Morfometrische analyses van het netvlies secties
19 februari 2012
Deze video toont drie soorten morfometrische analyses van het netvlies, waaronder het meten van de binnenste nucleaire laag dikte, het kwantificeren van het aantal retinale ganglioncellen (RGC) en het meten van de afmetingen van RGC. De techniek kan bieden een eenvoudige, maar wetenschappelijk platform voor morfometrische analyses.
Hallo, ik ben Regina van het laboratorium voor Neurodegeneratieve Ziekten van de afdeling Anatomie aan de Universiteit van Hong Kong. Vandaag ga ik u laten zien hoe u de progressieanalyse van de retinale sectie uitvoert. Laten we beginnen. Voordat we enige analyse uitvoeren, ondergaan een retinale monstersectie en vier MyFitness de H&E-kleuring.
Daarna wordt de retinale sessie onderverdeeld in vier regio's. Dit zijn de bovenste perifere regio, de bovenste centrale regio, de onderste centrale regio en de onderste perifere regio. Na het definiëren van de regio's wordt van elke regio een afbeelding gemaakt bij een vergroting van 10 keer 40 onder de bright beam microscoop van decor.
Nu zijn we klaar om de retinale morfologische informatie te analyseren. Deze sessie zal laten zien hoe de retinale dikte van de binnenste kernlaag kan worden gemeten. Open de software genaamd thorough investigator.
Kies de 40 types en selecteer vervolgens 'image open' in de hoofdwerkbalk. Kies onder het tabblad 'file' een afbeelding van het gewenste netvliesgebied dat u wilt analyseren. Kies het type contourlijn uit het vervolgkeuzemenu van de hoofdwerkbalk.
Zorg ervoor dat de automatische verschuiving is ingeschakeld. U kunt de afbeelding vergroten door op de knop inzoomen te klikken. U kunt de knop uitzoomen gebruiken om de grootte van de afbeeldingsweergave te verkleinen.
Zowel de tracing als het specimen kunnen in vier verschillende richtingen worden bewogen door op de knoppen voor beweging te klikken. Klik met de rechtermuisknop in het tracing-venster en selecteer eenvoudige crack tracing. Teken de contourlijn langs de binnenrand van de binnenste laag.
Indien er een fout wordt gemaakt, onderbreek dit dan in het traceervenster en druk op de knop ongedaan maken om het laatste tekenpunt te wissen. Ga door met het traceren tot aan het laatste punt van de lijn. Wanneer de tekening voltooid is, onderbreek deze dan in het traceervenster, kies een open contour en start de afbeelding door op inzoomen te klikken.
Klik met de linkermuisknop in het traceervenster. Om de afbeelding te vergroten, selecteert u een markering in de markerbalk bij Marcus. Op het knooppunt.
Nadat alle markeringen zijn toegevoegd, selecteert u het markeringpictogram op de positie van balk twee en de cursor. Selecteer in het midden van een van de markeringen de optie 'hoeken snel meten' onder het tabblad twee via een rechtermuisklik in het traceervenster en selecteer vervolgens de optie 'continu'. Meet de hoek door eerst op het midden te klikken van een markering die grenst aan de geselecteerde markering.
Voor een uiteinde van het lijnsegment verplaatst u deze naar het centrum van het betreffende gebied. Markeer de scheur. Rek vervolgens het elastiek uit tot de buitenrand van de inia-laag en stel de hoek in tot 90 graden.
Beweeg de cursor naar de gewenste scheur aan de linkerzijde. Er verschijnt een dialoogvenster waarin de hoekmeting wordt weergegeven direct na het klikken. Druk op de enter-toets terwijl de muis links wordt vastgehouden.
Klik in het traceervenster, zodat de lijn van het ene uiteinde naar het nieuw geselecteerde uiteinde wordt getrokken. Onderbreek de lijn in het traceervenster en kies een open controle. Er moeten vier metingen worden verricht van de uitlopers van de binnenste nucleaire laag in elke regio, waarbij vier lijnen worden getrokken.
Trek een loodrechte lijn van de controlebasis naar de buitenrand van de binnenste kernlaag en start het beeld zodat de rand duidelijk zichtbaar is. Als het uiteinde van de lijn zich niet op de buitenkant van de binnenste kernlaag bevindt, kunnen we deze verbinden of de lijn verkorten in de bewerkingsmodus. Selecteer de bewerkingsmodus en kies de lijn.
Klik op het tekenvenster en selecteer de zoekfunctie in de elektrische bediening; voeg een punt toe aan de buitenrand, waarbij de puntbewerking langs dezelfde lijn moet verlopen. Verwijder het oorspronkelijke punt. Een uitlijning met een nieuwe lift kan vervolgens worden verkregen.
Verklein de afbeelding door op de knop voor uitzoomen te klikken. Deselecteer de bewerkingsmodus en teken het laatste lijnsegment. Selecteer na het tekenen van de volgordelijnen de bewerkingsmodus.
Klik met de rechtermuisknop in het traceervenster en plaats de vier lijnsegmenten dienovereenkomstig. We kunnen nu de vier metingen verkrijgen door op de CONT-meetknop te drukken. Selecteer deze vier metingen en plak ze in een gespecialiseerd programma door op kopiëren te klikken.
Klik op 'Ball Select' en kies 'Save As' onder het tabblad 'File'. De tracing-gegevens kunnen worden opgeslagen als een databestand. In dit deel zullen we het aantal rode staart-ganglioncellen kwantificeren; selecteer 'Image' en vervolgens 'Open'.
Kies onder het tabblad bestand een afbeelding van het gewenste netvliesgebied dat u wilt analyseren. Allereerst moeten we identificeren welke cellen levend zijn en welke cellen dood zijn. Cellen met een ongeveer ronde vorm, waarbij de nucleus subtiel en duidelijk waarneembaar is, worden beschouwd als levende ganglioncellen van het netvlies.
Die kleine en gecondenseerde cellen worden beschouwd als die cel. Kies het type contourlijn uit het dropdownmenu van de hoofdbalk. Trek een lijn langs de rand van de linkervezellaag en voltooi de trekking met de optie voor een open contour.
Voeg aan beide uiteinden een markering toe: één aan de punt van de lijn en de andere op de positie nabij het team. Selecteer het markeringsicoon in de marker-twee-balk. Plaats de cursor in het midden van de markeringen.
Selecteer in de werkbalk onder het tabblad de optie 'quick measure angles'. Klik met de rechtermuisknop in het traceervenster, selecteer de optie 'continuous' en kies vervolgens 'rubber band lines' om een hoek van 19 degree te meten. Druk op de enter-toets zodra het selectiekader is vastgelegd.
Houd er echter rekening mee dat de muis op dat moment nog steeds aan de linkerkant staat. Onderbreek het traceervenster zodat er een nieuwe lijn specifiek vanaf de punt kan worden verlengd. Onderbreek het traceervenster en kies een open controle.
Trek op precies dezelfde wijze als bij het andere uiteinde nog een nieuwe lijn. We hebben nu twee begrenzingen gecreëerd waarbinnen het aantal ratin gagan-cellen wordt geteld. Selecteer één type marker en bevestig er één aan elke vijf cellen.
Kies één grens als uitsluitingslijn; cellen die deze raken, worden niet meegeteld. Selecteer een ander type markering voor de dode cellen. Het aantal markeringen van elk type wordt overeenkomstig weergegeven naast het betreffende marker-icoon.
Selecteer bij de marker two-balk de bewerkingsmodus en selecteer de contourbasislijn. Onderbreek deze in het traceervenster en beëindig de lijn opnieuw. De naam van de contourbasislijn kan worden verkregen door op de knop voor contourmeting te drukken.
Het aantal cellen kan vervolgens worden uitgedrukt per millimeter van de naam. Sla dit vervolgens op onder het tabblad bestand. De tracing- en markergegevens kunnen worden opgeslagen als een databestand.
In dit deel wordt gedemonstreerd hoe de celzijde van een retinale ganglioncel gemeten kan worden; open het geselecteerde beeld. Selecteer onder het tabblad bestand een afbeelding van het gewenste retinale gebied dat u wilt analyseren. Kies een levende ganglioncel op basis van de criteria die in het vorige deel zijn beschreven.
Kies in de levenscel het type contourlijn uit het keuzemenu van de hoofdbalk. Trek een contourlijn langs de omtrek van de cel, klik ongeveer aan het einde op het tekenvenster en selecteer 'contour sluiten'. Het oppervlak van de cel wordt weergegeven onder het item 'oppervlak' in het dialoogvenster voor controlemetingen.
Deze video heeft drie eenvoudige methoden gedemonstreerd waarmee het netvlies objectief geanalyseerd kan worden. Hopelijk is deze video van.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert drie typen morfometrische analyses van het netvlies, waaronder het meten van de dikte van de binnenste nucleaire laag, het kwantificeren van het aantal retinale ganglioncellen (RGC's) en het meten van de grootte van RGC's. De techniek biedt een wetenschappelijk platform voor deze analyses.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Retinale morfometrie
- Celkwantificatie
Achtergrond
- De gezondheid van het netvlies is essentieel voor het gezichtsvermogen.
- Morfometrische analyses helpen bij het begrijpen van netvliesziekten.
- Retinale ganglioncellen zijn van vitaal belang voor de overdracht van visuele informatie.
- Het meten van RGC's kan inzicht bieden in neurodegeneratieve aandoeningen.
Doel van de studie
- Om morfometrische technieken voor retina-analyse te demonstreren.
- Om retina-ganglioncellen en hun grootte te kwantificeren.
- Om de dikte van de binnenste kernlaag te meten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van retina-monsters.
- Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring.
- Verdeling van de retina in gedefinieerde regio's voor analyse.
- Beeldacquisitie bij verschillende vergrotingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van de dikte van de binnenste nucleaire laag.
- Kwantificering van retinale ganglioncellen.
- Beoordeling van de grootte van RGC's in verschillende retinale regio's.
- Demonstratie van een systematische aanpak voor retinale morfometrie.
Conclusies
- De gepresenteerde technieken zijn effectief voor retina-analyse.
- Deze methoden kunnen helpen bij het begrijpen van retina-pathologieën.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit kader voor verder onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Objectieve morfometrische analyse van retina-secties maakt een nauwkeurige kwantificering van neuronaal verlies en structurele veranderingen mogelijk, wat de validatie van targets in modellen voor neurodegeneratieve ziekten ondersteunt. Door de meetvariabiliteit te verminderen en de gevoeligheid voor minimale veranderingen te vergroten, vergroot deze benadering het voorspellend vertrouwen bij het evalueren van therapeutische effectiviteit. Het biedt een vertaalbaar platform voor het beoordelen van retina-pathologieën in verschillende fasen van geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de dichtheid van retinaire ganglioncellen en veranderingen in de somagrootte in ziektemodellen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van reproduceerbare metingen van de dikte van de binnenste nucleaire laag en celwerk morfometrie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfoliotriage door absolute, reproduceerbare morfometrische gegevens te leveren voor vergelijking tussen verschillende studies.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarzetten van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op stroomafwaartse workflows via gestandaardiseerde regio-gebaseerde beeldverwerving- en traceringsprotocollen.
- Kwantitatieve output: Genereert absolute lengte- en groottemetingen die direct naar analytische bestanden kunnen worden geëxporteerd, wat de consistentie van de gegevens verbetert.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door verminderde variabiliteit tussen waarnemers en een verhoogde gevoeligheid bij het detecteren van minimale retinale veranderingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door het verlies van RGC's en veranderingen in de laagdikte te koppelen aan therapeutische uitkomsten in modellen van glaucoom en excitotoxiciteit.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via objectieve, reproduceerbare morfometrische eindpunten in verschillende retinale regio's.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op voorspellende waardebepaling door structurele veranderingen te isoleren, onafhankelijk van functionele assays.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, en biedt structurele read-outs die functionele beoordelingen in retina-ziektemodellen aanvullen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door het kwantificeren van het aantal cellen, de grootte en de dikte van de lagen in gedefinieerde retina-regio's.
- Screening: Waarborgt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde analyse van H&E-gekleurde coupes en softwaregestuurde tracing.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (celaantal, somagrootte, laagdikte), wat statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit via ziekterelevante structurele eindpunten in modellen voor NMDA-geïnduceerde excitotoxiciteit, ischemie-reperfusie en glaucoom.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor retina-morfometrie over meerdere ziektemodellen en therapeutische interventies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door vermindering van mechanistische ambiguïteit bij retinale neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van morfometrische metingen over verschillende operators en locaties.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium via vroege detectie van structurele biomarkers.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantificeerbare retinale structurele veranderingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in histologie, microscopie en het gebruik van morfometrische software (Stereo Investigator).
- Benodigde instrumentatie omvat een lichtveldmicroscoop, een geautomatiseerd traceersysteem en software voor beeldanalyse.
- Standaardisatie tussen teams vereist strikte naleving van het protocol voor de definitie van regio's, de traceertechniek en de replicatie van metingen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen omvatten het aanpassen van de vergroting, de bemonstering van regio's en de criteria voor celidentificatie.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de kwaliteit van de weefselcoupes en de consistentie van de kleuring voor een nauwkeurige afbakening van de grenzen.
