Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

De methode heeft tot doel cellulaire bioactieve lipidemetabolieten nauwkeurig te kwantificeren door de combinatie van stabiele isotoopdilutie, cnor-fase, vloeistofchromatografie, elektronenvangst, atmosferische druk, chemische ionisatie en massaspectrometrie. Begin met het verzamelen van zowel media als celmonsters en voeg een mengsel van zware isotopen gelabelde interne standaard toe. Extraheer de bioactieve lipiden met organisch oplosmiddel, en deriviseer vervolgens de bioactieve lipiden met een elektronenvangstreagens. Ga verder met het nauwkeurig kwantificeren van de bioactieve lipiden door middel van vloeistofchromatografie.

Massaspectrometrie door LCMS-analyse van zowel cellysaat als media resulteert in een nauwkeurige bepaling van de concentratie van gerichte bioactieve lipiden en de niveaus van individuele Anant ERs. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals omgekeerde fase vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en andere LCMS-methoden, is dat individuele en anters nauwkeurig worden gekwantificeerd door het gebruik van normale fase chromatografie en gestabiliseerde isotoopdilutie. De resulterende gegevens kunnen waardevolle inzichten bieden in de enzymatische paden die in de cel functioneren.

Verzamel voor elke 10 centimeter plaat van een adherent cellen drie milliliter media in een glazen centrifugebuis van 10 milliliter. Was vervolgens de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe, schraap de cellen van de plaat en breng het monster over naar een tweede glazen centrifugebuis van 10 milliliter.

Bereid acht extra buizen voor met drie milliliter PBS voor een kalibratiecurve. Voeg vervolgens 10 microliter van de juiste kalibratiestandaard toe aan elke buis. Lijn elke testmonster van de drie milliliter verzamelde celcultuurmedia uit voor de extractie van vrije bioactieve lipiden.

Voeg 10 microliter intern standaardmengsel toe aan elke kalibratiestandaard en monster, laat 10 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen om monsters te verwerken bij vijf milliliter dathylether en plaats op een schudder gedurende 30 minuten. Centrifugeer de monsters en breng de bovenste organische fase over in glazen centrifugebuizen van 10 milliliter. Droog de monsters verder onder stikstof. Verzamel eerst de geoogste celmonsters door centrifugatie en suspendeer elk pallet in twee milliliter PBS door Vortex. Reserveer 25 microliter van elk monster voor normalisatie van het cellysaat.

Deel nu elk lysate gelijkmatig in glazen centrifugebuizen van 10 milliliter. Voeg aan elk monster een extra twee milliliter PBS en 10 microliter ISM toe om vrije cellulaire lipiden te meten en alkalische degradatie van lipiden zoals prostaglandinen te voorkomen, gebruik een van elk monster duplicaat om dathylether extracties uit te voeren zoals eerder getoond. Om geesterde lipiden te extraheren, voeg vijf milliliter chloroform-methanol mengsel toe aan elk van de overgebleven monsters.

Plaats op een schudder met lage snelheid gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten. Verzamel nu de onderste organische laag en droog de monsters onder stikstof om de geesterde lipiden te identificeren. Voeg 0,5 milliliter 0,4 normaal kaliumhydroxide in 80% methanol toe aan elke buis.

Incubeer monsters gedurende een uur bij 60 graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter PBS toe en pas de pH aan op zes met geconcentreerd zoutzuur. Voeg ten slotte 10 microliter ISM toe aan elk monster en ga verder met dathylether extracties naar de gedroogde monsters en kalibratiestandaarden.

Voeg derivatiseringsreagentia toe in de opgegeven volgorde. Vortex vervolgens de monsters en incubeer gedurende een uur bij 60 graden Celsius. Droog de monsters vervolgens onder stikstof voor opslag en analyse.

Deze methode gebruikt een combinatie van stabiele isotoopdilutie, chii, vloeistofchromatografie, elektronenvangst, atmosferische druk, chemische ionisatie en massaspectrometrie analyse. Reconstitueer de monsters en kalibratiestandaarden in 100 microliter hexaan ethanol, en breng de volledige monsters over naar HPLC-violen met inzet. Plaats de monsters in de gekoelde autosampler. Maak een monsterlijst voor analyse.

Stel vervolgens de HPLC- en MS-methoden in met behulp van de parameters beschreven in tabel een en tabel twee in het bijbehorende schriftelijke protocol voor de normale fasescheiding. Een chirale pack, een DH-kolom tot 30 graden Celsius, injecteer monster en begin de run. Zet nu de MS in negatieve ionmodus met behulp van de A PCI-bron.

Begin met een hexane-blank om de kolom in evenwicht te brengen. Voer vervolgens de kalibratiestandaardmonsters uit in volgorde van toenemende SM-concentratie. Verwerk vervolgens monsters van cultuurmedia na de HBLC-scheiding.

Voeg methanol post kolom toe om afzetting op de coronanaald te voorkomen. Gebruik data gegenereerd door de standaarden. Maak een kalibratiecurve door de monstergebied op de Y-as en de standaardconcentratie op de x-as uit te plotten, en leid de Y gelijk aan MX plus B-vergelijking af.

Bepaal ten slotte de concentraties van bioactieve lipiden in de testmonsters voor de cel.Lysaten. Normaliseer deze waarden door de bepaalde concentratie van bioactieve lipiden te delen door het aantal cellen per plaat of het totale genormaliseerde eiwit in eerdere stappen. Gegevens uit meervoudige reactiemonitoring geven verschillende linolzuur en arachidonzuur aan.

Geoxideerde metabolieten. 13 en negen, worden samen met de overeenkomstige 13 en negen Oxo ode afgeleid van linolzuur. Bovendien zijn a arachidonzuur warmtemetabolieten en hun geoxideerde producten ook aanwezig zoals verwacht.

Er is een kleine verschuiving in de retentietijd van de gederiveerde interne standaard in vergelijking met de ongelabelde standaard. Belangrijk is dat dit protocol ook warmte en anters scheidt en unieke overgangen bepaalt voor de stereo-isomeren die kunnen resulteren uit enzymatische oxidatie van a arachidonzuur of uit reactie met reactieve zuurstofsoorten. Dit chromatogram toont bijvoorbeeld de scheiding tussen de r en s stereo-isomeren van vijf.

Heat lipidomische analyse is een krachtige techniek voor de analyse van talrijke lipidesoorten. Dit experiment evalueert en kwantificeert bijvoorbeeld prostaglandinen, isop senes en leukotrieen B vier. Naast de warmte Oxo eets en omega gehydroxyleerde metabolieten, kan deze methode worden geoptimaliseerd voor de extractie van bioactieve lipiden uit andere biologische matrices zo