Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid vrije radicalen in de hoofdstroom van tabaksrook te meten en de scavengcapaciteit van verschillende antioxidanten te beoordelenen. Dit wordt bereikt door eerst filters voor te bereiden die verschillende scavengerverbindingen bevatten, evenals controles zonder scavengerfilter. De voorbereiding wordt gevolgd door een rooksimulatie met de rook van onderzoeksigaretten, die door een spin-trapping-oplossing wordt geleid.

Elektronenspinresonantie, afgekort ESR, wordt vervolgens gebruikt om spectra op te nemen van gevangen radicalen en van referentiemonsters. De daarna verkregen ESR-spectra worden onderworpen aan een routinematige analyse om het signaal van de gevangen gasfaseradicalen te scheiden van de achtergrond en om de radicaalconcentratie te kwantificeren met behulp van een referentiemonster. Uiteindelijk tonen de resultaten kwantitatieve informatie over het gehalte aan vrije radicalen in mainstream sigarettenrook en schattingen van de scavengingcapaciteit van natuurlijke antioxidanten via spin-trapping ESR-spectroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de analyse van tabaksrook, zoals gaschromatografie, is dat ESR specifiek gevoelig is voor vrije radicalen. De implicaties van deze techniek kunnen helpen bij het verminderen van de schadelijke effecten van tabaksrook, aangezien deze een belangrijke groep carcinogenen vormen. Deze methode kan inzicht bieden bij het bestuderen van vrije radicalen in rookgassen en kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals industriële rookuitlaat en uitstoot. Het National Biomedical Research Center voor electron spin resonance-technologie, ook bekend als een cert, is een resultaat van onze uitgebreide ervaring in de ontwikkeling van moderne ESR-technologie.

Voor onderzoekers die zich bezighouden met elektronenspinresonantie bieden wij een breed scala aan diensten aan voor hen en voor de biomedische gemeenschap. Wij stellen onze faciliteiten regelmatig ter beschikking om antioxidanten in het sigarettenfilter te introduceren. Los eerst de antioxidanten, pycnogenol en druivenextract op in 95%ethanol en los lycopeen op in aceton.

Pas de oplosmiddelvolumes aan op basis van de oplosbaarheid van de antioxidanten. Combineer vervolgens de opgeloste antioxidanten met actieve kool door deze gedurende ongeveer 12 uur onder anaerobe omstandigheden te roeren. Anaerobe omstandigheden worden bereikt door Argon door het mengsel te borrelen tijdens het roeren.

Filter na incubatie de oplossing en droog deze onder vacuüm. Voeg vervolgens de antioxidanten en koolstof toe aan een conventioneel acetaatfilter door het filter eerst in twee stukken te snijden. Plaats de gecoate plantenantioxidanten tussen de twee stukken filter om een antioxidantenfilter-sandwich te vormen, en plaats deze opnieuw in de papieren cilinder van de sigaretten.

Bereid het controlefilter op dezelfde manier voor als het antioxidantfilter, maar voeg vóór de experimentele opstelling geen antioxidant toe. De onderzoekssigaretten moeten worden uitgepakt en gedurende minimaal twee dagen in een omgeving met een constante vochtigheid worden bewaard met behulp van een verzadigde natriumbromide-oplossing. Neem de sigarettenstengels die tabak bevatten en bevestig deze aan het gecombineerde filter.

Voer een rooksimulatie uit voor routineanalyse bij omgevingstemperatuur met behulp van een rookapparaat met één poort, dat bestaat uit een wateraspirator of vacuümpomp/luchtcompressor die via een T-stuk met één open uiteinde is verbonden met de spin-trapping-opstelling. Gebruik een debietmeter om de gasstroom te controleren en stel deze in op ongeveer 2,2 standard cubic feet per hour door een ventiel aan te passen dat tussen de pomp en de afvoer is geplaatst. Rook de onderzoeksigaretten met een intens puffingsvolume van 35 milliliters gedurende een periode van twee seconden en herhaal dit elke 60 seconden.

Het open uiteinde van het rookapparaat moet worden afgedicht om trekjes te genereren en open worden gelaten tussen de trekjes door. Wanneer het uiteinde niet is afgedicht, is er weinig trek door de sigaret, wat overeenkomt met de omstandigheden tussen de trekjes. Neem voor elke sigaret 10 intense trekjes waarbij gasfase-vrije radicalen worden opgevangen door de hoofdstroom van de sigarettenrook door een Cambridge-filterpad te leiden en deze vervolgens in de spin-trapping-oplossing te introduceren.

De vloeibare stikstofval verwijdert waterdamp uit de hoofdstroom van de rook, maar heeft geen wezenlijke invloed op de radicalen in de gasfase. Draag na de laatste trek een aliquot van de gebubbelde vangoplossing over naar een glazen monsterbuis van ongeveer 10 inch lang met een binnendiameter van drie millimeter. Aangezien zuurstof ESR-spectra verbreedt en de gevoeligheid van de methode verlaagt, moet de oplossing worden gedeoxygeneerd met de freeze-pump-thaw-methode door de buis eerst in vloeibare stikstof te dompelen, de oplossing vervolgens te vacuüm te trekken met een oliepomp en de oplossing daarna te ontdooien onder argon.

Herhaal deze vries-pomp-dooi-methode meerdere keren. Sluit daarna de buis af onder vacuüm. De buis is nu gereed.

Voor verdere ESR-metingen worden X-band ESR-spectra opgenomen op een Bruker EMX-spectrometer bij een frequentie van 9,34 gigahertz. Raadpleeg voor de standaardcondities het geschreven protocol voor de gebruikelijke spectrometerinstellingen. Voer voor deze experimenten 25 ESR-accumulaties uit, wat doorgaans ongeveer 20 minuten duurt.

Hoewel de spin-trap-adducten relatief stabiel zijn onder de experimentele omstandigheden na 12 uur, nam de intensiteit van de ESR-signalen in benzeenoplossing met een factor vijf af. Om de concentratie van het trapping-adduct te kwantificeren, integreert u het initiële eerste afgeleide ESR-spectrum. Het resulterende absorptiespectrum vertoont een brede singulet-achtergrond, zeer waarschijnlijk veroorzaakt door roet- en teerproducten in de rook.

Na aftrekking van deze achtergrond wordt het gescheiden triplet van het trapping-additief geïntegreerd. Doe dit nogmaals om de concentratie van de vrije radicalen te bepalen. De waarden van de dubbele integralen voor de spin-trapping-oplossing worden vergeleken met die van een oplossing van een nitrox-radicaal TEMPO met een bekende concentratie uit het hier gedemonstreerde experiment, evenals met aanvullende berekeningen in het geschreven protocol.

Er werd een vrije radicaalconcentratie van ongeveer 7,1 × 10⁻⁹ M verkregen in de gasfase van de mainstreamrook van sigaretten. Hieruit werd vastgesteld dat het totale aantal radicalen dat uit de gasfase van een volledige sigaret is afgevangen rond de 1,5 × 10¹⁵ ligt. Tijdens dit experiment leidden de eerste metingen tot zwakke ESR-signalen en een lage reproduceerbaarheid vanwege het vocht in de rookstroom.

Om dit probleem op te lossen, werd er een vloeibare stikstofval toegevoegd aan het apparaat voor rooksimulatie, tussen het Cambridge-filter en de spin-trapoplossing. De vloeibare stikstofval verwijderde water uit de hoofdstroom van de sigarettenrook door het snel te bevriezen en op de binnenwand van de glazen buis op te vangen. Dit verbeterde de ESR-signalen aanzienlijk en maakte zeer reproduceerbare resultaten mogelijk.

Er werden verschillende niveaus van het scavenging-effect van plantenantioxidanten op vrije radicalen in de gasfase van mainstream sigarettenrook waargenomen, en hun scavenging-snelheden worden gepresenteerd. Lycopeen en druifenkernextract vertoonden de hoogste snelheden, terwijl voor pycnogenol een lagere snelheid werd waargenomen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan een uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de rook door een vloeibare stikstofval te leiden. Dit verbetert de kwaliteit van een SR-spectrum en de reproduceerbaarheid zodra deze is ontwikkeld. De techniek hielp onderzoekers in de gezondheidszorg en milieuwetenschappen bij het verkennen en vaststellen van de aanwezigheid van gezondheidsbedreigende vrije radicalen in diverse vluchtige verbindingen.

Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe vrije radicalen in tabaksrook in de hoofdstroom kunnen worden gekwantificeerd om de schadelijke effecten van roken te verminderen.