Name: Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer een methode voor weefselengineering waarbij gladde spiercellen in agarose putjes samenklonteren tot robuuste 3D-weefselringen. Deze techniek maakt snelle biomechanische analyse en functionele studies van cel-afgeleide matrix mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar erkennen Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) voor zijn hulp bij het CNC-verspanen. Daarnaast willen we met Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) bedanken voor haar hulp met MATLAB programmeren, maar ook Kate Beverage en Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) voor hulp bij Camtasia. Sophie Burke en Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) verstrekte aanvullende video-opnamen. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R15 HL097332), de UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, de American Association Heart (undergraduate research fellowship aan JZH) en Worcester Polytechnic Institute (zomer Undergraduate Research Fellowship aan JZH en institutionele start-up fondsen MWR).

1. Cel zaaien schimmel fabricage Begin met het frezen van een 1 / 2 "dik stuk polycarbonaat tot 15, met ronde bodem, ringvormige putten te creëren met een centrale zuil diameter van 2 mm. De gefreesde kanalen zijn 6 mm diep en 3,75 mm breed. Reinigen en de polycarbonaat mal om te drogen Verwijder alle plastic afval uit het maalproces. Mix polydimethylsiloxaan (PDMS) in een 10:01 verhouding (w / w) van de basis om verharder, Degas om alle luchtbellen te verwijderen, en giet op de polycarbonaat mal. Degas weer om alle resterende luchtbellen te verwijderen, en genezen in de oven op 60 ° C gedurende 4 uur. Eenmaal uitgehard, voorzichtig de PDMS sjabloon te verwijderen door langzaam pellen uit de buurt van het polycarbonaat, wassen met zeep en water, en autoclaaf. Ook autoclaaf een oplossing van twee procent agarose (w / v) opgelost in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM). Leg de PDMS sjabloon op een vlakke ondergrond en vul met gesmolten aga steeg door eerst pipetteren agarose in elk van het centrum na de mallen, en dan pipetteren in de ruimte eromheen. Laat de agarose te stollen (ongeveer 15 minuten), keer dan de mal om de agarose release van het PDMS. Knip overtollige agarose uit rond elk van de putten, en plaats de agarose putten in 12-well platen. 2. Celcultuur en ring zaaien Voeg celcultuur media (DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine) rond de buitenkant van de agarose mal, zonder dat die de bovenkant van de mallen. Plaats de platen in de couveuse en laat ze in evenwicht voor ongeveer 15 minuten, terwijl u de voorbereiding van de cellen. Bij 90% confluentie, trypsinize rat aorta gladde spiercellen (rSMCs) en resuspendeer bij een concentratie van 5x10 6 cellen / ml. Pipetteer 100 ui celsuspensie in elk van de ringvormige agarose putten, met behulp van een draaiende beweging naar de cellen toe te passen aan elke well. content "&gt; Zorg ervoor dat incubator rekken zijn niveau, dan plaatst u de platen in de couveuse en laat ze ongestoord gaan zitten voor 24 uur. Exchange medium om de twee dagen daarna door opzuigen in de media van rond de put, en opnieuw vullen van elk goed tot de agarose goed is volledig ondergedompeld zijn. 3. Tissue ring oogsten en diktemetingen Aan het einde van de cultuur, haal de ring uit de agarose mal door te schuiven over de bovenkant van het centrum post. Leg de ring in een kleine petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), in het midden van het monster, en het verwerven van een afbeelding met behulp van een digitaal imaging systeem. Gebruik een beeldanalyse-programma voor randdetectie en meet de dikte van de ring in vier posities (boven, onder, links en rechts) rond zijn omtrek. Bereken de gemiddelde dikte waarde (t) voor elke individuele ring, en deze waarde gebruiken om de doorsnede te berekenen(2π (t / 2) 2). 4. Mechanische beproeving van ringen Stel de trekbank (Instron EPS 1000) in de horizontale positie. Bevestig een 1N ± 1mn load cell en aangepaste dunne draad grepen (gemaakt door het buigen van roestvrij staaldraad). Monteer de ring monster op de twee dunne draad grips. Uitbreiding van de handgrepen tot een 5 mN tarra belasting wordt toegepast op het monster. Voer de doorsnede (berekend op basis van dikte metingen) en noteer de meter lengte. Pre-cyclus van de ringen 8 keer tussen de tarra belasting en 50 kPa stress op een snelheid van 10 mm / min. Na de achtste pre-cyclus, trek te mislukken bij 10 mm / min. Falen wordt genoteerd als een afname van kracht met 40% van een meting naar de volgende. Voor elke ring monster, het meten van de breukspanning stress (UTS) en mislukking stam en het berekenen van de maximale tangent modulus (MTM) van de verkregen gegevens. 5. Tissue ring alstage aan weefsel buizen fabriceren Aangepaste buis houders zijn vervaardigd uit rond 5 cm polycarbonaat schijven met rechthoekige uitsparingen (2 cm x 3 cm). Boor schroefgaten door middel van deze schijven om twee houders aan elkaar worden geschroefd. Autoclaaf de aangepaste buis houders, en vervolgens naar de bioveiligheid kast en plaats het in een lege petrischaal. Gebruik chirurgische schaar aan de uiteinden van 1,9 mm diameter siliconen buisjes snijden onder een hoek met afgeschuinde randen maken en vervolgens de siliconen buisjes autoclaaf. Terwijl de buizen worden geautoclaveerd, vul een petrischaal met media. Verwijder de ringen uit de agarose putten en plaats ze in de petrischaal met media. Plaats siliconen buisjes geautoclaveerd in dezelfde petrischaal om ze te nat voor gebruik. Gebruik een tang om een ​​schuine uiteinde van een siliconen buisje plaatsen in het midden van een ring en voorzichtig de ring schuif op de siliconen slang. Herhaal dit met het gewenste aantal riNGS. Schuif de ringen in contact met elkaar door zachtjes duwen ze achtereenvolgens in beide richtingen langs de buis. Deze methode kan worden gebruikt voor ringen geoogst na slechts een dag in cultuur. Zodra ringen zijn gemonteerd, sluiten silicone buizen in de polycarbonaat houders en samen schroef de twee delen van de houder. Plaats de houder in een 100 mm petrischaaltje en voeg 55 ml media. Exchange media om de 3 dagen voor de duur van de cultuur. Voor het verwijderen van het weefsel buizen, laat u de silicone buizen van polycarbonaat de houder en een tang om het weefsel buizen glijden van de siliconen tube en in een petrischaal gevuld met PBS. 6. Representatieve resultaten: Wanneer het protocol correct wordt uitgevoerd, worden de cellen aggregaat om weefsel ringen vormen met een inwendige diameter gelijk aan de diameter van de overeenkomstige mal post binnen 24 uur. De ring randen zijn gewoonlijk vlot in verschijning en (indien van culed op een vlakke ondergrond), zijn overal even dik rond de gehele omtrek. Het weefsel ringen zijn gemakkelijk te hanteren en kunnen worden verwijderd uit hun putten voor de volgende mechanische en histologische analyse (zie in Gwyther et al.., 2011 8). Tissue ring morfologie, matrix samenstelling en de mechanische eigenschappen variëren, afhankelijk van het aantal en het type van geënte cellen. Representatieve resultaten van weefsel ringen gemaakt van verschillende celtypes, zaaien voorwaarden, en de cultuur lengte zijn weergegeven in Tabel 1. Twee mm ID ringen gemaakt van 5x10 5 rSMCs vertoonden een hoger UTS dan ringen gemaakt van onze eerder gepubliceerde 2 mm ringen (gemaakt van 6.6x10 5 rSMCs). 8 Net als rat cellen, humane gladde spiercellen (HSMC) gemakkelijk geaggregeerd tot weefsel te vormen ringen, die een grote hoeveelheid collageen die na slechts 14 dagen in de cultuur (gegevens niet getoond). Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) ook samengevoegd en vormden samenhangende ringen, maar lacked mechanische sterkte en brak tijdens de eerste fasen van precycling eenassige treksterkte testen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Aantal cellen </td><td> Dikte (mm) </td><td> Lengte van de cultuur (dagen) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Falen stam (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC ringen </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> rSMC ringen </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> HSMC ringen </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC ringen </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tabel met de cultuur van parameters en mechanische eigenschappen van 2 mm ringen gegenereerd uit verschillende celtypen, zaaien concentraties, en de cultuur duur. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) Schematische weergave van het weefsel ring generatie proces. (B) Custom polycarbonaat mal met gefreesde ringvormige putten. Centrale post diameters zijn 2 mm. (C) PDMS sjabloon nadat hij weg was gepeld uit het polycarbonaat mal. (D) Geaggregeerde weefsel ring gekweekt in een agarose mal met een 2 mm post. (E) Twee mm diameter weefsel ring in PBS. Schaal bars = 6 mm (B, C) en 2 mm (D, E). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger plot van stress-strain curve produCED van eenassige treksterkte testen.

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li>
<li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li>
<li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li>
<li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tissues.+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li>
<li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li>
<li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li>
<li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onlangs is er een toegenomen belangstelling voor cel-gebaseerde of &#39;steiger-less &quot;tissue engineering methoden om enkele van de beperkingen van de steiger op basis van tissue engineering benaderingen. Gezien het feit dat uit de cel afkomstige weefsels worden gemaakt van cellen en de matrix die ze produceren, ze van nature bevatten veel hogere celdichtheden, bevatten geen exogene materialen, en kan geheel worden gemaakt van menselijke cellen en eiwitten. Vaattransplantaten gemaakt van menselijke cellen kan bereiken aanzienlijke mechanische sterkte in de afwezigheid van exogeen steigers (bv, barstdruk van 3400 mmHg vergeleken met 1600 mmHg voor de menselijke aderen) 12. Hoewel de cel-gebaseerde vaatweefsel vertonen een verbeterde cel-dichtheid en mechanische sterkte, de meeste huidige fabricage methoden (zoals &#39;sheet-gebaseerde engineering &quot;3,4,12 of&quot; bioprinting &quot;5,13) vereisen een uitgebreide cultuur periodes (&gt; 3 maanden) of gespecialiseerde apparatuur voor 3D weefsel bouw. De cel-afgeleide weefsel ring method hier beschreven maakt een snelle cellulaire zelf-assemblage tot robuuste 3D-weefsel constructies vormen binnen een korte tijd en zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Dit protocol beschrijft de procedure die wij ontwikkeld om 2 mm binnendiameter rat gladde spiercellen afgeleide weefsel ringen te creëren. In het huidige voorbeeld werden gekweekt weefsel ringen voor 7 dagen (toen gekweekt voor een extra 7 dagen voor ring-fusion en buis vorming). Echter, 2 mm rat (en menselijke) gladde spiercel ringen kunnen worden verwijderd uit de putten en zijn samenhangend genoeg zijn voor de behandeling (bijvoorbeeld overdracht naar silicone buizen) al een dag na cel zaaien. Daarnaast kunnen robuuste weefsel ringen met verschillende diameters binnenste (2, 4 en 6 mm) worden gemaakt met deze methode door simpelweg het veranderen van de functie diameter van de oorspronkelijke polycarbonaat mal. 8 Onlangs hebben we ook het polycarbonaat matrijs ontwerp aangepast om vijf 2 mogelijk mm seeding putten te worden gegoten in een enkele multi-well agarose kamer, diegebruikt minder PDMS en agarose, en past in een putje van een 6-wells plaat (gegevens niet getoond). Veranderingen in de post diameter, de breedte van het zaaien goed, de straal van de kromming van de afgeronde bodem, kan het aantal putten zaaien, of de diepte van de putten alle zaaien eenvoudig worden aangepast door het veranderen van de specificaties in het CAD-bestand voor CNC bewerking van de polycarbonaat mal. Ten slotte kan een enkele mal polycarbonaat worden gebruikt om een ​​onbeperkt aantal templates PDMS fabriceren, en elke PDMS template kan worden gereinigd, geautoclaveerd en hergebruikt tientallen keren. In aanvulling op het veranderen van de grootte van het weefsel ringen, hebben we ringen van veel verschillende soorten cellen, waaronder: primaire rat SMC (Cell Applications, R354-05), primaire menselijke kransslagader SMC (Lonza, CC-2583), primaire humane dermale fibroblasten 11 (gulle gift van Dr George Pins, WPI Afdeling Biomedische Technologie), ratten longfibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192), en de mesenchymale stamcellen (Lonza, PT-2.501). Elk van deze celtypen aggregaten en contracten rond het centrum berichten weefsel ringen vormen, hoewel de cellulaire organisatie, de ECM samenstelling en mechanische eigenschappen van de constructen verschilt voor elke cel type. Het zaaien parameters voor elk celtype dient empirisch te worden bepaald op basis van de grootte van de cellen en hun vermogen te aggregeren. Daarom, terwijl dit systeem van het creëren van cel afkomstige weefsel ringen is uiterst veelzijdig, kan het protocol nodig kleine aanpassingen voor een optimale weefsel formatie met verschillende celtypen. Tissue ring geometrie vergemakkelijkt het laden en beoordeling van weefsel eigenschappen van het materiaal door eenassige trekproeven, zoals beschreven. Er is ook aanzienlijke precedent voor het gebruik van bloedvat ring segmenten tot vasculaire krimp en fysiologische functie te meten. Voorlopige studies wijzen erop dat uit de cel afkomstige weefsel ringen kan worden gemonteerd op een draad myograph apparaat voor het meten van farmacologische responsiviteit encontractiele kracht generatie (gegevens niet getoond). Al met al, het vermogen om snel zelf-geassembleerde cel ringen fabriceren voor histologische, mechanische, fysiologische en biochemische analyse suggereert een krachtig nieuw instrument dat nuttig kan zijn voor het modelleren van vasculair weefsel structuur en functie in gezondheid en ziekte.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalog # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxaan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Mediatech </td><td> 30 tot 002-CI </td></tr><tr><td> Digital imaging-systeem </td><td> DVT Corporation </td><td> Model 630 </td></tr><tr><td> Eenassige testmachine </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Randdetectie Software </td><td> DVT Corporation </td><td> Framework 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

gericht cellular self-assembly to cell-derived weefsel rings fabriceren voor biomechanische analyse en tissue engineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Elk jaar honderdduizenden patiënten ondergaan coronaire bypass operatie in de Verenigde Staten. 1 Ongeveer een derde van deze patiënten niet geschikt autologe donor schepen te wijten aan progressie van de ziekte of de vorige oogst. Het doel van vasculaire tissue engineering is het ontwikkelen van een geschikte alternatieve bron voor deze bypass grafts. Daarbij mag engineered vasculair weefsel waardevol blijken als levende vasculaire modellen om hart-en vaatziekten te bestuderen. Verschillende veelbelovende benaderingen van techniek bloedvaten zijn onderzocht, met vele recente studies gericht op de ontwikkeling en analyse van cel-gebaseerde methoden. 2-5 Hierin presenteren we een methode om snel zelf te monteren cellen in 3D weefsel ringen die kunnen worden gebruikt in vitro te vaatweefsel model. Om dit te doen, zijn suspensies van gladde spiercellen gezaaid in de ronde bodem ringvormige agarose putten. De niet-klevende eigenschappen van de agarose toe ee-cellen om zich te vestigen, aggregaat en contract rond een paal in het midden van de put om een samenhangend weefsel ring te vormen. 6,7 Deze ringen kunnen worden gekweekt voor enkele dagen vóór de oogst voor mechanische, fysiologische, biochemische of histologische analyse. We hebben aangetoond dat deze cel afkomstige weefsel ringen opbrengst bij 100-500 kPa treksterkte 8 die de waarde gerapporteerd voor andere weefselmanipulatieproducten vasculaire bouwt gekweekt voor vergelijkbare looptijden (&lt;30 kPa) overschrijdt. 9,10 Onze resultaten tonen aan dat robuuste cel afgeleide vaatweefsel ring generatie kan worden bereikt binnen een korte tijd, en biedt de mogelijkheid voor directe en kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van cellen en cel afkomstige matrix (CDM) aan de vasculair weefsel structuur en functie.

Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Jaarlijks ondergaan honderdduizenden patiënten in de Verenigde Staten een coronary artery bypass surgery (bypassoperatie aan de kransslagaders).1 Ongeveer een derde van deze patiënten ondergaat ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van 3D-weefselconstructen uit geaggregeerde cellen en celafgeleide matrix die gebruikt kunnen worden voor functionele analyse. Dit wordt bereikt door eerst een polycarbonaatmatrijs te frezen om ringvormige putjes met een ronde bodem te creëren. Vervolgens wordt polydimethylsiloxaan of PDMS op de polycarbonaatmatrijs gegoten om een template te vormen.Vervolgens wordt de PDMS-sjabloon gebruikt om aros-wells te vormen. De laatste stap is het zaaien van cellen in de aros-wells om ze te laten aggregeren en cohesieve weefselringen te vormen. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om cellulaire zelfassemblage en weefselengineering met verschillende celtypen te bereiken, en maakt het analyse mogelijk van de bijdrage van cellen en cel-afgeleide extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere weefselkweekbenaderingen is dat we weefselconstructen volledig kunnen genereren uit cellen en de door hen geproduceerde extracellulaire matrix, sneller dan voorheen gerapporteerd, en in een formaat dat geschikt is voor mechanische analyse. Begin met het frezen van een stuk polycarbonaat van een halve inch dik om 15 ronde ringvormige putjes te creëren met een diameter van de centerpost van twee millimeter. Reinig de polycarbonaatmal om eventuele plastic resten te verwijderen die tijdens het freesproces zijn ontstaan en laat de mal drogen. Meng vervolgens PDMS in een verhouding van 10 op 1 van base en uithardingsmiddel. Ontgas de oplossing om alle luchtbellen te verwijderen en giet deze vervolgens in de polycarbonaatmal.Ontgas vervolgens het mengsel op de mal opnieuw om resterende luchtbellen te verwijderen en hard het PDMS uit in een oven bij 60 °C gedurende vier uur; terwijl het PDMS uithardt, lost u 2% AROS op in DMEM. Verwijder na uitharding voorzichtig de PDMS-mal door deze langzaam van het polycarbonaat af te pellen, was vervolgens het PDMS met zeep en water en autoclaveer het samen met de DMEM AROS-oplossing. Plaats de geautoclaveerde PDMS-mal nu op een vlak oppervlak en vul deze met gesmolten AROS door eerst AROS in elk van de malvormen voor de centrale posten te pipetteren en vervolgens AROS in de ruimte eromheen te pipetteren.Laat de aros ongeveer 15 minuten uitharden. Keer de mal vervolgens om om de aros uit de PDMS te halen. Snijd het overtollige aros rondom elke put weg en plaats vervolgens één aros-put in elke put van een 12-wells plaat.Voeg celkweekmedium toe rondom de buitenkant van de aros-well, zonder de bovenkant van de well te bedekken. Plaats de platen vervolgens in de incubator om ze te laten equilibreren terwijl de cellen worden voorbereid. Trypsineer rat aortic smooth muscle cells bij 90% confluentie en resuspendeer deze.Suspendeer de cellen op een concentratie van vijf keer 10⁶ cellen per milliliter. Pipetteer vervolgens 100 µL van de resuspendeerde cel-suspensie in elk van de geëquilibreerde aros-wells. Gebruik een cirkelvormige beweging om de cellen in elke well aan te brengen.Plaats de platen in de incubator en laat deze 24 uur ongestoord staan. Versier het medium elke twee dagen door het medium rond de well af te zuigen en vervolgens elke well bij te vullen totdat de aros-mal volledig is ondergedompeld. Vul aan het einde van de cultuur een klein petrischaaltje met PBS.Verwijder elke ring uit de aros-vorm door deze over de bovenkant van de middenpaal te schuiven. Plaats de ringen in de Petrischalen met PBS Center, waarbij één ring onder het digitale beeldvormingssysteem wordt geplaatst. Gebruik software voor randdetectie om de dikte van de ring op vier posities te meten: boven, onder, links en rechts langs de omtrek.Voor het uitvoeren van eenuniaxiale trekproef. Bevestig een ringmonster aan twee dunne draadklemmen. Rek de klemmen uit totdat er een scheurlast van vijf milli Newton op de ring wordt uitgeoefend.Voer vervolgens de dwarsdoorsnede in die is berekend uit de diktemetingen en noteer de meetlengte. Voer acht pre-cycli uit op de ring tussen de scheurlast en 50 kilo pascal. Zet de ring na de achtste pre-cyclus bloot aan een rek met een snelheid van 10 millimeters per minuut tot aan het punt van breuk bij 10 millimeters per minuut.Meet voor elke ring de uiteindelijke trekspanning en de breukrek, en bereken de maximale raaklijnmodulus op basis van de verkregen gegevens. Naast functionele in vitro studies kunnen deze ringen van levende cellen ook fuseren om weefselbuisjes te vormen. Gebruik een chirurgische schaar om de uiteinden van de siliconenbuisjes schuin af te knippen zodat er schuine randen ontstaan, en autoclaveer vervolgens de siliconenbuisjes.Vul een Petrischaal met medium, breng de gesteriliseerde op maat gemaakte siliconen buishouders over naar een veiligheidskast en plaats deze in een lege Petrischaal. Verwijder vervolgens de ringen uit de aros-wells en plaats deze in de Petrischaal die met medium is gevuld. Plaats de siliconen buisjes in dezelfde Petrischaal om ze voor gebruik te bevochtigen.Gebruik een pincet om de punt van een siliconen slang in het midden van een ring te plaatsen en schuif de ring voorzichtig over de siliconen slang. Schuif de ringen tegen elkaar aan door ze achtereenvolgens voorzichtig in beide richtingen langs de slang te duwen. Nadat de ringen zijn gemonteerd, worden de siliconen slangen in de polycarbonaathouders uitgelijnd en worden de twee delen van de houder op elkaar geschroefd.Voeg 55 milliliters medium toe aan de Petrischaal. Vervang het medium elke drie dagen gedurende de gehele kweekperiode om de weefselbuisjes te verwijderen. Vul eerst een Petrischaal met PBS.Verwijder vervolgens de siliconen buisjes uit de houder van polycarbonaat en gebruik een pincet om de weefselbuisjes van het siliconen buisje af te schuiven en in de schaal te plaatsen. Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, bezinken de cellen op de bodem van de aros-wells en trekken ze zich binnen 24 uur na plaatsing samen om een weefselring rond de centrale paal in de Agarro s-well te vormen. Dit is een representatieve grafiek van een spannings-rekcurve, verkregen uit een uniaxialle trekproef van een twee millimeter grote weefselring gegenereerd uit gladde spiercellen van ratten. De uiteindelijke treksterkte, de maximale trekmodulus en de waarden voor de breukrek worden vervolgens gebruikt om de mechanische eigenschappen van weefselringmonsters te vergelijken die onder verschillende kweekparameters zijn gegroeid.De mechanische eigenschappen van weefselringen kunnen worden gecontroleerd door kweekparameters aan te passen, waaronder het aantal geplaatste cellen, de kweekduur, het kweekmedium en het gebruikte celtype. Naast gladde spiercellen van ratten vormen primaire menselijke gladde spiercellen weefselringen met een vergelijkbare treksterkte.Menselijke mesenchymale stamcellen aggregeren ook om ringen te vormen, maar deze waren niet sterk genoeg voor mechanische tests. Ons systeem maakt de fabricage van engineered weefselconstructen volledig uit cellen mogelijk, simpelweg door cellen in onze op maat gemaakte aros-wells te zaaien. Zodra de initiële polycarbonaatmatrijs is gefreesd, kunnen we een onbeperkt aantal PDMS-templates maken die vervolgens gebruikt kunnen worden om de matrijzen te vervaardigen, waardoor er geen extra apparatuur nodig is.Het systeem is veelzijdig, aangezien we een aantal verschillende celtypen in het systeem hebben gebruikt om weefselringen te maken; dit systeem zou daarom potentieel kunnen worden ingezet voor zowel toepassingen in tissue engineering als voor in vitro studies naar de bijdragen van cellen en de extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.

Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Hierin presenteren wij een snelle, facile en goedkope methode voor het fabriceren van aangepaste Polydimethylsiloxaan mallen die kunnen worden gebruikt voor de productie van hydrogel gebaseerde gemodificeerde weefsels met complexe geometrieën. Daarnaast beschrijven we resultaten van mechanische en histologische evaluaties uitgevoerd op gemanipuleerde cardiale weefsels geproduceerd met behulp van deze techniek.

Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters

We laten zien een nieuwe methode voor de bouw van een enkele cel-gebaseerde 3-dimensionale (3D) vergadering zonder een kunstmatige steiger.

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Hierin demonstreren we een organoïdemodel in drie stappen (tweedimensionale [2D] expansie, 2D-stimulatie, driedimensionale [3D] rijping) dat een veelbelovend hulpmiddel biedt voor fundamenteel peesonderzoek en een potentiële steigervrije methode voor peesweefselmanipulatie.

Demonstratie van zelf-geassembleerde celbladcultuur en handmatige generatie van een 3D-pees/ligament-achtige organoïde met behulp van menselijke dermale fibroblasten

Leer een methode voor weefselengineering waarbij gladde spiercellen in agarose putjes samenklonteren tot robuuste 3D-weefselringen. Deze techniek maakt snelle biomechanische analyse en functionele studies van cel-afgeleide matrix mogelijk.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Meer video's verkennen