Name: Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer cellulaire vetextractie voor gerichte analyse van bioactieve lipiden met stabiele isotoopverdunning en LC-MS. Deze methode biedt nauwkeurige kwantificering van metabolieten en inzicht in enzymatische routes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De meeste huidige bioanalytische methoden die beschikbaar zijn voor de meting van bioactieve lipiden zijn niet zo uitgebreid omdat ze geen chirale normale fase-chromatografie of SID omvatten. Chirale normale fase LC is cruciaal voor de scheiding van enantiomeren en om onderscheid te kunnen maken tussen enzym- of ROS-gemedieerde metabolisme. Het gebruik van SID zorgt ervoor dat menselijke fouten of complicaties die optreden tijdens extractie of analyse, worden meegenomen tijdens kwantificering. Deze toegevoegde componenten samen met ECAPCI-MRM maken dit de meest gevoelige, selectieve methode die beschikbaar is voor de analyse van bioactieve lipiden.

1. Standard en interne standaardmixen
<ol>
	<li>Voor de lipidextractie moet men een standaardmix (SM) en een interne standaardmix (ISM) bereiden. Voor de SM, gebruik een gekalibreerd spuitje om het gelijkwaardige volume van 1 μg van elke standaard (totaal 25) die in de onderstaande reagentietabel staan vermeld, te pipetten in een 10 mL volumetrische kolf. Droog de standaarden onder stikstof en stel ze weer op in 10 mL acetonitril (ACN). De uiteindelijke concentratie van de standaardmix zal 100 pg/μL zijn. Verdeel in 1 mL aliquoten en bewaar bij -80°C tot ze nodig zijn.</li>
	<li>Uit deze standaardmix kunnen 6 standaardverdunningen worden gemaakt voor een totaal van 7 kalibratiestandaarden (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL en 100 pg/ μL). Deze standaarden moeten samen met elke batch monsters worden uitgevoerd die worden voorbereid om de kalibratiecurve te ontwikkelen die wordt gebruikt bij kwantitatieve analyse.</li>
	<li>Voor de ISM, gebruik een gekalibreerd spuitje om het gelijkwaardige volume van 1 μg van elke IS (totaal 14) die in de onderstaande reagentietabel staan vermeld, te pipetten in een 10 mL volumetrische kolf en droog deze onder stikstof. Stel de ISM weer op in 10 mL ACN en verdeel in 1 mL aliquoten. De uiteindelijke concentratie van de ISM moet 100 pg/μL zijn. Er is genoeg ISM om 1000 monsters te verwerken.</li>
	<li>Bewaar de SM en ISM bij -80°C.</li>
</ol>
2. Collectie van media en cellysaat
<ol>
	<li>Voor elke 10 cm plaat van adherente cellen (~ 1 X 107), verzamel 3 mL media in een 10 mL glazen centrifugeerbuis. Was vervolgens de cellen 2 keer met fosfaat gebufferd zout (PBS). Voeg 1 mL PBS toe aan de plaat en schraap de cellen van de plaat en pipet ze in een tweede 10 mL glazen centrifugeerbuis. Op dit punt kunnen cellen en media worden opgeslagen als de procedure niet onmiddellijk wordt voortgezet. Bewaar monsters bij -80°C voor langdurige opslag of bij -20°C voor minder dan een week.</li>
</ol>
3. Extractie van lipiden uit media
<ol>
	<li>Vrije bioactieve lipiden worden gevonden in de cell media en deze worden gemakkelijk geëxtraheerd met een één-staps l-l extractieprocedure. Voeg aan het verzamelde media (2.1) 10 μL ISM toe. Op dit moment moeten 8 extra 10 mL glazen centrifugeerbuizen worden gelabeld #0-7 voor de kalibratiestandaarden. Voeg 3 mL PBS toe aan elk van deze buizen en voeg vervolgens 10 μL van de juiste SM toe aan buizen 1-7 (1-7 van 1.1).</li>
	<li>Laat de ISM 10 minuten in elk kalibratiestandaard en monster gelijkwaardig worden en voeg vervolgens 5 mL di-ethylether toe. De monsters en kalibratiestandaarden worden vervolgens op lage snelheid gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de shaker geplaatst.</li>
	<li>Na het schudden worden alle kalibratiestandaarden en monsters gedurende 10 minuten bij 1935 x g gecentrifugeerd. Vervolgens wordt met een Pasteur pipet de bovenste fase (organisch) overgebracht naar een nieuwe 10 mL glazen centrifugeerbuis en gedroogd onder stikstof.</li>
</ol>
4. Extractie van lipiden uit cellysaat
<ol>
	<li>Spin de cell monsters in de glazen centrifugeerbuizen bij 1935 X g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg; voeg 2 mL PBS toe aan elke buis en vortex kort. Verwijder 25 μL monster voor eiwitkwantificering. Het totale eiwit wordt gebruikt voor normalisatie van cellysaat.</li>
	<li>Vervolgens wordt de helft van het lysaat/PBS mengsel overgebracht naar een aparte 10 mL glazen centrifugeerbuis. Voeg aan elk monster een extra 2 mL PBS toe samen met 10 μL ISM. Volg het l-l extractieproces dat voor media wordt beschreven in 3.2 en 3.3. Deze aliquot zal worden gebruikt om vrije lipiden in de cellen te meten en alkalische afbraak van lipiden, zoals de prostaglandinen, te voorkomen. Deze aliquot ondergaat niet de stappen 4.3 en 4.4 die hieronder worden beschreven.</li>
	<li>De eerste stap van het geesterde lipiden l-l extractieproces vereist de toevoeging van 5 mL van CHCl3/MeOH (2:1) aan elk van de monsters. De monsters worden in een shaker op lage snelheid gedurende 30 minuten geplaatst. Na het schudden worden de monsters gedurende 10 minuten bij 1935 x g gecentrifugeerd. Vervolgens wordt met een Pasteur pipet de onderste (organische) laag van de l-l extractie overgebracht naar een nieuwe 10 mL glazen centrifugeerbuis en wordt het monster onder stikstof gedroogd.</li>
	<li>Geesterde lipiden moeten worden gesaponiseerd voordat ze worden gekwantificeerd. Nadat de monsters droog zijn, voeg 0,5 mL van 0,4N KOH in 80% MeOH toe aan elke buis. De monsters worden vervolgens 1 uur bij 60°C bewaard. Na de incubatie, voeg 2 mL PBS toe. Pas de pH aan tot 6 met geconcentreerd HCl zuur (~30 μL). Voeg 10 μL ISM toe aan elk monster. De rest van de procedure is hetzelfde als lipidenextractie uit media en kan worden gevolgd in 3.2 en 3.3.</li>
	<li>Als deze extracties gelijktijdig met de mediamonsters worden uitgevoerd, kunnen dezelfde kalibratiestandaarden worden gebruikt om een kalibratiecurve te ontwikkelen; als deze monsters op een ander tijdstip worden uitgevoerd, moeten kalibratiestandaarden ook worden verwerkt zoals beschreven in 3.1-3.3.</li>
</ol>
5. Pentafluorylbenzylbromide (PFB) derivatisering
<ol>
	<li>Aan de gedroogd monsters en kalibratiestandaarden, voeg 100 μL anhydrisch dichloromethaan (CH2Cl2) toe gevolgd door 100 μL van 20% (v/v) N,N-di-isopropylethylamine in anhydr

<ol><li>Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid metabolism.</a> Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).</li>
<li>Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereochemical+nature+of+the+products+of+linoleic+acid+oxidation+catalyzed+by+lipoxygenases+from+potato+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).</li>
<li>Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-derived+eicosanoids%3A+the+neglected+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Metastasis.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer.</a> Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+eicosanoids%3A+role+of+prostaglandin+F%282alpha%29+and+F-isoprostanes+in+inflammation+and+oxidative+stress+related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology.</a> Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).</li>
<li>Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+and+arachidonic+acid+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).</li>
<li>Hersberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+lipoxygenase+derived+lipid+mediators+in+atherosclerosis%3A+leukotrienes%2C+lipoxins+and+resolvins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins.</a> Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).</li>
<li>Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+implications+for+nutrigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutrigenet.+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics.</a> J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).</li>
<li>Capdevila, J. H., Falck, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+properties+of+the+cytochrome+P450+arachidonic+acid+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+IA+%22Encyclopedia+of+Mass+Spectrometry%22">Encyclopedia of Mass Spectrometry</a>. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn gedeclareerd.

De standaarden en interne standaarden die in dit protocol worden gebruikt, geven een weergave van een gerichte lipidomics-methode. Een Waters 2695-scheidingsmodule en Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra werden gebruikt voor de LC-MS-analyse en de optimale parameterinstellingen zijn te vinden in Tabel 1 en Tabel 2. Bovendien is dit extractieprotocol ontworpen voor aderente cellen, maar kan het worden aangepast voor andere celtypen en andere biologische matrices, waaronder urine, bloed en weef...

<table><tbody><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE Internal Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE Internal Standard</td></tr><tr><td>12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE Internal Standard</td></tr><tr><td>15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE Internal Standard</td></tr><tr><td>20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,17,18,18-d6 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE Internal Standard</td></tr><tr><td>9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE Internal Standard</td></tr><tr><td>13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2 Internal Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 Internal Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Internal Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Internal Standard</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8R-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11S-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>

cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie analyse

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Het metabolisme van vetzuren, zoals arachidonzuur (AA) en linolzuur (LA), resulteert in de vorming van geoxideerde bioactieve lipiden, inclusief talrijke stereo-isomeren1,2. Deze metabolieten kunnen worden gevormd uit vrije of geesterde vetzuren. Veel van deze geoxideerde metabolieten hebben biologische activiteit en zijn betrokken geweest bij verschillende ziekten, waaronder cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten, astma en kanker3-7. Geoxideerde bioactieve lipiden kunnen enzymatisch worden gevormd of door reactieve zuurstofsoorten (ROS). Enzymen die vetzuren metaboliseren omvatten cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO) en cytochroom P450 (CYPs)1,8. Enzymatische metabolisme resulteert in enantioselectief vorming terwijl ROS-oxidatie resulteert in de racemische vorming van producten.
Hoewel dit protocol zich voornamelijk richt op de analyse van AA- en enkele LA-afgeleide bioactieve metabolieten; kan het gemakkelijk worden toegepast op metabolieten van andere vetzuren. Bioactieve lipiden worden uit cellysaat of media geëxtraheerd met behulp van vloeistof-vloeistof (l-l) extractie. Aan het begin van het l-l-extractieproces worden stabiele isotoop interne standaarden toegevoegd om rekening te houden met fouten tijdens de monstervoorbereiding. Stabiele isotoopverdunning (SID) houdt ook rekening met eventuele verschillen, zoals ionisatiedemping, die metabolieten kunnen ervaren tijdens de massaspectrometrie (MS) analyse9. Na de extractie wordt derivatisering met een elektronvanger (EC) reagens, pentafluorylbenzylbromide (PFB) toegepast om de detectiegevoeligheid te verhogen10,11. Meervoudige reactiebewaking (MRM) wordt gebruikt om de selectiviteit van de MS-analyse te verhogen. Voor MS-analyse worden lipiden gescheiden met behulp van chirale normale fase hogeprestatievloeistofchromatografie (HPLC). De HPLC-omstandigheden zijn geoptimaliseerd om de enantiomeren en verschillende stereo-isomeren van de gemonitorde lipiden te scheiden12. Deze specifieke LC-MS-methode monitort prostaglandinen (PG's), isoprostanes (isoP's), hydroxyicosatetraeenzuur (HETE's), hydroxyoctadecadieenzuur (HODE's), oxoicosatetraeenzuur (oxoET's) en oxooctadecadieenzuur (oxoOD's); de HPLC- en MS-parameters kunnen echter worden geoptimaliseerd om enige vetzuurmetabolieten op te nemen13.
De meeste van de momenteel beschikbare bioanalytische methoden houden geen rekening met de afzonderlijke kwantificering van enantiomeren. Dit is uiterst belangrijk wanneer wordt getracht af te leiden of de metabolieten enzymatisch of door ROS zijn gevormd. Bovendien kunnen de verhoudingen van de enantiomeren bewijs leveren voor een specifiek enzymatische vormingsroute. Het gebruik van SID maakt nauwkeurige kwantificering van metabolieten mogelijk en houdt rekening met eventueel monsterverlies tijdens de voorbereiding evenals de verschillen die tijdens ionisatie worden ervaren. Het gebruik van de PFB-elektronvanger verhoogt de detectiegevoeligheid met twee ordes van grootte ten opzichte van conventionele APCI-methoden. Over het algemeen is deze methode, SID-LC-EC-atmosferische druk chemische ionisatie APCI-MRM/MS, een van de meest gevoelige, selectieve en nauwkeurige kwantificeringsmethoden voor bioactieve lipiden.

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

De methode heeft tot doel cellulaire bioactieve lipidemetabolieten nauwkeurig te kwantificeren door de combinatie van stabiele isotoopdilutie, cnor-fase, vloeistofchromatografie, elektronenvangst, atmosferische druk, chemische ionisatie en massaspectrometrie. Begin met het verzamelen van zowel media als celmonsters en voeg een mengsel van zware isotopen gelabelde interne standaard toe. Extraheer de bioactieve lipiden met organisch oplosmiddel, en deriviseer vervolgens de bioactieve lipiden met een elektronenvangstreagens. Ga verder met het nauwkeurig kwantificeren van de bioactieve lipiden door middel van vloeistofchromatografie.Massaspectrometrie door LCMS-analyse van zowel cellysaat als media resulteert in een nauwkeurige bepaling van de concentratie van gerichte bioactieve lipiden en de niveaus van individuele Anant ERs. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals omgekeerde fase vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en andere LCMS-methoden, is dat individuele en anters nauwkeurig worden gekwantificeerd door het gebruik van normale fase chromatografie en gestabiliseerde isotoopdilutie. De resulterende gegevens kunnen waardevolle inzichten bieden in de enzymatische paden die in de cel functioneren.Verzamel voor elke 10 centimeter plaat van een adherent cellen drie milliliter media in een glazen centrifugebuis van 10 milliliter. Was vervolgens de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe, schraap de cellen van de plaat en breng het monster over naar een tweede glazen centrifugebuis van 10 milliliter.Bereid acht extra buizen voor met drie milliliter PBS voor een kalibratiecurve. Voeg vervolgens 10 microliter van de juiste kalibratiestandaard toe aan elke buis. Lijn elke testmonster van de drie milliliter verzamelde celcultuurmedia uit voor de extractie van vrije bioactieve lipiden.Voeg 10 microliter intern standaardmengsel toe aan elke kalibratiestandaard en monster, laat 10 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen om monsters te verwerken bij vijf milliliter dathylether en plaats op een schudder gedurende 30 minuten. Centrifugeer de monsters en breng de bovenste organische fase over in glazen centrifugebuizen van 10 milliliter. Droog de monsters verder onder stikstof. Verzamel eerst de geoogste celmonsters door centrifugatie en suspendeer elk pallet in twee milliliter PBS door Vortex. Reserveer 25 microliter van elk monster voor normalisatie van het cellysaat.Deel nu elk lysate gelijkmatig in glazen centrifugebuizen van 10 milliliter. Voeg aan elk monster een extra twee milliliter PBS en 10 microliter ISM toe om vrije cellulaire lipiden te meten en alkalische degradatie van lipiden zoals prostaglandinen te voorkomen, gebruik een van elk monster duplicaat om dathylether extracties uit te voeren zoals eerder getoond. Om geesterde lipiden te extraheren, voeg vijf milliliter chloroform-methanol mengsel toe aan elk van de overgebleven monsters.Plaats op een schudder met lage snelheid gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten. Verzamel nu de onderste organische laag en droog de monsters onder stikstof om de geesterde lipiden te identificeren. Voeg 0,5 milliliter 0,4 normaal kaliumhydroxide in 80% methanol toe aan elke buis.Incubeer monsters gedurende een uur bij 60 graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter PBS toe en pas de pH aan op zes met geconcentreerd zoutzuur. Voeg ten slotte 10 microliter ISM toe aan elk monster en ga verder met dathylether extracties naar de gedroogde monsters en kalibratiestandaarden.Voeg derivatiseringsreagentia toe in de opgegeven volgorde. Vortex vervolgens de monsters en incubeer gedurende een uur bij 60 graden Celsius. Droog de monsters vervolgens onder stikstof voor opslag en analyse.Deze methode gebruikt een combinatie van stabiele isotoopdilutie, chii, vloeistofchromatografie, elektronenvangst, atmosferische druk, chemische ionisatie en massaspectrometrie analyse. Reconstitueer de monsters en kalibratiestandaarden in 100 microliter hexaan ethanol, en breng de volledige monsters over naar HPLC-violen met inzet. Plaats de monsters in de gekoelde autosampler. Maak een monsterlijst voor analyse.Stel vervolgens de HPLC- en MS-methoden in met behulp van de parameters beschreven in tabel een en tabel twee in het bijbehorende schriftelijke protocol voor de normale fasescheiding. Een chirale pack, een DH-kolom tot 30 graden Celsius, injecteer monster en begin de run. Zet nu de MS in negatieve ionmodus met behulp van de A PCI-bron.Begin met een hexane-blank om de kolom in evenwicht te brengen. Voer vervolgens de kalibratiestandaardmonsters uit in volgorde van toenemende SM-concentratie. Verwerk vervolgens monsters van cultuurmedia na de HBLC-scheiding.Voeg methanol post kolom toe om afzetting op de coronanaald te voorkomen. Gebruik data gegenereerd door de standaarden. Maak een kalibratiecurve door de monstergebied op de Y-as en de standaardconcentratie op de x-as uit te plotten, en leid de Y gelijk aan MX plus B-vergelijking af.Bepaal ten slotte de concentraties van bioactieve lipiden in de testmonsters voor de cel.Lysaten. Normaliseer deze waarden door de bepaalde concentratie van bioactieve lipiden te delen door het aantal cellen per plaat of het totale genormaliseerde eiwit in eerdere stappen. Gegevens uit meervoudige reactiemonitoring geven verschillende linolzuur en arachidonzuur aan.Geoxideerde metabolieten. 13 en negen, worden samen met de overeenkomstige 13 en negen Oxo ode afgeleid van linolzuur. Bovendien zijn a arachidonzuur warmtemetabolieten en hun geoxideerde producten ook aanwezig zoals verwacht.Er is een kleine verschuiving in de retentietijd van de gederiveerde interne standaard in vergelijking met de ongelabelde standaard. Belangrijk is dat dit protocol ook warmte en anters scheidt en unieke overgangen bepaalt voor de stereo-isomeren die kunnen resulteren uit enzymatische oxidatie van a arachidonzuur of uit reactie met reactieve zuurstofsoorten. Dit chromatogram toont bijvoorbeeld de scheiding tussen de r en s stereo-isomeren van vijf.Heat lipidomische analyse is een krachtige techniek voor de analyse van talrijke lipidesoorten. Dit experiment evalueert en kwantificeert bijvoorbeeld prostaglandinen, isop senes en leukotrieen B vier. Naast de warmte Oxo eets en omega gehydroxyleerde metabolieten, kan deze methode worden geoptimaliseerd voor de extractie van bioactieve lipiden uit andere biologische matrices zo

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Hier presenteren we een protocol te kwantificeren en kwalificeren van elke soort van de sphingomyelinase met behulp van meerdere reactie controle en MS/MS/MS mode, respectievelijk.

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

Dit artikel presenteert een modulair protocol voor weefsellipideomica en transcriptomica, en plasmalipideomica in neurologische ziektemuismodellen gericht op lipiden die ten grondslag liggen aan ontsteking en neuronale activiteit, membraanlipiden, stroomafwaartse boodschappers en mRNA-coderende enzymen / receptoren die ten grondslag liggen aan de lipidefunctie. Bemonsterings-, monsterverwerkings-, extractie- en kwantificeringsprocedures worden beschreven.

Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Hier wordt een methode gepresenteerd voor het screenen van lipidestructuren door middel van stabiele isotopenlabeling door gebruik te maken van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatie.

De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

Leer cellulaire vetextractie voor gerichte analyse van bioactieve lipiden met stabiele isotoopverdunning en LC-MS. Deze methode biedt nauwkeurige kwantificering van metabolieten en inzicht in enzymatische routes.

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

Meer video's verkennen