Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van 3D-weefselconstructen uit geaggregeerde cellen en cel-afgeleide matrix die kunnen worden gebruikt voor functionele analyse. Dit wordt bereikt door eerst een polycarbonaatmal te frezen om ringvormige putjes met een ronde bodem te maken. Vervolgens wordt polydimethylsiloxaan of PDMS op de polycarbonaatmal gegoten om een sjabloon te creëren.

Vervolgens wordt de PDMS-sjabloon gebruikt om aros-putjes te vormen. De laatste stap is het inzaaien van cellen in de aros-putjes om aggregatie en de vorming van cohesieve weefselringen mogelijk te maken. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om cellulaire zelfassemblage en weefselengineering met verschillende celtypen te bereiken, en maakt het analyse mogelijk van de bijdrage van cellen en cel-afgeleide extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere benaderingen van weefseltechnologie is dat we weefselconstructen volledig kunnen genereren uit cellen en de extracellulaire matrix die zij produceren, sneller dan voorheen is gerapporteerd, en in een formaat dat geschikt is voor mechanische analyse. Begin met het frezen van een stuk polycarbonaat van een halve inch dik om 15 ronde bodemvormige ringvormige putjes te creëren met een centerpost-diameter van twee millimeter. Reinig de polycarbonaatmal om eventuele plasticresten die tijdens het freesproces zijn ontstaan te verwijderen en laat de mal drogen. Meng vervolgens PDMS in een verhouding van 10 op 1 van basis naar uithardingsmiddel. Ontgas de oplossing om alle luchtbellen te verwijderen en giet deze vervolgens in de polycarbonaatmal.

Ontlucht vervolgens het mengsel op de mal opnieuw om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen en hard het PDMS uit in een oven bij 60 °C gedurende vier uur; terwijl het PDMS uithardt, wordt 2% AROS in DMEM opgelost. Verwijder na uitharding voorzichtig de PDMS-sjabloon door deze langzaam van het polycarbonaat af te pellen, was vervolgens het PDMS met zeep en water en autoclaveer het samen met de DMEM AROS-oplossing. Plaats nu de geautoclaveerde PDMS-sjabloon op een vlak oppervlak en vul deze met gesmolten AROS door eerst AROS in elk van de matrijzen voor de centrale posten te pipetteren en vervolgens AROS in de ruimte eromheen te pipetteren.

Laat de aros ongeveer 15 minuten uitharden. Keer de mal vervolgens om om de aros uit de PDMS te verwijderen. Snijd het overtollige aros rondom elke put weg en plaats vervolgens één aros-put in elke put van een 12-wellplaat.

Voeg celkweekmedium toe rond de buitenkant van de aros-well zonder de bovenkant van de well te bedekken. Plaats de platen vervolgens in de incubator om ze te laten equilibreren terwijl de cellen worden voorbereid. Trypsineer rat aortale gladde spiercellen bij een confluentie van 90% en resuspendeer deze.

Suspendeer de cellen bij een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter. Pipetteer vervolgens 100 µL van de resuspenderde cel-suspensie in elk van de geëquilibreerde aros-wells. Gebruik een cirkelvormige beweging om de cellen in elke well aan te brengen.

Plaats de platen in de incubator om gedurende 24 uur ongestoord te laten rusten. Ververs het medium elke twee dagen door het medium rondom de well af te zuigen en vervolgens elke well opnieuw te vullen totdat de aros-mal volledig is ondergedompeld. Vul aan het einde van de kweek een kleine Petrischaal met PBS.

Verwijder elke ring uit de aros-mal door deze over de bovenkant van de centerpost te schuiven. Plaats de ringen in de Petri-schalen met PBS Center en positioneer een ring onder het digitale beeldvormingssysteem. Gebruik software voor randdetectie om de dikte van de ring op vier posities te meten: boven, onder, links en rechts langs de omtrek.

Voor het uitvoeren van een eenassige trekproef. Bevestig een ringmonster aan twee dunne draadgrepen. Rek de grepen uit totdat er een scheurlast van 5 mN op de ring wordt uitgeoefend.

Voer vervolgens de dwarsdoorsnede in die is berekend op basis van de diktemetingen en noteer de meetlengte. Onderwerp de ring acht keer aan een voorcyclus tussen de scheurkracht en 50 kilo pascal. Zet na de achtste voorcyclus spanning op met een snelheid van 10 millimeter per minuut tot aan het punt van breuk bij 10 millimeter per minuut.

Meet voor elke ring de maximale trekspanning en de breukrek en bereken de maximale raaklijnmodulus op basis van de verkregen gegevens. Naast functionele in vitro studies kunnen deze levende celringen ook fuseren om weefselbuizen te vormen. Gebruik een chirurgische schaar om de uiteinden van de siliconen buizen onder een hoek door te snijden om schuine randen te creëren en autoclaveer vervolgens de siliconen buizen.

Vul een Petrischaal met medium, breng de gesteriliseerde, op maat gemaakte siliconen buishouders over naar een veiligheidskast en plaats deze in een lege Petrischaal. Verwijder vervolgens de ringen uit de aros-wells en plaats deze in de Petrischaal die gevuld is met medium. Plaats de siliconen buisjes in dezelfde Petrischaal om ze voor gebruik te bevochtigen.

Gebruik een pincet om de punt van een siliconenbuis in het midden van een ring te plaatsen en schuif de ring voorzichtig over de siliconenbuis. Schuif de ringen tot ze elkaar raken door ze opeenvolgend voorzichtig in beide richtingen langs de buis te duwen. Zodra de ringen zijn gemonteerd, lijnt u de siliconenbuizen uit in de polycarbonaathouders en schroeft u de twee delen van de houder in elkaar.

Voeg 55 milliliters medium toe aan de Petrischaal. Vervang het medium elke drie dagen gedurende de cultuurperiode om de weefselbuisjes te verwijderen. Vul eerst een Petrischaal met PBS.

Maak vervolgens de siliconen buisjes los uit de polycarbonaathouder en gebruik een pincet om de weefselbuisjes van de siliconen buis af te schuiven en in de schaal te plaatsen. Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, bezinken de cellen op de bodems van de aros-wells en trekken ze binnen 24 uur na plaatsing samen om een weefselring rond de middenpaal in de Agarro s-well te vormen; dit is een representatieve plot van een spanning-rekcurve verkregen uit een uni-axiale trekproef van een weefselring van twee millimeter, gegenereerd uit gladde spiercellen van ratten. De uiteindelijke treksterkte, de maximale trekmodulus en de waarden voor de breukrek worden vervolgens gebruikt om de mechanische eigenschappen van weefselringmonsters die onder verschillende kweekparameters zijn gegroeid, te vergelijken.

De mechanische eigenschappen van weefselringen kunnen worden beheerst door kweekparameters aan te passen, waaronder het aantal geplaatste cellen, de kweekduur, het kweekmedium en het gebruikte celtype. Naast gladde spiercellen van ratten vormen humane primaire gladde spiercellen weefselringen met een vergelijkbare treksterkte.

Humaan mesenchymale stamcellen aggregeren ook om ringen te vormen, maar deze waren niet sterk genoeg voor mechanische testen. Ons systeem maakt de fabricage van engineered weefselconstructen volledig uit cellen mogelijk, simpelweg door cellen in onze aangepaste aros-wells te zaaien. Zodra de initiële polycarbonaatvorm is gefreesd, kunnen we een onbeperkt aantal PDMS-templates maken die vervolgens gebruikt kunnen worden om de vormen te vervaardigen, waardoor er geen extra apparatuur nodig is.

Het systeem is veelzijdig aangezien we verschillende celtypen in het systeem hebben gebruikt om weefselringen te maken, waardoor dit systeem potentieel ingezet kan worden voor zowel weefseltechnologische toepassingen als in vitro studies naar de bijdragen van cellen en extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.