Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII
January 30th, 2012
Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende C. elegans Het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in C. elegans Om het milieu worden blootgesteld neuronen te visualiseren. Met dit geoptimaliseerde protocol, zijn alae en ringvormige structuren cuticulair gekleurd door DII en geobserveerd met behulp van microscopie compound.
Het algemene doel van deze procedure is om de cuticula te visualiseren in transparante levende zee-elegantie met behulp van de rode fluorescerende lipofiele kleurstof dye eye. Dit wordt bereikt door een populatie nematoden voor te bereiden voor kleuring. Vervolgens wordt verdunde dye eye toegevoegd aan de populatie en worden ze geïncubeerd.
Vervolgens worden de dieren uit de kleuringsoplossing teruggewonnen. Fluorescerende beeldvorming van de Dai gekleurde cuticula toont details op het oppervlak, inclusief Ailey en Ann oog reproductieve structuren en andere externe morfologische kenmerken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden voor het visualiseren van cuticula in dit transparante organisme zoals directe beeldvorming, fluorescentie, transgenexpressie, antilichaamkleuring, elektronenmicroscopie en gelabelde tarwekiem-agglutinine is dat deze techniek gemakkelijk uit te voeren is, relatief snel en goedkoop, en geeft een prachtige resolutie van cuticulaire structuren in levende dieren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in vele vakgebieden die het zee-elegantie modelsysteem en zijn cuticula gebruiken, zoals celsecretie en cuticula-organisatie, ontwikkeling van epidermale cellen, heterochrone genpaden, aangeboren immuniteit, ontwikkeling van morfologische kenmerken en nematode-evolutie. Het demonstreren van de procedure zal Robbie Schultz zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Houd er rekening mee dat wanneer u met D Eye werkt, het lichtgevoelig is.
Bescherm D eye altijd tegen licht door het in folie te wikkelen. Draag ook handschoenen en een laboratoriumjas, aangezien DMF giftig is en DAI een auto is. Cyanide Dai is erg krachtig.
Een standaard werkconcentratie is 30 microgram per milliliter van DII in M negen, en een enkele populatie vereist slechts 400 microliters van de werkconcentratie. Begin met een 60 millimeter plaat bevolkt met onbesmette nematoden. Was de dieren van de plaat in 1,5 milliliter 0,5% Triton X 100.
In M negen buffer, zwiep het vloeistof voorzichtig in cirkelvormige bewegingen om alle larvale en volwassen dieren los te maken, en breng vervolgens de was naar een 1,5 milliliter buisje. Centrifugeer de dieren onmiddellijk bij 2000 RPM gedurende 30 seconden om dieren op de bodem van het buisje te verzamelen. Gooi zoveel mogelijk supernatant weg zonder de dieren te storen.
Wees voorzichtig, niet hebzuchtig. Was dieren met één milliliter van M negen. Centrifugeer en verwijder het supernatant.
Herhaal de was. Centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 400 microliters van 30 microgram per milliliter van Dai in M negen toe aan het buisje.
Vortex het buisje kort om de dieren opnieuw op te schorten. Schud vervolgens het buisje gedurende drie tot 16 uur bij 20 graden Celsius in een horizontale positie op 350 RPM in een lichtbeschermde omgeving. Het tijdstip van deze laatste stappen is belangrijk.
Eerst moet het Triton X worden weggespoeld voordat het de lipiden wegneemt waaraan de dai zich bindt. Ten tweede moeten de dieren lang genoeg in dye eye-oplossing worden gekleurd om de cuticula uniform te kleuren. Even later moeten de dieren lang genoeg op voedsel worden geplaatst om ongebonden eye te verwijderen.
Aan het einde van de kleuring, centrifugeer de dieren en verwijder de kleuroplossing. Was de dieren met één milliliter van M negen. Om ongebonden kleurstof te verwijderen, centrifugeer de dieren en verwijder het supernatant.
Hersuspendeer de dieren in 400 microliters van M negen buffer en giet ze op een bacterievrij deel van een NGM microplaat. Geïncubeerd met OP 50 E Coli, laat dieren zich in het donker herstellen gedurende ten minste 30 minuten, maar niet langer dan een dag omdat de kleurstoffluorescentie tijdens de hersteltijd vervaagt. De dieren moeten wegkrullen van de kleurstofkleuringsvloeistof en op het voedsel.
Deze dieren zijn gemakkelijker om te beeldvormen omdat ze minder achtergrondfluorescentie hebben van vrije dye eye. Begin met het voorbereiden van een agri pad op een dia. Zorg voor een uniforme dikte van de agri pad die wordt gebruikt. Twee ruimtemakers.
Een ruimtemaker wordt gemaakt door twee stukken lab tape op een glazen plaat te plaatsen. Ruimtemakers kunnen oneindig worden gebruikt. Plaats vervolgens een schone glazen plaat lengtelings tussen twee ruimtemakerplaten, pipet ongeveer 150 microliters van gesmolten vier agar.
Op het midden van de schone glazen plaat. Bedek de gesmolten AER snel met een extra plaat geplaatst loodrecht op de AER en beide ruimtemakers om een agar pad te vormen. Schuif voorzichtig de dekplaat weg, waarbij de pad gecentreerd blijft op de bovenkant van de montageplaat.
Pipet nu vijf microliters van nematode anesthesie op de pad. Monteer acht tot 12 dieren in het anesthesie en dek voorzichtig af met een microscoopdekje. Observeer de dieren met behulp van een compound of confocale microscoop uitgerust met minimaal een 40 x objectief en een trissy-filter of ander compatibel filter. De maximale fluorescentie-excitatieverlichting van dye eye is 549 nanometer en de maximale emissieverlichting is 565 nanometer.
Voor gebonden dierbeeldvorming is het de meest uitdagende onderdeel van dit protocol. We laten zien hoe dieren worden gemonteerd voor beeldvorming, maar je moet goed getraind zijn op de compound of confocale microscoop die je zult gebruiken. We vonden dat het gebruik van een objectief met minimaal 60 x vergroting het beste is om de details op te lossen die door de kleuringsmethode worden verlicht.
Elk van de afbeeldingen in deze sectie is gemaakt met behulp van een 63 x objectief in poster embryonale zee-elegantie. Het cuticulaoppervlak bevat jaarlijks gescheiden door cirkelvormige groeven en in sommige stadia longitudinale richels genaamd ailey. Elke afbeelding in deze sectie is gemaakt met een 63 x objectief in post embryonale C elegance.
Het cuticulaoppervlak bevat geannualiseerd gescheiden door cirkelvormige groeven en in sommige stadia longitudinale richels genaamd aley. Elke ontwikkelingsfase heeft cuticulastructuren met verschillende composities
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het visualiseren van de cuticula in levende C. elegans met behulp van de rode fluorescerende lipofiele kleurstof DiI. Het geoptimaliseerde protocol maakt het mogelijk om alae en annulaire cuticulaire structuren waar te nemen door middel van samengestelde microscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het visualiseren van cuticula in transparante organismen is essentieel voor het bestuderen van morfologie.
- Bestaande methoden omvatten directe beeldvorming en antilichaamkleuring.
- DiI wordt vaak gebruikt voor het visualiseren van neuronen in C. elegans.
- Deze studie heeft tot doel de visualisatie van cuticulaire structuren te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige en effectieve methode te ontwikkelen voor het kleuren van cuticula in levende C. elegans.
- Om de resolutie van beeldvorming van cuticulaire structuren te verbeteren.
- Om een kosteneffectieve alternatief te bieden voor bestaande visualisatietechnieken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een populatie C. elegans voor kleuring.
- Incubatie van nematoden in verdunde DiI-kleurstof.
- Herstel van dieren uit de kleuringsoplossing.
- Fluorescentiebeeldvorming om beklede cuticulaire details te observeren.
Belangrijkste resultaten
- DiI-kleuring benadrukt effectief alae en annulaire structuren.
- Fluorescentiebeeldvorming onthult gedetailleerde oppervlaktemorfologie.
- De methode is snel, gemakkelijk uit te voeren en kosteneffectief.
- Resultaten tonen hoge resolutie van cuticulaire structuren in levende dieren.
Conclusies
- Deze techniek biedt een significant voordeel ten opzichte van traditionele methoden.
- Het maakt gedetailleerde visualisatie van cuticulaire kenmerken in levende C. elegans mogelijk.
- De methode kan breed worden toegepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing cuticular structures in live C. elegans enables mechanistic de-risking of epidermal development and cuticle organization pathways. This method supports target validation by providing quantitative phenotypic readouts for genetic and pharmacological perturbations. The approach offers predictive confidence in early discovery by linking cuticle morphology to motility, innate immunity, and nematode evolution models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cuticle collagen organization and epidermal cell development.
- Operational Value: Provides a robust, reproducible assay for functional target validation in nematode-based disease models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking cuticle defects to morphological traits and hetero-chronic gene pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers high-resolution fluorescent readouts of annuli, alae, vulva, and tail structures for compound screening.
- Operational Value: Offers a quick, inexpensive, and scalable staining protocol compatible with live-animal imaging workflows.
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable morphological outputs for downstream hit validation and lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects cuticle visualization to preclinical models of innate immunity and developmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of cuticle defects in mutants, supporting biomarker alignment for epidermal integrity.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies of nematode evolution and morphological trait development relevant to parasiticide screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening and preclinical validation, enabling iterative refinement of cuticle-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification of cuticle organization and epidermal secretion through direct visualization of structural perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible staining with quantitative imaging outputs for compound effect assessment.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts of cuticle integrity, enabling statistical comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by visualizing cuticle structures linked to motility and immunity phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of cuticle dynamics across developmental stages and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in cuticle-related pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using a simple, cost-effective protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of cuticle-mediated toxicity or efficacy signals.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on cuticle phenotype severity and reversibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and live-animal handling.
- Needs access to compound or confocal microscopes with appropriate filter sets (excitation 549 nm, emission 565 nm).
- Demands cross-team standardization of staining duration, washing steps, and recovery conditions to minimize variability.
- Involves adaptation considerations for different C. elegans strains and developmental stages due to varying cuticle composition.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching during recovery and potential background fluorescence from unbound dye.
