Name: Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Leer optogenetische stimulatie van volwassen geboren neuronen in de bulbus olfactorius met lentivirale transductie en LED-implantatie. Deze methode biedt specifieke controle over neuronale activiteit en gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het leven verzekeringsmaatschappij &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Ecole des Neurowetenschappen de Paris (ENB), het Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-neur-004&quot; in het kader van &quot;ERA-NET NEURON&quot; van KP7 programma door de Europese Commissie, &quot;Stichting pour la Recherche Medicale&quot;, de Letten Foundation en de Stichting Pasteur.

1. Stereotaxische injecties <ol><li> Het virus gebruikt in deze experimenten is een replicatie-deficiënte lentivirale vector op basis van het HIV-virus te Channelrhodopsine2-YFP (geel fluorescerend eiwit) te uiten fusieconstruct aangedreven door een synapsin promotor 6. Het plasmide werd royaal door K. Deisseroth 's onderzoeksgroep ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentivirussen kan worden verkregen uit commerciële bronnen of geproduceerd in het laboratorium op basis van vastgestelde protocollen 7. Gemiddelde vector titers waren in de orde van 10 10 transductie eenheden / ml. Virale porties worden bewaard bij -80 ° C en moet worden ontdooid vlak voor het pipet laden. Meerdere vries / dooi cycli moeten worden vermeden. Nooit de blootstelling van de virus-oplossing direct op droog ijs. </li><li> Bereid glazen pipetten van borosilicaatglas haarvaten op standaard pipet trekker (Sutter P-97 Pipet trekker). Het trekken instelling moet goed worden afgestemd op een lange en starre pipet opbrengst. Daarna, snijd de punt van de pipet met behulp van een schaar om een ​​fooi van 30-40 micrometer in diameter te verkrijgen. Bewaar getrokken pipetten in een stofvrije doos. </li><li> Het instellen van de Nanoject II microinjector de instructies van de fabrikant voor de levering van 50 nL. Bereid de injectie pipet door de back-vullen met minerale olie en steek deze in de microinjector zuiger. Bevestig de microinjector op een stereotaxische frame. Gedeeltelijk lege olie uit de glazen pipet voor het vullen met het virus oplossing </li><li> Met een micropipet, overdracht 2 pi van het virus oplossing op een steriel stuk van Parafilm. Laat het glazen pipet in de daling van het virus oplossing en vul de pipet met 1-2 pl. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipet. </li><li> Verdoof een muis met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine, verdund in een steriele zoutoplossing. Verwijder het haar van de hoofdhuid van dedier met behulp van knaagdier tondeuse, scheermes, schaar, of chemisch depilitory agent. Ontsmet de hoofdhuid met drie toepassingen van afwisselend 70% ethanol en betadine. Alle chirurgische instrumenten moeten ook worden geautoclaveerd en vervolgens gedesinfecteerd met 70% ethanol. Plaats het dier in de stereotaxisch frame met oor bars en neus bar, ervoor te zorgen dat de kop veilig is. Van toepassing oogzalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies. </li><li> Met een scalpel, snijd de hoofdhuid van tussen de ogen tot tussen de oren. Opzij te trekken van de huid op de schedel bloot te leggen en de huid anker met een paar klemmen. Reinig het oppervlak van de schedel. De stereotaxische apparaat is op nul gezet met de punt van de glazen pipet op bregma. Dan is de tip is gepositioneerd op de injectieplaats (Antero-Posterior, 3,30, medio-laterale, ± 0,82, voor zowel de rechter en linker hemisfeer, respectievelijk). De positie van de neus bar te worden aangepast aan de berekening van de stereotaxische coördinaten. In ons experiment, is de neus bar aangepaste uot bregma en de plaats van injectie zijn uitgelijnd op dezelfde hoogte. </li><li> Identificeer de injectieplaats. Met behulp van een high-speed chirurgische boren, zorgvuldig boren gaten in de schedel. Met een gebogen naald van de spuit haak aan het uiteinde, verwijder de restanten van dunne bot om het dura mater bloot te leggen. Controleer dat het gat is gecentreerd op de juiste positie. Zorg ervoor dat u breuk bloedvaten op het oppervlak van de hersenen tijdens het boren. Als de bloedvaten zijn gescheurd, drukt u voorzichtig op het oppervlak van de hersenen met een klein wattenstaafje of tissue gedurende enkele seconden totdat de bloedstroom stopt. </li><li> Laat de pipet en nul de Dorso-Ventraal hoogte wanneer de punt van de pipet raakt het oppervlak van de hersenen. Dan lager om de juiste Dorso-Ventraal diepte (Dorso-Ventraal, 2,9 van de hersenen oppervlak) en wacht 30 seconden voor druk evenwicht. Injecteren 4 maal 50 nl van het virus voor een totaal van 200 nl. Wacht 30 seconden tussen elke injectie. </li><li> Een minuut na de laatste injectie, langzaam de pijp in te trekkentte. Herhaal de punten 1.6-1.8 voor de andere halfrond. Verwijder het dier uit stereotaxische apparaat, het reinigen van de incisie en steek de snede huid met behulp van chirurgische draden. Laat het dier op aarde pad te herstellen voordat u terugkeert naar kooi. Bovendien kunnen dieren worden gegeven een niet-steroïdale anti-inflammatoire analgetica (bijv. Carprofen 4mg/kg) onmiddellijk na en 3 dagen na de operatie. </li></ol> 2. Chronische LED-implantatie voor in vivo optogenetic stimulatie in de bulbus olfactorius <ol><li> Dieren geïnjecteerd met lentivirale deeltjes bilateraal naast chronisch geïmplanteerd met een miniatuur blauwe LED (Osram, LED 4.6W CMS blauw). Soldeer de LED pinnen om een ​​vrouwelijke miniatuur elektrische connector, zodat de connector is geplaatst aan de andere kant van de LED. Controleer of er geen elektrische kort knippen en identificeren van de positieve en negatieve pin op de connector. Test de LED door aan te sluiten op een bestaande controller voor LED maar een juiste kabel. </li><li> Voor het meten en / of stel de absolute lichtsterkte van de LED, monteert u de LED op een micromanipulator en de positie van de LED in direct contact met de fotodetector van een power meter van een piek lichtintensiteit bij 470 nm. Boor een gaatje van 3 mm diameter in een ondoorzichtige PVC bord. Bevestig dit gaatje om de kracht meter en bouwen een standaard curve van optische vermogen ten opzichte van de huidige ingang aan de kracht per mm 2 te berekenen. </li><li> Voor het meten van de voortplanting van licht door de hersenen, op maat gesneden blokken van verse hersenweefsel van 300, 500, 1000, 1500 en 2500 micrometer dikte in 0-4 ° C ACSF met behulp van een vibratome 14. Leg een stukje van de schedel met een craniotomie identiek is aan de een uitgevoerd in levende muizen onder de LED. Eerste, het meten van de licht macht zonder weefsel gericht op LED. Plaats dan elk blok van weefsel tussen de LED en de fotodetector van de macht meter, en meet de macht. Bouw een curve van weefseldikte versus relatieve transmissie fractie, berekend als de verhoudingtussen het gemeten vermogen door middel van weefsel en zonder weefsel. </li><li> Verdoof een muis met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine, verdund in een steriele zoutoplossing. Reinig en desinfecteer de LED met 70% ethanol. Verwijder het haar van de hoofdhuid van het dier en desinfecteren van de hoofdhuid met drie toepassingen van afwisselend 70% ethanol en betadine. Plaats dan het dier in de stereotaxisch frame. Van toepassing oogzalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies. Bevestig de zender aan een stereotaxische houder. De positie van de neus balk moet worden aangepast totdat het oppervlak van de schedel boven de bulbus olfactorius is perfect horizontaal en evenwijdig aan het oppervlak van de miniatuur LED. </li><li> Met een scalpel, snijd de hoofdhuid van 3 mm anterior voor de ogen tot 3 mm achter de oren. Opzij te trekken van de huid en voor anker liggen, met een paar klemmen. Schraap de membranen aan de oppervlakte van de schedel met behulp van een scheermesje. Reinig en droog de schedel. Breng een dun cover van cyanoacrylaat lijm aan op de volgende advertentie makenhesion van tandheelkundige acryl. </li><li> Met behulp van een high-speed chirurgische boren, voert u een rechthoekige craniotomie (1 mm caudale en 3 mm laterale, gecentreerd op 5,1 mm staart, 0 mm lateraal van bregma) over de olfactorische bollen. Om dit te doen, voorzichtig dun de schedel tot er slechts een dunne laag van het bot blijft. Verwijder voorzichtig het resterende bot met behulp van een gebogen naald van de spuit. Speciale aandacht moet worden genomen om te voorkomen dat aanprikken van de dura materie en doorbreken van de grote bloedvaten die liggen tussen de twee hersenhelften en in de caudale rand van de olfactorische bollen. Bloed-accumulatie en coagulatie bij de hersenen oppervlak sluit een optimale lichtinval in het weefsel. Spoel de craniotomie en het oppervlak van de hersenen met een steriele zoutoplossing en droog de schedel. </li><li> Bevestig de miniatuur LED aan op de connector. Laat de miniatuur LED aan de bovenkant van de olfactorische bollen. De hoofdas van de miniatuur LED moet worden parallel aan de rostrale-caudale as van de muis, schoon met steriele zoutoplossing en dry de schedel. Bevestig vervolgens de LED op de schedel met een eerste laag van acryl (dat wil zeggen, polycarboxylaatcement cement), gevolgd door een tweede laag van tandheelkundige acryl. De toevoeging van twee kleine schroeven kan nodig zijn om de LED te lossen. De schroeven moeten worden ingebracht op de schedel (achterste om de LED positie) en bedekt met beide acryl. Terwijl de acryl is nog vloeibaar, terug te trekken en lijm van de vrije randen van de hoofdhuid op het oppervlak van de tandheelkundige acryl. Zorg ervoor dat u geen acryl toe te passen op de connector. Nadat de acryl is uitgehard, verwijdert u het dier stereotaxische apparatuur en laat het terug op een warming pad voordat u terugkeert naar kooi. Dieren worden gelaten geïsoleerd in hun kooi om van de operatie terug voor ten minste zeven dagen. Bovendien kunnen dieren worden gegeven een niet-steroïdale anti-inflammatoire analgetica (bijv. Carprofen 4mg/kg) onmiddellijk na en 3 dagen na de operatie. LED's moet worden getest vóór de implantatie en na beëindiging van de experimenten. </li><li> Een lichte elektrischecal-kabel wordt gebruikt om ketting het dier een huidige controller voor LED gekoppeld aan een pulsgenerator (Master-8) om de timing en de intensiteit van de LED te controleren. De dunne kabel zorgt voor volledige vrijheid van beweging. Zorg ervoor dat de polariteit van de connector te respecteren. Omkeren van de polariteit kan breken de LED. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: ChR2-YFP wordt uitgedrukt in getransduceerd neuronen ongeveer 48 uur na de injectie, en blijft stabiel gedurende enkele maanden 7. Figuur 1 is een representatief beeld van een sagittale doorsnede van een paraformaldehyde-vaste dieren 15 dagen na de injectie. Let op de dichte etikettering en de grootte van de plaats van injectie in de RMS. Een groot aantal van de pasgeboren cellen zijn gemigreerd langs de RMS om de verschillende lagen van de bulbus olfactorius (afb. 1) koloniseren. Het fusie-eiwit wordt uitgedrukt in alle neuron compartimenten, inclusief de soma, dendrieten, en stekels. Miniatuur LED impla ntation maakt op grote schaal en goedkoop optische stimulatie van een brede regio van belang. Het dier is gebonden aan de LED controller met een lichte elektrische kabel die een volledige vrijheid van beweging mogelijk maakt. Door het karakteriseren van het licht diffusie in het hersenweefsel en de drempel van ChR2 activatie, schatten we dat optische activatie zou kunnen worden geactiveerd op een diepte van ~ 2 mm onder het oppervlak van de LED (Fig. 2A). Voor het bewaken van de functionele activering van neuronen ChR2-expressie in vivo, kan de expressie van c-fos, een marker van neuronale activiteit, worden geanalyseerd na repetitieve lichte stimulatie (Fig. 2B). Als alternatief, kan in vitro elektrofysiologische opnames van ChR2-expressie neuronen gekoppeld aan het licht focale stimulatie worden uitgevoerd 14. Tot slot zijn twee-foton gerichte loose-patch opnames is gebruikt om de functionele activering van ChR2-expressie corticale neuronen door vergelijkbare miniatuur LED-in-vivo-9 studie. ntent "&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. ChR2-YFP expressie van lentivirale injectie in de rostrale trekkende stroom. Vertegenwoordiger confocale beelden van een saggital delen van de bulbus olfactorius van een muis 15 dagen na de injecties van een lentivirus in de rostrale RMS. Let op de aanwezigheid van verstrooide YFP pasgeboren neuronen migreren van het einde van de RMS om de verschillende lagen van de OB. De meeste van pasgeboren cellen (95%) zijn granule cellen, die soma liggen in de Korrel Cell Layer (GCL) en dendrieten arborize in de externe plexiform Layer (EPL). Een kleine populatie van de pasgeboren neuronen tot migreren naar de meest oppervlakkige laag van de OB, in de glomerulaire Layer (GL). Schaal bar, 100 urn. Inzet, hoge vergroting van een pasgeboren korrel cel, waarin het membraan expressie van ChR2-YFP in de dendrieten als in stekels. Schaalbalk, 20μm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Diagram van geïmplanteerde LED op de bovenkant van de bulbus olfactorius en licht opgewekte c-fos expressie in ChR2-YFP verwoorden van nieuwe granule cellen. A, Schematische tekening van de geïmplanteerde-LED boven de olfactorische bollen. B, vertegenwoordiger confocale beelden die dubbel-gelabeld ChR2-YFP + c-fos + granule cellen een uur na het licht stimulatie van de bulbus olfactorius. C-fos expressie is onthuld met behulp van een konijn anti-c-fos primaire antilichaam (Calbiochem, 1:5000) en de A568-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (Invitrogen, 1:1000). Schaalbalk, 10μm.

<ol><li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons%3A+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li>
<li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons%3A+when+time+matters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How%2C+when%2C+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li>
<li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.</li>
<li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li>
<li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li>
<li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Optogenetic tools hebben onlangs gestegen onze controle over de selectieve neuronale populaties, met inbegrip van volwassen geboren neuronen in de olfactorische systeem. Hier beschrijven we hoe u een stereotaxische injectie van een lentivirale vector die ChR2-YFP in een specifieke populatie van volwassen geboren neuronen uit te voeren. Door zorgvuldig toezicht op de periode na de injectie, zijn we in staat om te analyseren en manipuleren van de activiteit van een cohort van volwassen geboren neuronen met een relatief ho...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nee. </td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipet Puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Glazen capillairen (3,5 &quot;) </td><td> Drummond Wetenschappelijke </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II Microinjector </td><td> Drummond Wetenschappelijke </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Hoge snelheid chirurgische boren </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Micro-Boor Staal Burrs 0,7 mm tip diameter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED CMS blauw 4,6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Vrouwelijke elektrische connector (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Huidige controller voor LED (max: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Pulsgenerator </td><td> AMPI </td><td> Master-8 </td></tr><tr><td> Optisch vermogen meter </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylaat lijm </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Polycarboxylaatcement cement (eerste laag cement) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Methacrylaat cement (tweede laag cement) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - Vloeistof (# 339292) Unifast Trad - Poeder (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selectieve viral transductie van adult geboren olfactorische neuronen voor chronische in vivo optogenetic stimulatie

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Lokale interneuronen worden continu geregenereerd in de bulbus olfactorius van volwassen knaagdieren 1-3. In dit proces, de zogenaamde volwassen neurogenese, neurale stamcellen in de muren van de laterale ventrikel aanleiding geven tot neuroblasts die migreren van enkele millimeters langs de rostrale trekkende stroom (RMS) te bereiken en op te nemen in de bulbus olfactorius. De studie van de verschillende stappen en de impact van volwassen geboren neuron integratie in de reeds bestaande olfactorische circuits, is het noodzakelijk om selectief label en de activiteit van deze specifieke populatie van neuronen te manipuleren. De recente ontwikkeling van optogenetic technologieën biedt de mogelijkheid om licht te gebruiken om deze specifieke cohort van neuronen precies te activeren zonder dat dit invloed omliggende neuronen 4,5. Hier presenteren wij een reeks van procedures om viraal te uiten Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in een tijdelijk beperkte cohort van neuroblasts in de RMS voordat ze de bulbus olfactorius en worden volwassen geboren neurons. Daarnaast hebben we laten zien hoe implantaat en kalibreren een miniatuur LED voor chronische in vivo stimulatie van ChR2-expressie neuronen.

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Lokale interneuronen worden continu geregenereerd in de bulbus olfactorius van volwassen knaagdieren1-3. In dit proces, adult neurogenese genoemd, worden neurale stamcellen ...

Het doel van deze procedure is om via afstandsbediening neuronen in de bulbus olfactorius te activeren en te observeren hoe deze activatie het gedrag beïnvloedt. Dit wordt bereikt door een trends-gen van channel Redin two, gekoppeld aan YFP, in doelneuronen van volwassenen te introduceren middels stereotaxische injecties van een lentivirale vector. Vervolgens wordt een LED gekalibreerd en klaargemaakt voor implantatie om een algemeen beeld te krijgen van de hoeveelheid licht die in de hersenen wordt overgedragen.De laatste stap van de procedure is de implantatie van de LED boven de bulbus olfactorius, waarbij de juiste positionering en bevestiging worden gewaarborgd. Uiteindelijk wordt de neuronale activatie bevestigd via CFO's, immunokleuring en de resultaten van gedragstesten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard elektrische stimulatie of farmacologische perturbaties, is dat optogenetische stimulatie van gelabelde neuronen zeer specifiek is wat betreft zowel het type als het aantal geactiveerde neuronen.De implicaties van deze techniek zijn relevant voor de therapie of diagnose van neurodegeneratieve ziekten vanwege de

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal...

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

De temporele en ruimtelijke resolutie van de genetische manipulaties bepaalt het spectrum van biologische fenomenen die ze kunnen verstoren. Hier gebruiken we tijdelijk en ruimtelijk...

Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Volwassen geboren neuronen die ChR2 kunnen worden gemanipuleerd in slice elektrofysiologische voorbereidingen om hun bijdrage aan de functie van olfactorische neurale circuits te onderzoeken.

Met behulp van betaalbare LED-arrays voor Photo-stimulatie van neuronen

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

We beschrijven een protocol voor in vivo markering van olfactorische sensorische neuronen door middel van elektroporatie en vervolgens confocale laser-scanning of multifotonmicroscopie om de neuronale morfologie en de ontwikkeling ervan in de loop van de tijd te visualiseren.

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer In Vivo

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.

Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .

Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven

Leer optogenetische stimulatie van volwassen geboren neuronen in de bulbus olfactorius met lentivirale transductie en LED-implantatie. Deze methode biedt specifieke controle over neuronale activiteit en gedrag.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Meer video's verkennen