Name: Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer hoe je gasfase vrije radicalen in sigarettenrook detecteert en kwantificeert met spin-trapping ESR-spectroscopie. Deze methode evalueert de opvangcapaciteit van plantaardige antioxidanten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health, subsidie ​​No NIH / NCRR P41-RR 016.292 (voor ACERT).

1. Materialen Alle oplosmiddelen gebruikt in dit werk werden reagens rang. De spin trap, inclusief N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN) en de standaard spin label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) werden verkregen van Sigma en werden gebruikt als geleverd. De plant anti-oxidanten werden commercieel verkregen van Swanson, Inc USA. 2. Voorbereiding van de sigarettenrook en de analyse van vrije radicalen <ol><li> Ter introductie van anti-oxidanten in het filter, werden de anti-oxidanten pycnogenol en druivenpit extract eerst opgelost in 95% ethanol, terwijl de lycopeen werd opgelost in aceton. Het oplosmiddel volumes waren verschillend, afhankelijk van de oplosbaarheid antioxidant. </li><li> De hoeveelheid anti-oxidanten van 0,4 mg / filter werd gebruikt. Ze werden vervolgens bedekt met 10 mg van de actieve kool. Voor dit doel actieve kool werd geroerd gedurende ~ 12 uur met de anti-oxidant oplossing in anaërobe omstandigheden, gefilterd en gedroogd onder vacuüm. </li> Antioxidanten zijn vervolgens ingevoerd in de conventionele acetaat filter (CA filter). Voor dit doel werd de filter in twee stukken gesneden. De gecoate plantaardige antioxidanten werden ingevoegd tussen de twee stukken van het filter en omwikkeld met een stukje plakband om een ​​filter te vormen - antioxidant-filter sandwich (Fig. 1A). Deze gecombineerde filter werd vervolgens bevestigd aan sigaretten, tabak bevattend staven. De controle filter is gemaakt in de dezelfde manier als de anti-oxidant filter, behalve geen antioxidant werd toegevoegd. <li> Voorafgaand aan de simulatie roken, werden de onderzoeks-sigaretten uitgepakt en bewaard in een constant vochtige omgeving (20 ° C, 60% relatieve vochtigheid) met behulp van een verzadigde NaBr oplossing voor een minimum van 2 dagen. </li><li> Roken simulatie voor routine-analyse werd uitgevoerd bij omgevingstemperatuur met behulp van een single-port roken apparaat dat, zoals weergegeven in figuur 1, bestaat uit een water aspirator of GAST DOA-P104-BN Vacuum Pomp / Air Compressor (Benton Harbor, Mich) aangesloten naar de spin-trappingmontage door middel van een T-splitsing met een kant open. Puffs werden uitgevoerd door het inpluggen van de open einde, die open gebleven tussen de trekjes. De gasstroom werd gecontroleerd door de debietmeter en ingesteld op ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s door het aanpassen van een klep geplaatst tussen de pomp en de opening. </li><li> Het onderzoek sigaretten werden gerookt onder de voorwaarde van bladerdeeg volume van 35 ml voor een duur van 2 seconden herhaald om de 60 seconden, vergelijkbaar met een. Roken simulatie voor kwantitatieve schatting van de gas-fase vrije radicalen werd uitgevoerd in samenwerking met de spin trapping systeem zoals getoond in Fig. 1. </li><li> Tien intense inhalaties (35 ml / puff) werden genomen voor elke sigaret. Gasfase vrije radicalen werden verzameld door het passeren van de MCS door een Cambridge filterkussen en vervolgens in de spin trapping-oplossing (0,05 M PBN in benzeen, 2,0 ml). </li><li> Na de laatste bladerdeeg, het borrelde trapping oplossing was aangepast aan zijn oorspronkelijke volume (2,0 ml) met dezelfde benzeen. Een hoeveelheid werd overgebracht in een ~ 250 mm lang, 3 mm ID glazen buis afgedicht aan een eind. </li><li> De trapping oplossing was zuurstofarme met behulp van een vries-dooi-pump procedure. Het was bevroren onder vloeibare stikstof, en een vacuum werd toegepast. Toen was het ontdooid onder argon atmosfeer, waardoor ingesloten gasbellen om te ontsnappen, en weer bevroren. Na deze cyclus werd drie keer herhaald, de buis werd vlam afgesloten onder vacuüm en worden gebruikt in de verdere ESR metingen. Deze stap is nodig omdat zuurstof, dat is goed oplosbaar in benzeen, verbreedt ESR lijnen van organische radicalen. Deoxygenatie verbetert drastisch de signaal-ruisverhouding. </li><li> X-Band ESR spectra werden opgenomen op een Bruker EMX spectrometer op een frequentie van 9,34 GHz onder standaard omstandigheden. De spectrometer instellingen gebruikt in de meeste experimenten zijn: center veld 3312.5G, scanbreedte 80G, modulatie amplitude 0.5G, de tijd constant 82 microseconden, scan-tijd 40 sec. </li><li> De spin trap adducten zijn relatief stabiel op de experimentele omstandigheden, die in sommige gevallen required 25 opeenhopingen, die doorgaans nam ~ 20 minuten. Echter, na 12 uur de intensiteit van de ESR-signalen in benzeen oplossing daalde met een factor van ~ 5. </li><li> Het kwantificeren van de concentratie van de vangst adduct, was zijn eerste eerste afgeleide ESR spectrum geïntegreerd. De resulterende absorptiespectrum toont een brede singlet achtergrond, waarschijnlijk door roet / teer producten in de rook. Na aftrek van deze achtergrond heeft de gescheiden triplet van de vangst adduct geïntegreerd was nog een keer (afb. 2). </li></ol> 3. Representatieve resultaten Het merendeel van de vrije radicalen in de brandende sigaret-geproduceerde rook (gas fase) zijn onmiddellijk en instabiel. Om deze radicalen zich aan een spin-trap-techniek is toegepast. Het vangt gas-fase vrije radicalen door ze te transformeren tot een spin adduct dat is stabieler en kan worden gedetecteerd door ESR (Fig.1). In de huidige studie, de spin-trap-oplossing van 0,05M PBN werd gebruikt om de rook-gas te verzamelen fase vrije radicalen, die een mengsel van zuurstof-en koolstof-gecentreerde radicalen die moeilijk te scheiden 15. In ons geval, echter, de waargenomen hyperfijne splitsing constanten een N = 13.7G en een H = 1.95G zijn zeer vergelijkbaar met de overeenkomstige waarden voor het vangen van adducten van alkoxygroepen vrije radicalen (Romeinen) 2, wat suggereert dat ze het belangrijkste product. We toonden aan dat zwakke ESR-signalen en een lage reproduceerbaarheid waargenomen in onze eerste metingen (afb. 2) waren het gevolg van het vocht in de rook flow. U lost dit probleem, voegden we een vloeibare stikstof (LN2) trap tussen de Cambridge filter en de spin val oplossing. De LN 2 val verwijderd water uit de MCS stroom door snelvriezen en het vastleggen van het op de binnenwand van de glazen buis. Deze sterk verbeterde ESR-signalen en toegestaan ​​voor zeer reproduceerbare resultaten (afb. 3). De hoeveelheid gevangen vrije radicalen werd bepaald met behulp van eenreferentiemonster. Voor controle monsters zonder anti-oxidanten, de typische adduct concentratie in benzeen geschat door vergelijking van zijn dubbele integraal spectrum met een dubbele integraal spectrum voor bekende concentratie van TEMPO was 1,24 uM (Fig.2). Omdat de hoeveelheid lucht die doorlopen elke sigaret tijdens het roken was ~ 350 ml, dit geeft een schatting voor de vrije radicalen concentratie in de gasfase van MCS van ~ 7.1X10 9 M, en een totaal aantal radicalen gevangen uit de gasfase van een hele sigaret van ~ 1.5X10 15. Een schatting voor de totale hoeveelheid vrije radicalen in de rook van een hele sigaret, met inbegrip van zowel gas-en deeltjes-fase, was ~ 10 16 vrije radicalen 9. Verschillende niveaus van de wegvangen effect van plantaardige anti-oxidanten op gas-fase vrije radicalen in de main stream sigarettenrook waargenomen. Hun wegvangen tarieven werden gepresenteerd in Fig. 4. Lycopeen en druivenpitten extract bleek dat de hoogste tarieven, terwijl een lageER werd waargenomen bij pycnogenol (Fig.4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een diagram van een verbeterde roken simulatie ontwerp voor het verzamelen van gasfase-vrije radicalen in het reguliere sigarettenrook (MCS) met behulp van spin-val. MCS werd getrokken door een water aspirator door CA filter, dan Cambridge filter (geel filter) en door een vloeibare stikstof trap naar H 2 O. verwijderen De gas-fase producten ging uiteindelijk te vangen draaien en wordt geleid door de spin trap oplossing. Plant antioxidant werd geplaatst tussen de twee stukken van conventionele acetaat filters (Vergrote in een cirkel A) aan sigaretten om vrije radicalen te scharrelen in het MCS. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een kwantitatieve raming voor de spin-trapping adduct concentratie in benzeen vereist aftrekken van een brede achtergrond signaal van de eerste integratiel spectrum. De hyperfijne splitsen parameters voor de spin-trapping adduct zijn een H = 1,95 G, een N = 13.7G. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Doorheen LN2 val verbetert de kwaliteit van de ESR-signalen verkregen door spin-vangen van MCS. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Effect van natuurlijke anti-oxidanten op de concentratie van vrije radicalen in MCS. De relatieve signaal intensiteiten zijn: controle - 100%, pycnogenol - 55%, druivenpitten extract - 12%, lycopeen - 10%.

<ol><li>Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+resonance+and+spin+trap+investigation+of+free+radicals+in+cigarette+smoke%3A+development+of+a+quantification+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure.</a> Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).</li>
<li>Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Free radicals in tobacco smoke.</a> Nature. 229, 500-500 (1971).</li>
<li>Church, D. F., Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+toxicological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications.</a> Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).</li>
<li>Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+effects+of+hemoglobin+and+related+heme+containing+compounds+on+nitric+oxide%2C+reactive+oxidants+and+carcinogenic+volatile+nitrosocompounds+of+cigarette+smoke.+a+new+method+for+protection+against+the+dangerous+cigarette+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents.</a> Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).</li>
<li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+carcinogens+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke carcinogens and lung cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).</li>
<li>Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+implication+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer.</a> Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).</li>
<li>Nair, A. K., Brandt, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+smoking+on+health+care+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oklahoma+State+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of smoking on health care costs.</a> Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).</li>
<li>Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Peroxyradicals+in+Cigarette+Smoke+and+the+Scavenging+Effect+of+Shikonin%2C+a+Naphthoquinone+Pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment.</a> Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).</li>
<li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+and+the+involvement+of+free+radical+reactions+in+chemical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis.</a> Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).</li>
<li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+radicals+and+the+role+of+free+radicals+in+chemical+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity.</a> Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).</li>
<li>Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+of+lycopene+from+tomato+processing+byproducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts.</a> J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).</li>
<li>Shopland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+use+and+its+contribution+to+early+cancer+mortality+with+a+special+emphesis+on+cigarette+smoking%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental.+Health.+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking.</a> Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).</li>
<li>Shrikhandle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wine+products+with+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Wine products with health benefits.</a> Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).</li>
<li>Valavanidis, A., Haralambous, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+by+electron+paramagnetic+resonance+of+free+radical+species+in+the+mainstream+and+sidestream+smoke+of+cigarettes+with+conventional+acetate+filters+and+%27bio-filters%27%5BTitle%5D)+AND+%22Redox.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'.</a> Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+stable+free+radicals+in+mechanisms+of+oxidative+damage%2C+carcinogenesis+and+synergistic+effects+with+other+respirable+particles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een betrouwbare schatting van het effect van verschillende vrije radicalen in tabaksrook vereist een reproduceerbare techniek voor kwantitatieve detectie van vrije radicalen. Eerder een, is aangetoond dat kleine hoeveelheden van de hogere concentratie spin-val-oplossingen in niet-polaire oplosmiddelen zijn het meest effectief in het vangen van vrije radicalen tegen tabaksrook. Sigarettenrook bevat altijd waterdamp uit de verbranding van organische verbindingen en de resterende vocht in tabak, die kunnen eindigen in het vangen oplosmiddel. Deze vermenging van water in de PBN spin-val-oplossing verlaagt aanzienlijk de levensduur van de spin vangen adducten en de intensiteit van de ESR-signalen. Het verwijderen van dit vocht door een eenvoudige passeren MCS door middel van een U-vormige buis gekoeld met vloeibare stikstof sterk verbeterde de kwaliteit van het ESR spectra in onze experimenten, ook al zijn sommige fractie van gasfase-radicalen kunnen ook worden gevangen op de bevroren ondergrond. Met behulp van tzijn techniek vergeleken we de relatieve efficiëntie van verschillende radicaal-scavenging natuurlijke verbindingen geïntroduceerd in sigarettenfilters. We vonden dat de lycopeen en druivenpitten extract onmiddellijk na de omzetting in sigarettenfilters zijn in staat om maximaal vangen tot 90% van de vrije radicalen uit de gasfase MSC. Dergelijke hoge wegvangen capaciteit gelederen deze goedkope gemakkelijk beschikbaar natuurlijke verbindingen behoren tot de meest efficiënte gemelde vrije radicalen beschermers, zoals hemoglobine-en shikonine 8,14. Maar in onze experimenten sigarettenfilters geladen met studeerde natuurlijke anti-oxidanten verloor een merkbaar deel van hun wegvangen capaciteit na een week van opslag bij kamertemperatuur. Oplossen van dit probleem kunnen stimuleren toekomstige toepassing van lycopeen en druivenpit extract in de commerciële sigarettenfilters.

een protocol voor het opsporen en opruiming gas-fase vrije radicalen in mainstream cigarette smoke

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Het roken van sigaretten wordt geassocieerd met menselijke kankers. Het is gemeld dat het merendeel van de sterfte aan longkanker wordt veroorzaakt door het roken van sigaretten 5,6,7,12. Hoewel tabak teer en aanverwante producten in het deeltje fase van sigarettenrook zijn belangrijke oorzaken van carcinogene en mutagene gerelateerde ziekten, sigarettenrook bevat aanzienlijke hoeveelheden vrije radicalen die ook worden beschouwd als een belangrijke groep van kankerverwekkende stoffen 9,10. Vrije radicalen vallen cel bestanddelen door het beschadigen van eiwitstructuur, lipiden en DNA-sequenties en verhoging van de risico&#39;s van de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker. Ingeademd radicalen produceren adducten die bijdragen aan veel van de negatieve gezondheidseffecten van tabaksrook in de longen 3. Er zijn studies uitgevoerd om vrije radicalen te verminderen in sigarettenrook de risico&#39;s van het roken veroorzaakte schade te verminderen. Het is gemeld dat de hemoglobine-en heem-bevattende verbindingen gedeeltelijk zou kunnen stikstofmonoxide, reactieve vangenoxidanten en kankerverwekkende vluchtige nitrosocompounds van sigarettenrook 4. Een &#39;bio-filter&#39; bestond uit hemoglobine en actieve kool werd gebruikt om de vrije radicalen scharrelen en te verwijderen tot 90% van de vrije radicalen van sigarettenrook 14. Echter, vanwege de kosten-ineffectiviteit, is het niet succesvol gecommercialiseerd. Een andere studie toonde aan een goede wegvangen efficiëntie van shikonin, een onderdeel van de Chinese kruidengeneeskunde 8. In de huidige studie hebben we verslag van een protocol voor de invoering van gemeenschappelijke natuurlijke antioxidant extracten in de sigaret filter voor het spoelen van gasfase vrije radicalen in sigarettenrook en het meten van het scharrelen effect op de gasfase van vrije radicalen in het reguliere sigarettenrook (MCS) met behulp van spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) spectroscopie 1,2,14. We toonden een hoge capaciteit wegvangen van lycopeen en druivenpit extract, die zouden kunnen wijzen op hun toekomstige toepassing in sigarettenfilters. Een belangrijk voordeel van deze pro&#39;smend aaseters is dat ze kunnen worden verkregen in grote hoeveelheden van bijproducten van tomaten-of wijn-industrie respectievelijk 11,13

Spin-trapping ESR spectroscopie werd gebruikt om het effect van plantaardige antioxidanten lycopeen, pycnogenol en druivenpittenextract op wegvangen van gas-fase vrije radicalen in sigarettenrook te bestuderen.

Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke

Sigarettenroken is geassocieerd met menselijke kankers. Er is gerapporteerd dat de meeste sterfgevallen door longkanker worden veroorzaakt door het roken van sigaretten 5,6,7,12. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid vrije radicalen in de hoofdstroom van tabaksrook te meten en de scavengcapaciteit van verschillende antioxidanten te beoordelenen. Dit wordt bereikt door eerst filters voor te bereiden die verschillende scavengerverbindingen bevatten, evenals controles zonder scavengerfilter. De voorbereiding wordt gevolgd door een rooksimulatie met de rook van onderzoeksigaretten, die door een spin-trapping-oplossing wordt geleid.Elektronenspinresonantie, afgekort ESR, wordt vervolgens gebruikt om spectra op te nemen van gevangen radicalen en van referentiemonsters. De daarna verkregen ESR-spectra worden onderworpen aan een routinematige analyse om het signaal van de gevangen gasfaseradicalen te scheiden van de achtergrond en om de radicaalconcentratie te kwantificeren met behulp van een referentiemonster. Uiteindelijk tonen de resultaten kwantitatieve informatie over het gehalte aan vrije radicalen in mainstream sigarettenrook en schattingen van de scavengingcapaciteit van natuurlijke antioxidanten via spin-trapping ESR-spectroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de analyse van tabaksrook, zoals gaschromatografie, is dat ESR specifiek gevoelig is voor vrije radicalen. De implicaties van deze techniek kunnen helpen bij het verminderen van de schadelijke effecten van tabaksrook, aangezien deze een belangrijke groep carcinogenen vormen. Deze methode kan inzicht bieden bij het bestuderen van vrije radicalen in rookgassen en kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals industriële rookuitlaat en uitstoot. Het National Biomedical Research Center voor electron spin resonance-technologie, ook bekend als een cert, is een resultaat van onze uitgebreide ervaring in de ontwikkeling van moderne ESR-technologie.Voor onderzoekers die zich bezighouden met elektronenspinresonantie bieden wij een breed scala aan diensten aan voor hen en voor de biomedische gemeenschap. Wij stellen onze faciliteiten regelmatig ter beschikking om antioxidanten in het sigarettenfilter te introduceren. Los eerst de antioxidanten, pycnogenol en druivenextract op in 95%ethanol en los lycopeen op in aceton.Pas de oplosmiddelvolumes aan op basis van de oplosbaarheid van de antioxidanten. Combineer vervolgens de opgeloste antioxidanten met actieve kool door deze gedurende ongeveer 12 uur onder anaerobe omstandigheden te roeren. Anaerobe omstandigheden worden bereikt door Argon door het mengsel te borrelen tijdens het roeren.Filter na incubatie de oplossing en droog deze onder vacuüm. Voeg vervolgens de antioxidanten en koolstof toe aan een conventioneel acetaatfilter door het filter eerst in twee stukken te snijden. Plaats de gecoate plantenantioxidanten tussen de twee stukken filter om een antioxidantenfilter-sandwich te vormen, en plaats deze opnieuw in de papieren cilinder van de sigaretten.Bereid het controlefilter op dezelfde manier voor als het antioxidantfilter, maar voeg vóór de experimentele opstelling geen antioxidant toe. De onderzoekssigaretten moeten worden uitgepakt en gedurende minimaal twee dagen in een omgeving met een constante vochtigheid worden bewaard met behulp van een verzadigde natriumbromide-oplossing. Neem de sigarettenstengels die tabak bevatten en bevestig deze aan het gecombineerde filter.Voer een rooksimulatie uit voor routineanalyse bij omgevingstemperatuur met behulp van een rookapparaat met één poort, dat bestaat uit een wateraspirator of vacuümpomp/luchtcompressor die via een T-stuk met één open uiteinde is verbonden met de spin-trapping-opstelling. Gebruik een debietmeter om de gasstroom te controleren en stel deze in op ongeveer 2,2 standard cubic feet per hour door een ventiel aan te passen dat tussen de pomp en de afvoer is geplaatst. Rook de onderzoeksigaretten met een intens puffingsvolume van 35 milliliters gedurende een periode van twee seconden en herhaal dit elke 60 seconden.Het open uiteinde van het rookapparaat moet worden afgedicht om trekjes te genereren en open worden gelaten tussen de trekjes door. Wanneer het uiteinde niet is afgedicht, is er weinig trek door de sigaret, wat overeenkomt met de omstandigheden tussen de trekjes. Neem voor elke sigaret 10 intense trekjes waarbij gasfase-vrije radicalen worden opgevangen door de hoofdstroom van de sigarettenrook door een Cambridge-filterpad te leiden en deze vervolgens in de spin-trapping-oplossing te introduceren.De vloeibare stikstofval verwijdert waterdamp uit de hoofdstroom van de rook, maar heeft geen wezenlijke invloed op de radicalen in de gasfase. Draag na de laatste trek een aliquot van de gebubbelde vangoplossing over naar een glazen monsterbuis van ongeveer 10 inch lang met een binnendiameter van drie millimeter. Aangezien zuurstof ESR-spectra verbreedt en de gevoeligheid van de methode verlaagt, moet de oplossing worden gedeoxygeneerd met de freeze-pump-thaw-methode door de buis eerst in vloeibare stikstof te dompelen, de oplossing vervolgens te vacuüm te trekken met een oliepomp en de oplossing daarna te ontdooien onder argon.Herhaal deze vries-pomp-dooi-methode meerdere keren. Sluit daarna de buis af onder vacuüm. De buis is nu gereed.Voor verdere ESR-metingen worden X-band ESR-spectra opgenomen op een Bruker EMX-spectrometer bij een frequentie van 9,34 gigahertz. Raadpleeg voor de standaardcondities het geschreven protocol voor de gebruikelijke spectrometerinstellingen. Voer voor deze experimenten 25 ESR-accumulaties uit, wat doorgaans ongeveer 20 minuten duurt.Hoewel de spin-trap-adducten relatief stabiel zijn onder de experimentele omstandigheden na 12 uur, nam de intensiteit van de ESR-signalen in benzeenoplossing met een factor vijf af. Om de concentratie van het trapping-adduct te kwantificeren, integreert u het initiële eerste afgeleide ESR-spectrum. Het resulterende absorptiespectrum vertoont een brede singulet-achtergrond, zeer waarschijnlijk veroorzaakt door roet- en teerproducten in de rook.Na aftrekking van deze achtergrond wordt het gescheiden triplet van het trapping-additief geïntegreerd. Doe dit nogmaals om de concentratie van de vrije radicalen te bepalen. De waarden van de dubbele integralen voor de spin-trapping-oplossing worden vergeleken met die van een oplossing van een nitrox-radicaal TEMPO met een bekende concentratie uit het hier gedemonstreerde experiment, evenals met aanvullende berekeningen in het geschreven protocol.Er werd een vrije radicaalconcentratie van ongeveer 7,1 × 10⁻⁹ M verkregen in de gasfase van de mainstreamrook van sigaretten. Hieruit werd vastgesteld dat het totale aantal radicalen dat uit de gasfase van een volledige sigaret is afgevangen rond de 1,5 × 10¹⁵ ligt. Tijdens dit experiment leidden de eerste metingen tot zwakke ESR-signalen en een lage reproduceerbaarheid vanwege het vocht in de rookstroom.Om dit probleem op te lossen, werd er een vloeibare stikstofval toegevoegd aan het apparaat voor rooksimulatie, tussen het Cambridge-filter en de spin-trapoplossing. De vloeibare stikstofval verwijderde water uit de hoofdstroom van de sigarettenrook door het snel te bevriezen en op de binnenwand van de glazen buis op te vangen. Dit verbeterde de ESR-signalen aanzienlijk en maakte zeer reproduceerbare resultaten mogelijk.Er werden verschillende niveaus van het scavenging-effect van plantenantioxidanten op vrije radicalen in de gasfase van mainstream sigarettenrook waargenomen, en hun scavenging-snelheden worden gepresenteerd. Lycopeen en druifenkernextract vertoonden de hoogste snelheden, terwijl voor pycnogenol een lagere snelheid werd waargenomen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan een uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de rook door een vloeibare stikstofval te leiden. Dit verbetert de kwaliteit van een SR-spectrum en de reproduceerbaarheid zodra deze is ontwikkeld. De techniek hielp onderzoekers in de gezondheidszorg en milieuwetenschappen bij het verkennen en vaststellen van de aanwezigheid van gezondheidsbedreigende vrije radicalen in diverse vluchtige verbindingen.Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe vrije radicalen in tabaksrook in de hoofdstroom kunnen worden gekwantificeerd om de schadelijke effecten van roken te verminderen.

a-protocol-for-detecting-scavenging-gas-phase-free-radicals

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren, kweken en het blootstellen van deze cellen om te mainstream sigarettenrook, om moleculaire reacties studie om deze milieu-toxine.

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Radicaal gebaseerde biomimetische chemie werd toegepast op opbouw libraries nodig biomarkerontwikkeling.

Free Radicals in Chemical Biology: van chemische gedrag tot Biomarker Development

Het doel van dit protocol is om humane organotypische 3D bronchiale en nasale weefselmodellen bloot te stellen aan mainstream sigarettenrook (CS) bij de lucht-vloeistofinterface. De impact van CS op de weefsels wordt vervolgens onderzocht met behulp van een cytochrome P450 activiteitsassay, een trilhaarcellenmeting en een systeembiologie-aanpak.

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Met behulp van geoptimaliseerde humane perifere bloedmononucleaire cel (PBMC) ex vivo assays, hebben we aangetoond dat een bereiding van een brandbaar tabaksproduct de door receptoren gemedieerde intracellulair uitgescheiden cytokinen en de cytolytische capaciteit van effector PBMC's duidelijk onderdrukt. Deze snelle assays kunnen nuttig zijn bij de evaluatie van producten en het begrijpen van de mogelijke langetermijneffecten van blootstelling aan tabak.

Methoden om Evalueer Cytotoxiciteit en Immuunsuppressie van brandbare Rookwaren Voorbereidingen

Het doel van het onderzoek was om de biologische impact van 15 bestanddelen van sigarettenrook te beoordelen door middel van een combinatie van een impedantie-gebaseerde real-time celanalysator en een op hoogwaardige inhoud gebaseerde (HCS)-platform voor toxicologische beoordeling in vitro. Dit onderzoek biedt informatie over effectieve doseringen, toxiciteit en werkingsmechanismen van de geteste verbindingen.

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Dit protocol beschrijft een methode om knaagdieren bloot te stellen aan elektronische sigarettendamp (E-damp) en sigarettenrook. Blootstellingskamers worden geconstrueerd door het aanpassen van verdovingskamers met een geautomatiseerd pompsysteem dat E-damp of sigarettenrook aan knaagdieren levert. Dit systeem kan gemakkelijk worden aangepast om veel experimentele eindpunten in te vullen.

Het vergelijken van de effecten van elektronische sigarettendamp en sigarettenrook in een roman<em&gt; In Vivo</em&gt; Belichtingssysteem

Hier beschrijven we een programmeerbare laboratorium-apparaat dat kan worden gebruikt voor het maken van extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret aërosol. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het maken van directe vergelijkingen tussen conventionele sigaretten en elektronische sigaretten, en een toegankelijk toegangspoort tot elektronische sigaret onderzoek.

Een Microcontroller beheerd apparaat voor de generatie van vloeibare extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret Aerosol

Elektronische sigaret (e-cig) gebruikers zijn toeneemt wereldwijd. Weinig, echter is bekend over de effecten op de gezondheid geïnduceerd door geïnhaleerde e-cig aërosolen. Dit artikel beschrijft een e-cig aërosol generatie techniek geschikt voor dierlijke blootstellingen en latere toxicologische studies. Dergelijke protocollen moeten experimenteel reproduceerbaar en gestandaardiseerde e-cig blootstelling systemen opzetten.

Generatie van elektronische sigaret aërosol door een apparaat van de derde-generatie-Machine-Vaping: toepassing op toxicologisch onderzoek

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Leer hoe je gasfase vrije radicalen in sigarettenrook detecteert en kwantificeert met spin-trapping ESR-spectroscopie. Deze methode evalueert de opvangcapaciteit van plantaardige antioxidanten.

Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke

Meer video's verkennen