Na Cell-lot in

Het algemene doel van deze procedure is om een fluorescentiemicroscoop te gebruiken om sulfaat in E. coli in real-time te volgen na infectie met faag lambda. Begin met het maken van een ruw lysaat van faag lambda. Zuiver vervolgens de faag en infecteer E. coli met faag lambda in een buis.

Blijf het lot van de bacteriële cellen onder de microscoop volgen. Uiteindelijk kunnen de resultaten in real-time verschillende celbestemmingen in e coli tonen via de expressie van verschillende fluorescerende eiwitten die geassocieerd zijn met celgroei of -dood. Over het algemeen is één controle bij deze methode het creëren van een gezuiverde front en gelabelde FI-voorraad.

Om klontering tijdens de preparatie en zuivering te voorkomen, moeten ook de beeldvormingsparameters onder de microscoop worden geoptimaliseerd om een gezonde celgroei mogelijk te maken. Inoculeer een overnight-cultuur van E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in LBM-medium bij een celdichtheid van OD 600 rond de 0,6 en induceer de lyse in een schudwaterbad van 42 °C.

Zet de incubatie voort bij 37 °C totdat lysis zichtbaar is. De cultuur wordt helder. Voeg nu 2% chloroform toe en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens het fagenlysaat over in flessen van 250 milliliter en centrifugeer de cultuur. Herstel daarna het supernatant dat de fagenpartikels bevat en voer een tweede centrifugatie uit om zichtbaar debris te verwijderen volgens standaard protocollen voor fagentitratie. Meet de fagenconcentratie, zuiver vervolgens de fagen via een cesiumchloridegradiënt en bepaal de activiteit met DPI voor de bereiding van aro-slabs.

Reinig zes microscoopglaasjes met 70% ethanol. Plaats vijf glaasjes zoals afgebeeld en bevestig deze met tape. Giet nu een oplossing van 1,5% aros in medium op de bevestigde glaasjes.

Plaats het laatste dekglas bovenop en voorkom zorgvuldig de vorming van luchtbellen. Plaats een gewicht bovenop en laat de AROS ongeveer 30 minuten afkoelen. Verwijder de vier dekglazen aan de zijkant en verpak het blok dekglazen met vershoudfolie.

Kweek een cultuur in LBMM met gebruik van een overnight-cultuur van getransformeerde bacteriën als inoculum, pellet één milliliter van de bacteriën en resuspendeer deze. Suspendeer de cellen in 20 µL ijskoude LBMM met een brede pipetpunt.

Voeg 20 µL gezuiverde fagen toe. Meng voorzichtig en incubeer eerst 30 minuten op ijs om de absorptie van de fagen mogelijk te maken. Incubeer vervolgens vijf minuten in een waterbad van 35 °C.

Om de injectie van faag-DNA te triggeren, moeten eventuele celaggregaten door mengen worden gescheiden. Verdun het mengsel 1 op 10 in LBMM. Plaats nu een LBM agro-slab.

Voeg één µL van het faag-celmengsel toe aan een dekglas. Zodra dit is geabsorbeerd, wordt er voorzichtig een tweede dekglas bovenop geplaatst. Begin met het vastleggen van een set beelden via het YFP-kanaal voor het eerste tijdsinterval.

Maak een serie van 15 afbeeldingen met intervallen van 200 nanometer langs de Z-as. Maak daarnaast een enkele scherpgestelde afbeelding via de fasecontrast- en m cherry-kanalen. Neem vervolgens een time-lapse movie op van het lot van de cellen na infectie.

Om bleaching en fototoxiciteit tijdens de time-lapse movie te minimaliseren, wordt per kanaal en per tijdspunt slechts één beeld in de Z-positie gebruikt, waarbij het monster in fasecontrast, YFP- en M-cherry-kanalen wordt vastgelegd met intervallen van 10 minuten gedurende ongeveer vier uur. Begin de analyse van de beelden met een handmatige telling van de fagen en leg daarnaast de locatie van de faag en de cellengte vast. Noteer in het beginstadium de celbestemmingen: lytisch, lysogeen of niet-geïnfecteerd.

Documenteer daarnaast de lysisduur en andere gewenste informatie door de time-lapse movie af te spelen; extraheer meer kwantitatieve informatie, zoals het fluorescentieniveau in individuele cellen over de tijd, met behulp van algoritmen voor automatische celherkenning en lineage tracing. Doorgaans zijn de plaques van de fluorescentie-gelabelde fagen aanzienlijk kleiner dan die van het wild type, en de YFP- en DAPI-signalen van een succesvol gezuiverde faag colocaliseren. Deze gegevens combineren beeldsets van fasecontrast, YFP- en M cherry-kanalen, en de overeenkomstige overlay-afbeeldingen uit een time-lapse movie.

De individuele fagen zijn duidelijk zichtbaar op het beginmoment. Hier zijn twee cellen te zien die elk door een enkele faag zijn geïnfecteerd, en één cel die door drie fagen is geïnfecteerd. Meestal is een aantal fagen zichtbaar op het celoppervlak, terwijl andere fagen niet zijn geabsorbeerd.

Na verloop van tijd wordt de uitkomst van de infectie onderscheidbaar. 80 minuten later zijn de twee cellen die door enkele fagen zijn geïnfecteerd, elk het lytische pad ingegaan. Met de intracellulaire productie van nieuwe fagen is de cel die door drie fagen is geïnfecteerd, het lysogene pad ingegaan, wat wordt gekenmerkt door de productie van mCherry vanuit de pre-motor.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een gezuiverde fagenvoorraad aanmaakt om e co-bacteriën te infecteren met faag lambda, en hoe u real-time lifestyle-imaging onder de microscoop uitvoert.