<li>Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+enhance+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity.</a> Cell Metab. 10, 260-272 (2009).</li>
<li>Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+paradox%3A+insulin+action+is+facilitated+by+insulin-stimulated+reactive+oxygen+species+with+multiple+potential+signaling+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets.</a> Diabetes. 54, 311-321 (2005).</li>
</ol>

We kregen de steun van Promega voor deze publicatie.

Verschillende pathologische situaties, zoals inflammatoire ziekten, kanker, ischemie / reperfusie, en ook behandelingen zoals bestraling of chemotherapie (dat wil zeggen cisplatine) veroorzaken ROS overproductie. Zo, het opsporen en het meten van ROS niveaus is belangrijk in veel basic, pre-klinische en klinische studies. Echter, ROS hebben zeer korte halfwaardetijd en kan ingewikkeld op te sporen. Hier stellen we voor eenvoudige tests die routinematig worden gebruikt en algemeen aanvaard voor de detectie van de vrije r...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> 5 - (en-6)-carboxy-2 &#39;, 7&#39;-dichloorfluoresceïne diacetaat (carboxy-DCFDA) </td><td> Molecular Probes </td><td> C369 </td><td> controle </td></tr><tr><td> carboxy-H 2 DCFDA </td><td> Molecular Probes </td><td> C400 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfanilamide </td><td> Sigma </td><td> S9251-100G </td><td></td></tr><tr><td> N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride </td><td> Sigma </td><td> N9125-10G </td><td></td></tr><tr><td> Nitriet standaard </td><td> Sigma </td><td> 237213-100G </td><td></td></tr><tr><td> GSH / GSSG-Glo Assay </td><td> Promega </td><td> V6612 </td><td> Te kwantificeren geoxideerd, gereduceerd of geoxideerd / gereduceerd glutathion </td></tr></tbody>
</table>

productie en detectie van reactive oxygen species (ros) in kanker

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactieve zuurstof soorten zijn een aantal moleculen die schade DNA en RNA en oxideren eiwitten en lipiden (lipiden peroxydation). Deze reactieve moleculen bevatten een zuurstof-en onder meer H 2 O 2 (waterstofperoxide), NO (stikstofoxide), O 2 - (oxide anion), peroxynitriet (Onoo -), hydrochlorous zuur (HOCl) en hydroxyl radicaal (OH -) . Oxidatieve soorten worden geproduceerd niet alleen onder pathologische omstandigheden (kanker, ischemische / reperfusie, neurologische en cardiovasculaire aandoeningen, infectieziekten, ontstekingsziekten 1, 2 auto-immuunziekten, etc ...) maar ook tijdens fysiologische (niet-pathologische) situaties, zoals cellulaire stofwisseling 3 , 4. Inderdaad, ROS spelen een belangrijke rol in vele cellulaire signaalwegen (proliferatie, cel activatie 5, 6, 7 migratie etc..). ROS kan nadelig worden (het is dan bedoeld als&quot;Oxidatieve en nitrosatieve stress&quot;), wanneer deze wordt geproduceerd in grote hoeveelheden in de intracellulaire compartimenten en cellen in het algemeen reageren op de ROS door opregulerende anti-oxidanten, zoals superoxide dismutase (SOD) en catalase (CAT), glutathion peroxidase (GPX) en glutathion (GSH) dat beschermt hen door het omzetten van gevaarlijke vrije radicalen tot onschadelijke verbindingen (dat wil zeggen water). Vitamine C en E zijn ook beschreven als ROS (anti-oxidanten). Vrije radicalen zijn gunstig in lage hoeveelheden 3. Macrofagen en neutrofielen-gemedieerde immuunrespons betrekking hebben op de productie en afgifte van NO, die virussen, ziekteverwekkers en tumorcellen proliferatie 8 remt. GEEN reageert ook met andere ROS en dus, heeft ook een rol als een detoxifier (ROS aaseter). Eindelijk geen handelingen op schepen om de bloedstroom die van belang is voor de aanpassing van de spier om langdurige oefening 9, 10 reguleren. Verschillende publicaties hebben ook aangetoond dat ROS betrokken zijn bij insuline sensitivity 11, 12. Tal van methoden om de ROS productie te evalueren zijn beschikbaar. In dit artikel stellen we een aantal eenvoudige, snelle en betaalbare testen, deze testen zijn gevalideerd door de vele publicaties en worden routinematig gebruikt om de ROS of de gevolgen ervan op te sporen in zoogdiercellen. Hoewel sommige van deze testen te detecteren meerdere ROS, anderen te detecteren slechts een ROS.

Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden voor het testen en evalueren van de aanwezigheid van reactieve zuurstofradicalen in de cellen.

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Reactieve zuurstofcomponenten omvatten een aantal moleculen die DNA en RNA beschadigen en eiwitten en lipiden oxideren (lipidperoxidatie). Deze reactieve ...

Het doel van dit experiment is het detecteren van de aanwezigheid van reactieve zuurstofverbindingen in celculturen. Dit wordt bereikt door eerst reactieve zuurstofverbindingen aan te tonen met behulp van een fluorescerende kleurstof. Vervolgens worden de stikstofoxideniveaus in de cellen gemeten met een colorimetrische assay.Ten slotte wordt het effect van reactieve zuurstofsoorten bepaald door de reductie of oxidatie van glutathion aan te tonen met behulp van een luminescentie-assay. Mijn naam is Danu. Ik ben postdoc in het laboratorium van Patrizia Yoda en ik zal deze procedure demonstreren.Carboxy H 2D CFDA is niet fluorescent, maar in aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten wordt dit reagens geoxideerd en fluoresceert het groen vlak voor gebruik. Bereid een verse stamoplossing van carboxy H 2D CFDA in steriel DMSO of 100%ethanol. Was de cellen met HEPs-gebufferde zoutoplossing of fosfaatgebufferde zoutoplossing om resten van het oorspronkelijke medium te verwijderen.In deze assay gebruiken we de humane leukemie Jurkat-cellijn. Centrifugeer de cellen en gooi het supernatant weg. Label de cellen met de kleurstof tot een eindconcentratie van 1 µM in regulier kweekmedium met ve

production-and-detection-of-reactive-oxygen-species-ros-in-cancers

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the protocol for detecting total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method helps visualize ROS localization in the adherent cells using a fluorescence microscope and further quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader.

ROS Detection with DCFH-DA Staining: Measuring Total ROS in Colorectal Cancer Cell Lines

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.

In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model

Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Het doel van dit protocol is om voorbijgaande in vivo productie van niet-dodelijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren, waardoor fysiologische reacties in het weefsel verder worden bevorderd.

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Hier beschrijven we een methode voor de real-time detectie van apoplastische reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie in rijstweefsels in pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuunrespons. Deze methode is eenvoudig, gestandaardiseerd en genereert zeer reproduceerbare resultaten onder gecontroleerde omstandigheden.

Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Leer ROS-detectie in celculturen voor kankeronderzoek met fluorescentie-, colorimetrische en luminescente assays. Deze methoden meten oxidatieve stress en glutathionstatus effectief.

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Meer video's verkennen