Name: Na Cell-lot in E. coli Na Infectie door Phage Lambda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer een methode voor het observeren van E. coli-infectie door bacteriofaag lambda met fluorescentiemicroscopie. Deze techniek maakt real-time visualisatie van cellevensloop en fagedynamica mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Michael Feiss en Jean Sippy voor de begeleiding op de faag creatie en zuivering. Wij danken Michael Elowitz voor het verstrekken van de cel herkenning software, Schnitzcell. Werk in de Golding lab wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01GM082837), de National Science Foundation (082.265, PFC: Centrum voor de fysica van levende cellen), de Welch Foundation (Grant Q-1759) en Human Frontier Science Programma (RGY 70/2008).

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Bacteriestammen, plasmiden en faag: Strain LE392 is supF. Werd gekozen om de SAM7 mutatie onderdrukken in het faag genoom (zie tabel 1 voor details). Aldus zullen geïnduceerde lysogenen uiteindelijk lyseren en laat faagdeeltjes, evenals geïnfecteerde cellen die gekozen lytische route. Lysogene cellen worden gekweekt bij 30 ° C door de aanwezigheid van het temperatuurgevoelige cI 857 allel in het faaggenoom. Na hitte-geïnduceerde worden GPD-EYFP en wildtype GPD co-expressie uit het genoom van λ LZ1 en het plasmide pPlate * D respectievelijk. Daardoor het capside van het nieuwe faag λ LZ2 bevat een mengsel van GPD-EYFP en gpd eiwitten. Dit mozaïek faag is structureel stabiel en voldoende fluorescerende om detectie van individuele fagen 5 mogelijk te maken. pP RE - mCherry is een reporter plasmide gebruikt om de keuze van de lysogene pathwa detectereny. De promotor P RE wordt geactiveerd door CII tijdens de oprichting van lysogeny 1,11. pP RE - mCherry 5 werd afgeleid van PE-GFP 11 door het vervangen van GFP met mCherry 12. Voor meer details zie onze eerdere werk 5. Groei Conditie Parameters: Tijdens lysogeen inductie (afdeling 1), milde schudden bij 180 rpm geeft een goed virus opbrengst 13. Gebruik van glucose in het groeimedium worden vermeden glucosemetabolisme genereerd zure metabolieten en volwassen lambda deeltjes niet stabiel bij zure pH 13. De toevoeging van MgSO4 is gericht op het stabiliseren van de faag capside 3. Voor fagen die wild type Ci (in plaats van cI 857), kan het lysogeen worden geïnduceerd met behulp van de DNA-beschadigende middel mitomycine C 3. In stap 1,3, de incubatie bij 37 ° C normaliter niet langer dan 90 minuten. Het is USEF<html> ul de celdichtheid controleren door OD600 elke 30 min. Voor een goede lysaat OD 600 daalt tot ongeveer 0,2 of minder, en de resterende OD 600 is een gevolg van celresten. Incuberen te lang kan leiden tot een lagere opbrengst faag aangezien de nieuwe faag kan beginnen hun DNA te injecteren in celresten. Als u een zichtbare faag band (minimaal 1 x 10 11 faagdeeltjes) te verkrijgen in de stappen 2,11 en 2,13, groeien ten minste 500 ml cultuur in stap 1.2. De toevoeging van 0,2% maltose in het groeimedium in stappen 5.1 en 5.2 is gericht op het induceren van expressie van LamB, de receptor voor faag lambda adsorptie 3,14. De 1000-voudige verdunning in plaats van 100-voudig in stap 5.2 is gericht op het verminderen van de mCherry achtergrondniveau van de reporter plasmide pP RE - mCherry. In stap 5.5 voor faag DNA injectie triggering, 35 ° C wordt gekozen om inductie van de temperatuurgevoelige cl857 allel voorkomen. Phage Zuivering: jove_content &quot;&gt; De faag zuiveringsstappen (Stappen 2.1 tot 2.11) kan worden vervangen door andere zuivering protocollen 5, maar de uiteindelijke ultracentrifugatie door CsCl gradiënt evenwicht (stappen 2.12 en 2.13) onvermijdelijk. Swinging bucket rotors nodig in stappen 2.10 en 2.12 tot zorgen voor scherpe zichtbaar faag bands. Het verkrijgen van een zuivere faag voorraad kan gemakkelijk tot een week duren, dus het is noodzakelijk om de faag titer controleren langs de manier om ervoor te zorgen dat er niets mis gaat tijdens de tussenliggende stappen. Faag Handling: Tijdens alle zuivering procedures van afdeling 2, is het essentieel om te behandelen faag voorzichtig lysaat om te voorkomen dat afschuiven faag staarten uit faag hoofden. Tijdens cel infectie deel 5 (bijvoorbeeld stappen 5.5 tot 5.7), is ook cruciaal voor het scheren van faagdeeltjes van de geïnfecteerde cel te voorkomen. Merk op dat als de faag wordt geschoren van de geïnfecteerde cel na injecteren zijn DNA, is het resultaat een &quot;donker&quot; infectie, dat wil zeggen de inFection uitkomst zal worden waargenomen in experiment, maar het infecterende fagen niet. Om dergelijke problemen te minimaliseren, gebruiken we een breed pipetpunt wanneer het hanteren fagen of de faag / cel mengsel. DAPI Testen: Kleuren van de faag voorraad met DAPI (hoofdstuk 4) is een snelle en efficiënte methode om de zuiverheid van de faag voorraad te controleren. Het kan ook worden gebruikt voor het testen van mogelijke afbraak bestaande faagvoorraad tijd. Voor een zuivere beelden moet de co-lokalisatie van YFP en DAPI signalen onder de fluorescentiemicroscoop dicht bij 100%. We merken op dat kenmerkend minder dan 1% van de YFP spots niet DAPI (capsiden die zonder het virale genoom), wat aangeeft dat deze deeltjes niet succesvol verpakken van het virale DNA of al hun DNA geïnjecteerd elders bevatten. Minder dan 1% van de DAPI spots bevatten YFP (uit niet-fluorescerende fagen). Indien dit niet het geval is, stappen 2,12 tot 2,14 moeten worden herhaald in oestellen opnieuw zuiveren. Met betrekking tot imaging parameters, de microscoop setup in Stap 4.3 is niet zo belangrijk als in deel 5 omdat geen langdurige live-cell imaging is hier vereist. Maar door dezelfde microscopie instellingen als in punt 5 is handig als men het ijken van de fluorescentie-intensiteit van een faagdeeltje. Als de PBS-agarose plaat is niet erg schoon of teveel DAPI kleurstof wordt gebruikt, kunnen sommige overeenkomen met DAPI spots faag DNA zijn omringd door een &quot;halo&quot;. Indien te weinig DAPI kleurstof wordt gebruikt, kan het signaal van het kanaal DAPI zeer zwak. Microscoopsysteem: Voor de beeldvorming in hoofdstuk 6, gebruiken we een commercieel omgekeerde epifluorescentiemicroscoop (Eclipse TE2000-E, Nikon) met een 100x objectief (Plan Fluo, numerieke apertuur 1.40, olie-immersie) en standaard filtersets (Nikon). De fluorescentie lichtbron is een Booglamp met controle van de lichtintensiteit. De volgende functies zijn computer gestuurde: x, y en z position, helderveld en fluorescentie luiken, en fluorescentie filter keuze. Een auto-focus functie is vereist. Anders kan de focus gemakkelijk weg te drijven tijdens de time-lapse filmpje (normaal 4 uur lang). De mogelijkheid om meerdere (x, y) posities te verwerven op elk tijdstip is nuttig omdat het laat toe om meerdere infecties gebeurtenissen in parallel. We meestal verwerven 8 stadium posities in elke film, na maximaal 100 infectie gebeurtenissen. De camera die we gebruiken is een gekoelde 512x512 CCD met 16x16 micrometer pixel camera met een dynamisch bereik van 16 bits (Cascade512, Photometrics). Verwerving uitgevoerd met Metamorph software (Molecular Devices). De microscoop moet worden geplaatst in een temperatuur-geregelde kamer, als alternatief, de microscooptafel worden omringd door een temperatuur-geregelde kamer. Image Acquisition: Voor live-cell imaging, is het essentieel om te voorkomen dat onnodige blootstelling van het monster, wat kan leiden tot het bleken en phototoxicity. Daarom is het best eerst karakteriseren systeem een ​​optimale belichting waardoor voor fluorescentiedetectie zonder dat leidt tot overmatige bleken of remmen van celgroei vinden. Om een ​​goede fluorescentie beeld te verkrijgen, spelen met de spannende lichtintensiteit, belichtingstijd en de camera te krijgen. In stappen 6.2-6.3, wordt de 10 min rasterinterval gekozen met het oog op het minimaliseren van blootstelling aan licht. In elk frame wordt slechts een in-focus beeld nodig fasecontrast (voor celherkenning) en fluorescent kanalen (voor de bepaling lot van de cel). In het eerste tijdstip, echter, multiple z-positie beelden via de YFP kanaal nodig om alle infecteren fagen op het celoppervlak te vangen. De YFP belichtingstijd in het eerste frame kan ook hoger moeten zijn dan die wordt gebruikt voor de time-lapse filmpje in de latere termijnen. Beeldanalyse: Heel voorzichtig tellen faagdeeltjes in het celoppervlak in stap 7.1. Alshierboven is opgemerkt, nemen we een reeks van z-stacks door middel van YFP kanaal in stap 6.2. Dit kan echter nog steeds laat sommige tl-faagdeeltjes out-of-focus, die het tellen uitdagingen. De cel lengte in de eerste tijd wordt gemeten met behulp van de Metamorph software. De cel lengte kan ook worden gemeten door ImageJ of andere software. Bovendien kan een geautomatiseerd huis gebouwd Matlab-programma zeer nuttig zijn bij het verkrijgen van informatie, zoals fluorescentie verandering in de tijd langs cellijnen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM buffer </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Naald </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Dialyse cassette </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Microscoopglaasje </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-heldere buis </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-heldere buis </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 tot 947 </td></tr><tr><td> Epifluorescentiemicroscoop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagentia en apparatuur.

na cell-lot in<em&gt; e. coli</em&gt; na infectie door phage lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Het systeem omvat bacteriofaag (faag) en lambda de bacterie E. coli heeft lang gediend als een paradigma voor cel-lot bepaling 1,2. Na de gelijktijdige infectie van de cel door een aantal fagen, wordt een van de twee routes gekozen: lytische (virulente) of lysogene (latente) 3,4. We hebben onlangs een methode ontwikkeld fluorescerend labelen individuele fagen en konden na de infectie besluit real-time bestuderen onder de microscoop op de individuele fagen en cellen 5. We beschrijven hier de volledige procedure voor de infectie experimenten beschreven in ons eerder werk 5. Dit omvat het creëren van fluorescerende fagen, infectie van de cellen onder de microscoop imaging en gegevensanalyse. De fluorescerende faag is een &quot;hybride&quot; co-expressie wild-type en YFP-fusie versies van het capside-eiwit GPD. Een ruwe faag lysaat wordt eerst verkregen door het induceren van een lysogeen van de GPD-EYFP (Enhongebalanceerd Geel Fluorescent Protein) faag, drager zijn van een plasmide dat wild type GPD. Een aantal zuiveringsstappen worden vervolgens uitgevoerd, gevolgd door DAPI-etikettering en beeldvorming onder de microscoop. Dit wordt gedaan om de uniformiteit, DNA verpakking efficiëntie fluorescentiesignaal en structurele stabiliteit van de faagvoorraad verifiëren. De initiële adsorptie van fagen aan bacteriën wordt uitgevoerd op ijs, gevolgd door een korte incubatie bij 35 ° C van virale DNA injectie 6 activeren. De faag / bacteriën mengsel wordt vervolgens verplaatst naar het oppervlak van een dunne nutriënt agar plaat, bedekt met een dekglaasje en afgebeeld onder een epifluorescentiemicroscoop. De post-infectie wordt gevolgd gedurende 4 uur, 10 minuten interval. Meerdere podium posities worden bijgehouden, zodat ~ 100 cellen infecties kunnen worden opgespoord in een enkel experiment. Op elke positie en tijdstip, worden beelden die in de fase-contrast en rood en groen fluorescerend kanalen. De fase-contrast beeld wordt later gebruikt voor geautomatiseerde cell erkenning terwijl de fluorescerende kanalen worden gebruikt om de infectie resultaat karakteriseren: productie van nieuwe fluorescerende fagen (groen) gevolgd door cellysis of expressie van lysogeny factoren (red), gevolgd door weer de celgroei en celdeling. De verworven time-lapse filmpjes worden verwerkt met behulp van een combinatie van handmatige en geautomatiseerde methoden. Data-analyse resulteert in de identificatie van infectie parameters voor elke infectie gebeurtenis (bijvoorbeeld aantal en posities van fagen infecteren) als resultaat infectie (lysis / lysogeny). Aanvullende parameters kunnen worden geëxtraheerd indien gewenst.

Dit artikel beschrijft de procedure voor het bereiden van een fluorescentie-gemerkte versie van bacteriofaag lambda, infectie van<em&gt; E. coli</em&gt; Bacteriën na de infectie resultaat onder de microscoop, en analyse van infectie resulteert.

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

Het systeem bestaande uit bacteriofaag (faag) lambda en de bacterie E. coli dient al lange tijd als paradigma voor celbestemmingsdeterminatie1,2. Na de ...

Het algemene doel van deze procedure is om een fluorescentiemicroscoop te gebruiken om sulfaat in E. coli in real-time te volgen na infectie met faag lambda. Begin met het maken van een ruw lysaat van faag lambda. Zuiver vervolgens de faag en infecteer E. coli met faag lambda in een buis.Blijf het lot van de bacteriële cellen onder de microscoop volgen. Uiteindelijk kunnen de resultaten in real-time verschillende celbestemmingen in e coli tonen via de expressie van verschillende fluorescerende eiwitten die geassocieerd zijn met celgroei of -dood. Over het algemeen is één controle bij deze methode het creëren van een gezuiverde front en gelabelde FI-voorraad.Om klontering tijdens de preparatie en zuivering te voorkomen, moeten ook de beeldvormingsparameters onder de microscoop worden geoptimaliseerd om een gezonde celgroei mogelijk te maken. Inoculeer een overnight-cultuur van E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in LBM-medium bij een celdichtheid van OD 600 rond de 0,6 en induceer de lyse in een schudwaterbad van 42 °C.Zet de incubatie voort bij 37 °C totdat lysis zichtbaar is. De cultuur wordt helder. Voeg nu 2% chloroform toe en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Breng vervolgens het fagenlysaat over in flessen van 250 milliliter en centrifugeer de cultuur. Herstel daarna het supernatant dat de fagenpartikels bevat en voer een tweede centrifugatie uit om zichtbaar debris te verwijderen volgens standaard protocollen voor fagentitratie. Meet de fagenconcentratie, zuiver vervolgens de fagen via een cesiumchloridegradiënt en bepaal de activiteit met DPI voor de bereiding van aro-slabs.Reinig zes microscoopglaasjes met 70% ethanol. Plaats vijf glaasjes zoals afgebeeld en bevestig deze met tape. Giet nu een oplossing van 1,5% aros in medium op de bevestigde glaasjes.Plaats het laatste dekglas bovenop en voorkom zorgvuldig de vorming van luchtbellen. Plaats een gewicht bovenop en laat de AROS ongeveer 30 minuten afkoelen. Verwijder de vier dekglazen aan de zijkant en verpak het blok dekglazen met vershoudfolie.Kweek een cultuur in LBMM met gebruik van een overnight-cultuur van getransformeerde bacteriën als inoculum, pellet één milliliter van de bacteriën en resuspendeer deze. Suspendeer de cellen in 20 µL ijskoude LBMM met een brede pipetpunt.Voeg 20 µL gezuiverde fagen toe. Meng voorzichtig en incubeer eerst 30 minuten op ijs om de absorptie van de fagen mogelijk te maken. Incubeer vervolgens vijf minuten in een waterbad van 35 °C.Om de injectie van faag-DNA te triggeren, moeten eventuele celaggregaten door mengen worden gescheiden. Verdun het mengsel 1 op 10 in LBMM. Plaats nu een LBM agro-slab.Voeg één µL van het faag-celmengsel toe aan een dekglas. Zodra dit is geabsorbeerd, wordt er voorzichtig een tweede dekglas bovenop geplaatst. Begin met het vastleggen van een set beelden via het YFP-kanaal voor het eerste tijdsinterval.Maak een serie van 15 afbeeldingen met intervallen van 200 nanometer langs de Z-as. Maak daarnaast een enkele scherpgestelde afbeelding via de fasecontrast- en m cherry-kanalen. Neem vervolgens een time-lapse movie op van het lot van de cellen na infectie.Om bleaching en fototoxiciteit tijdens de time-lapse movie te minimaliseren, wordt per kanaal en per tijdspunt slechts één beeld in de Z-positie gebruikt, waarbij het monster in fasecontrast, YFP- en M-cherry-kanalen wordt vastgelegd met intervallen van 10 minuten gedurende ongeveer vier uur. Begin de analyse van de beelden met een handmatige telling van de fagen en leg daarnaast de locatie van de faag en de cellengte vast. Noteer in het beginstadium de celbestemmingen: lytisch, lysogeen of niet-geïnfecteerd.Documenteer daarnaast de lysisduur en andere gewenste informatie door de time-lapse movie af te spelen; extraheer meer kwantitatieve informatie, zoals het fluorescentieniveau in individuele cellen over de tijd, met behulp van algoritmen voor automatische celherkenning en lineage tracing. Doorgaans zijn de plaques van de fluorescentie-gelabelde fagen aanzienlijk kleiner dan die van het wild type, en de YFP- en DAPI-signalen van een succesvol gezuiverde faag colocaliseren. Deze gegevens combineren beeldsets van fasecontrast, YFP- en M cherry-kanalen, en de overeenkomstige overlay-afbeeldingen uit een time-lapse movie.De individuele fagen zijn duidelijk zichtbaar op het beginmoment. Hier zijn twee cellen te zien die elk door een enkele faag zijn geïnfecteerd, en één cel die door drie fagen is geïnfecteerd. Meestal is een aantal fagen zichtbaar op het celoppervlak, terwijl andere fagen niet zijn geabsorbeerd.Na verloop van tijd wordt de uitkomst van de infectie onderscheidbaar. 80 minuten later zijn de twee cellen die door enkele fagen zijn geïnfecteerd, elk het lytische pad ingegaan. Met de intracellulaire productie van nieuwe fagen is de cel die door drie fagen is geïnfecteerd, het lysogene pad ingegaan, wat wordt gekenmerkt door de productie van mCherry vanuit de pre-motor.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een gezuiverde fagenvoorraad aanmaakt om e co-bacteriën te infecteren met faag lambda, en hoe u real-time lifestyle-imaging onder de microscoop uitvoert.

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Hier beschrijven we een nieuwe test voor het toezicht op prion opname en-handel door immuuncellen onmiddellijk na intraperitoneale inoculatie door het zuiveren en fluorescent etikettering geaggregeerde prion staven van geïnfecteerde hersenen materiaal dan het toezicht op hun opname en beweging van de injectieplaats en het karakteriseren van de cellen te bemiddelen deze gebeurtenissen.

Monitoring immuuncellen Trafficking TL-Prion Rods uur na intraperitoneale infectie

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

Leer een methode voor het observeren van E. coli-infectie door bacteriofaag lambda met fluorescentiemicroscopie. Deze techniek maakt real-time visualisatie van cellevensloop en fagedynamica mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Na Cell-lot in

Meer video's verkennen