Name: Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer live-cell imaging van caspase-3 gemedieerde apoptose in N19-oligodendrocyten met NucView 488. Deze methode maakt real-time monitoring van geprogrammeerde celdood mogelijk voor onderzoek naar gliale celbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit laboratorium is ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research, het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada, en de Multiple Sclerose Vereniging van Canada (MSSC). GSTS was de ontvanger van een Doctoral studententijd van de MSSC. We zijn dankbaar dat dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) voor de vele nuttige discussies en reacties op dit manuscript. We zijn dankbaar Biotium voor hun gulle gift van extra NucView 488 caspase-3.

1. Ontdooien en het kweken van cellen <ol><li> Verkrijgen voorraad bevroren vereeuwigd N19-oligodendroglia cellen van de lange termijn vloeibare stikstof winkels. </li><li> Dompel flacon met cellen bij 37 ° C waterbad tot de celsuspensie volledig ontdooid. </li><li> Voeg 7 ml DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) met een hoge-glucose aangevuld met 10% FBS (Foetaal Bovine Serum) en 1% penicilline / streptomycine tot een 10 cm cultuur plaat. </li><li> Voeg de cel-suspensie druppelsgewijs op de plaat, en zachtjes en rock de Petri plaat gelijkmatig verspreiden de cellen bewegen. </li><li> Cultuur-cellen bij 34 ° C / 5% CO 2 incubator. </li><li> Na 4 uur, aspireer media van platen om eventuele resterende DMSO (dimethylsulfoxide), die was gebruikt als een cryoprotectant te verwijderen en te vervangen door vers medium (7 ml DMEM met hoge glucose media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine) . </li></ol> 2. Passage Cellen <ol><li> Bij 70-80%samenvloeiing (4-7 dagen groei), aspireer media uit cellen. </li><li> Voeg 1 mL van 0,25% trypsine op de plaat. Pipet trypsine aan cellen (ongeveer 5 minuten) los te maken. </li><li> Maak de juiste verdunningen voor experimentele condities en passage een extra 10 cm bord voor toekomstige experimenten in een cel dichtheid niet minder dan 0,1 x 10 6 cellen / ml. </li></ol> Opmerking: Je moet passage je cellen ten minste twee keer na het ontdooien alvorens ze te gebruiken voor experimenten. 3. Tellen en Plating Cellen <ol><li> Tot op het bord cellen voor live-cell imaging, trypsinize zoals eerder beschreven. </li><li> Verwijder ongeveer 30 pi van cellen en tellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Plaats een ongecoat glas dekglaasje in een 6 wells plaat. Voeg cellen om de put bij een dichtheid van 0,1 x 10 6 cellen / ml in 2 ml fenol-vrij DMEM met hoge glucose media, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine, bij 34 ° C / 5% CO 2. </li><li> Toelatencellen een nacht (16-20 uur) groeien bij 34 ° C / 5% CO 2 voor transfectie. </li></ol> 4. Transfectie <ol><li> Combineer 100 pi serum-vrije media, 0,5-4 ug gezuiverd plasmide DNA, en 4 ul Fugene HD (Roche). Vortex voorzichtig te mengen. </li><li> Vortex opnieuw kort en laat het DNA te complex voor 5 min bij kamertemperatuur, en voeg vervolgens Fugene HD DNA-mengsel rechtstreeks aan de gekweekte cellen. Kantel de plaat voorzichtig te mengen. </li><li> De cultuur van de cellen voor een extra 48 uur bij 34 ° C / 5% CO 2 voorafgaand aan de behandeling of experimenten. </li></ol> 5. Voorbereiden Cellen voor live-cell imaging (LCI) <ol><li> Zet de LCI Chamlide live-cell instrument control box minimaal 1 uur voordat u wilt uw experiment te starten. De controle box regelt ook de temperatuur en luchtvochtigheid binnen de LCI Chamlide, en regelt de stroom van de voorgemengde 5% CO 2. </li></ol> Opmerking: Het is aan te raden omSchakel de control box tot 3 uur voor het begin van experimenten om ervoor te zorgen dat het hele podium 34 ° C bereikt Deze stap zal verminderen centraal drift, die wordt veroorzaakt door fluxulation en de thermische uitzetting van het metaal podium als het warmer wordt, tijdens de beeldvorming. <ol start="2"><li> Werken in een flow-kap, spray de Chamlide magnetische-type cultuur kamer, en pincet, met 70% ethanol en laat ze drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de cellen van incubator en bevestigen dat ze gezond zijn. Dienen te worden opgenomen hechtend en goed verspreid over de glazen dekglaasje met tal van membraan-processen. Cellen die worden benadrukt door transfectie zijn niet geschikt voor experimenten, en zal een kleiner aantal van proces-extensies, en hebben vaak een onregelmatig gevormde kern. </li><li> Kantel de 6-well plaat en verwijder het dekglaasje met een pincet. Plaats snel de dekglaasje cel omhoog in de bodemplaat van de cultuur kamer. Sta niet toe dat de dekglaasje om te drogen. </li><li> Bevestig de magnetische belangrijkstelichaam van de cultuur kamer en voeg 500 ul van de media van de oorspronkelijke 6-wells plaat op de bovenkant van het dekglaasje aan. Hergebruik van deze media zal verminderen de hoeveelheid stress die op de cellen wordt veroorzaakt door veranderingen in het milieu, en kan ook nuttig zijn voor de beoordeling van extracellulaire uitgescheiden factoren. </li><li> Plaats de glazen afdekplaat op de cultuur kamer. </li><li> Gebruik een KimWipe gespoten met 70% ethanol om eventuele resterende materiaal te verwijderen van de bodem van het dekglaasje, die zouden interfereren met microscopie. </li><li> Plaats de cultuur kamer in de 34 ° C / 5% CO 2 incubator gedurende 30 minuten. Deze stap zal ervoor zorgen dat de kamer zelf opwarmt tot 34 ° C te verminderen verschuiven van de dekglaasje als het metaal opwarmt. </li></ol> 6. Microscoop-instellingen Beelden werden hier verkregen met behulp van een Leica DMIRE2 omgekeerde microscoop met een aangepaste relais lens en de emissie filterwiel behuizing voor patroon laden van meerdere wielen (Quorum Technologies Inc, Guelph, ON). <ol><li> Helderveld - Lamp ingesteld op 2,5 V en de blootstelling tijd tot 240 ms. </li><li> Rood Fluorescent Protein (RFP) - Gain vastgesteld op 140 voor 200 ms. </li><li> Green Fluorescent Protein (GFP) - Gain vastgesteld op 140 voor 500 ms. </li><li> Onze microscoop heeft een dimbare lamp in plaats van een draaiende schijf om de hoeveelheid licht beschikbaar om cellen te controleren. Wij voeren onze experimenten met het licht op 90% van de maximale lamp intensiteit. </li></ol> 7. De behandeling van cellen met apoptose inducerende en NucView 488 caspase-3 substraat <ol><li> Het is belangrijk om grote voorraden van apoptose inductoren voor te bereiden van tevoren en ze bevriezen in porties, zodat de concentraties zullen in overeenstemming zijn tussen de experimenten. </li><li> De NucView 488 substraat is licht gevoelig. Bereid hoeveelheden van 15 ul te bevriezen / ontdooien, en op te slaan buizen te verminderen bij -20 ° C bedekt met aluminiumfolie. Werken met het omgevingslicht verlichting zo laag mogelijk om de blootstelling van de NucV te vermindereniew 488 substraat, licht voorafgaand aan het gebruik ervan. </li><li> Snel ophalen van de cultuur kamer van de incubator, zodat de cellen niet worden blootgesteld aan een vermindering van de temperatuur. Plaats de cultuur kamer op de milieu-kamer van de microscoop en gebruik klemmen aan de cultuur kamer te houden van bewegen. Op dit moment moet je ook dimmen verlichting in de kamer. </li><li> Zet de 5% voorgemengde CO 2 tank met dubbele regelaar. </li><li> Met behulp van de 10x doel, focus aan cellen op de computer monitor met behulp van bright-field microscopie vinden. Opmerking: je zou willen om de grootste numerieke apertuur van het doel te gebruiken met de gewenste vergroting van de blootstelling te verminderen. </li><li> Lever inductoren van apoptose van de cellen (in ons geval 80 mM kalium, of 100 mm glutamaat), kan een van de volgende methoden gebruikt. Wij zullen de levering van 80 mM kalium als een voorbeeld, met behulp van KCl opgelost als 10x concentraat in onze typische cultuur media. <ol><li> Media-uitwisseling by langzame en lokale perfusie: - Gebruik een peristaltische pomp uit te wisselen media in de cultuur kamer met nieuwe media die 80 mM kalium. - Het ene uiteinde van de slang zal leveren 10 ml van een voorraad van 80 mM kalium opgelost in fenol-vrij DMEM, en het andere uiteinde van de slang zal materiaal uit de kamer. - U wilt in ieder geval een 10x uitwisseling van media om ervoor te zorgen dat de media links in de kamer van de juiste concentratie van kalium is. - Na de media wordt uitgewisseld, voeg 3 ul NucView 488 substraat aan de media in de kamer. Pipet om te mengen. </li><li> Directe toevoeging van 80 mM K + en NucView 488 substraat media in de cultuur kamer: - Maak een 10x voorraad oplossing van 80 mM kalium opgelost in fenol-vrij DMEM. - Voeg 3 ul van NucView 488 substraat aan 50 ul van 10x 80 mM kalium. Pipet om te mengen. Voeg toe aan 500 ul fenol-vrij DMEM in cultuur kamer. Let op: deze methode isde voorkeur als u geïnteresseerd bent in het handhaven of het beoordelen van de groei of andere afgescheiden factoren die aanwezig kunnen zijn in de originele media. We hebben gevonden dat de NucView 488 ondergrond stabiel is in celkweek voor experimenten duren zo lang als 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-cell imaging <ol><li> Klik op de rode kanaal om getransfecteerde cellen weer te geven. </li><li> Selecteren en opslaan een tiental frames waar er meerdere getransfecteerde cellen, en sla deze &quot;XY stage punten&quot;. Afhankelijk van de hoeveelheid computergeheugen, kunt u beperkt tot het aantal stage punten die u in staat zal zijn te verwerven. </li><li> Hebben de microscoop beelden vastleggen (in bright-field, rode kanaal, en groene kanaal) in deze opgeslagen stadium punten om de 6 minuten. </li><li> Elke groene vlekken die zichtbaar is tijdens de vroege stadia van de experimenten geeft aan waarschijnlijk cellen die al ondergaan apoptose, als gevolg meestal om transfectie en / of milieu-stress. Apoptosis als gevolg van de experimentele behandelingen worden gedetecteerd op een later tijdstip bepaald in het experiment. </li></ol> 9. Statistische analyse <ol><li> Voor elk experiment hebben we het programma van de microscoop om meerdere XY punten te behalen om een ​​grote dataset efficiënt te verzamelen. Elk experiment wordt uitgevoerd in dubbele of drievoud, en de gegevens zijn samengesteld uit verschillende experimenten uitgevoerd op verschillende dagen. Van elke dataset, krijgen we te analyseren om 15 terreinen van bekijken en vergelijken de verhouding van caspase-negatieve cellen om caspase-positieve cellen (totaal aantal cellen in het gezichtsveld / totaal aantal van caspase-positieve cellen). </li><li> De opgenomen metingen van elke dataset zijn gegroepeerd in een grotere sample set en worden vervolgens met elkaar vergeleken met behulp van een ANOVA-tabel (p = 0,05). We tonen de standaardfouten van het gemiddelde (SEM) van elk experiment, en dan is het verschil in gemiddelden te vergelijken door het uitvoeren van een Tukey betekent vergelijkende test (p = 0,05) om te bepalen which behandelingen zijn significant verschillend van elkaar. </li></ol> 10. Representatieve resultaten We hebben beschreven een experiment om te illustreren hoe de NucView 488 substraat kan een verhoogde mate van apoptose van N19-OLG celculturen na een behandeling met een hoge extracellulaire kaliumconcentratie te geven. De N19-cellen werden getransfecteerd met RFP, en werden behandeld met 3 pi NucView 488 substraat (controle), of 3 pL NucView 488 substraat en 80 mm [K +] (behandeling). Cellen werden gecontroleerd en beelden werden verkregen over een 12 uur tijdsverloop, dat passend is voor studies met neurologische beledigingen (Figuur 1A). Tijdens controle omstandigheden, hebben we niet waarnemen significante hoeveelheden van apoptose in vergelijking met de 80 mm [K +] behandelde culturen (hashed box), die ongeveer 45% celdood toonden na 12 uur (Figuur 1B). De achtergrond groene signaal waarnemend in de controle-omstandigheden geeft de cellen die apoptose ondergaan zonder de toevoeging van extracellulaire kalium. Vrijwel geen van de cellen in het controle-experiment vertonen apoptose door de 12 h tijdstip, hoewel in andere situaties de experimenten kan nodig zijn om op langere termijn. Beelden werden verkregen met een 10x doelstelling. Bar = 100 urn. <img alt="Figuur 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Figuur 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Figuur 1. (A) A 12 h tijdsverloop experiment van de N19 OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal), samen met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal). Kweken werden behandeld met een uiteindelijke concentratie van 80 mM [K +] (links panelen), of geen behandeling als een controle (rechts panelen). Beelden werden verkregen op 6 min interval, en een significante activatie van gesplitst caspase-3 (groen-signaal) kan waarnemend in culturen die werden behandeld met 80 mM [K +] in de cel kernen (hashed box) ten opzichte van het controle-experiment. (B) Percentage van de gesplitste caspase-3-cellen (berekend door het totale aantal cellen in het gezichtsveld door het totale aantal van caspase-positieve cellen). In vergelijking met omstandigheden controle, zagen we rond de 45% celdood na K +-behandeling door 12 uur svideo 1. Een 12 h tijdsverloop experiment van de N19-OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal) met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal), samen met bright-field beelden en een drie-weg samengevoegde afbeelding, na behandeling met 80 mM [K +]. svideo 2. A 12 h tijdsverloop experiment van de N19-OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal) met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal), samen met bright-field images en een drie-weg samengevoegde afbeelding. Geen behandeling werd toegepast op de culturen en de N19-OLGs kunnen zien migreren door de microscoop veld in tegenstelling tot de celculturen behandeld met 80 mm [K +] (vergelijk met svideo 1).

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Hoewel dit is niet het enige fluorogene product beschikbaar is voor apoptose detectie, zijn er een aantal belangrijke voordelen aan het gebruik van de NucView 488 substraat. Een van de belangrijkste voordelen is de mogelijkheid om apoptose in levende cellen te volgen in real-time, terwijl de meeste alternatieve producten, verplicht cel lysis of hebben een slechte celdoorlaatbaarheid. Andere voordelen zijn een hoge gevoeligheid voor caspase-3-erkenning, een hoge celdoorlaatbaarheid, een lage cytotoxiciteit en geen interferentie met de progressie van apoptose. De ondergrond heeft ook een lage achtergrond fluorescentie totdat het wordt gesplitst en komt in de kern, welke achtergrond fluorescentie elimineert. De caspase-3 herkenningssequentie bevat 3 negatieve ladingen en het DNA-bindende kleurstof heeft een positieve lading 2. De DEVD-NucView 488 molecuul heeft dus een netto negatieve lading, die de activering en binding van de kleurstof voorkomt dat DNA in cellen waar caspase is niet actief. Maintaining consistentie tussen de experimenten is nodig om te kunnen betekenisvolle vergelijkingen tussen repliceert trekken. Een van de belangrijkste parameters om consistent is celdichtheid, omdat het van invloed op de snelheid van transfectie. Het verkrijgen van een hoge transfectie prijzen vereeuwigd N19-OLG celculturen is moeilijker dan met andere gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa of HEK293, en is sterk afhankelijk van de dichtheid, in onze ervaring 12, 13. Onze beste transfectie efficiency voor deze cellen zijn verkregen met Fugene HD (Roche) en zijn normaal gesproken ongeveer 15%, maar kan oplopen tot meer dan 30%, afhankelijk van het construct. Zorgvuldige cel tellen zal helpen bij het verkrijgen van consistente transfectie tarieven. Het is ook belangrijk om cellen bloot te leggen van verschillende behandelingen om dezelfde mate van belasting van het milieu, in het bijzonder bij het meten van de tarieven van apoptose. Met name de lengte van de periode waarin de cellen worden blootgesteld aan transfectie reagentia, of het bedrag van de blootstelling aan licht, zijn belangrijke milieu variables te overwegen, en moet constant blijven over de experimenten. Voor onze toepassingen, we hebben ontdekt dat het verzamelen van een groot aantal gebieden-of-view een voldoende grote steekproef biedt om statistisch significante vergelijkingen [idem].

Tabel van specifieke reagentia en apparatuur <table border="1"><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> NucView 488 caspase-3 Assay Kit voor levende cellen </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> Fugene HD transfectiereagens </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsine </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5 tot 25 mm glazen dekglaasje </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnetische cultuur kamer voor 25 mm dekglaasje </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart weefselkweek 10 cm schalen </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-well weefselkweek gerechten </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en cleaveable fluorogene-dye substraten na kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Het centrale zenuwstelsel kan ervaren een aantal spanningen en neurologische beledigingen, die kan hebben tal van nadelige effecten die uiteindelijk leiden tot een vermindering van de neuronale populatie en functie. Beschadigde axonen kan vrijgeven excitatoire moleculen, waaronder kalium of glutamaat in de extracellulaire matrix, die op hun beurt verder kunnen beledigen en schade voor de ondersteunende gliacellen inclusief astrocyten en oligodendrocyten 8, 16 te produceren. Als de belediging aanhoudt, zal cellen ondergaan geprogrammeerde celdood (apoptose), die geregeld wordt en geactiveerd door een aantal gerenommeerde signaaltransductiecascades 14. Apoptose en weefselnecrose kunnen optreden na traumatisch hersenletsel, cerebrale ischemie, en epileptische aanvallen. Een klassiek voorbeeld van apoptotische regelgeving is de familie van cysteïne-afhankelijke aspartaat-gericht proteasen, of caspases. Geactiveerde proteasen waaronder caspases zijn ook betrokken bij celdood in reactie op chronische neurodegeneratieve ziekten, waaronder Alzheimer, Huntington en Multiple Sclerose 4, 14, 3, 11, 7. In dit protocol beschrijven we het gebruik van de NucView 488 caspase-3-substraat om de snelheid van caspase-3 gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt (OLG) celculturen 15, 5 te meten, na blootstelling aan verschillende extracellulaire stress, zoals hoge concentraties kalium of glutamaat. De voorwaardelijk-vereeuwigd N19-OLG cellijn (die de O2A stamvader) werd verkregen van Dr Anthony Campagnoni (UCLA Semel Instituut voor Neurowetenschappen) 15, 5, en is al eerder gebruikt om de moleculaire mechanismen van myeline de genexpressie en signaaltransductie toonaangevende studie naar OLG differentiatie (bijvoorbeeld 6, 10). Wij hebben gevonden deze cellijn te robuust zijn met betrekking tot transfectie met exogeen myeline basis eiwit (MBP) bouwt gefuseerd aan een RFP of GFP (rood of groen fluorescerend eiwit) 13,12. Hier werden de N19-OLG celculturen behandeld met ofwel 80 mM kaliumchloride of 100 mM natrium glutamaat om axonale lekkage na te bootsen in de extracellulaire matrix te induceren apoptose 9. We gebruikten een bi-functioneel caspase-3-substraat met een DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 erkenning subunit en een DNA-bindende kleurstof 2. De ondergrond komt al snel het cytoplasma waar het wordt gesplitst door intracellulaire caspase-3. De kleurstof, NucView 488 is vrijgegeven en komt in de celkern waar het bindt DNA en licht groen bij 488 nm, signalering apoptose. Gebruik van de NucView 488 caspase-3-substraat zorgt voor live-cell imaging in real-time 1, 10. In deze video, we beschrijven ook het kweken en transfectie van geïmmortaliseerde N19-OLG-cellen, maar ook live-cell imaging technieken.

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van de<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase-3-substraat. Deze techniek is toepasbaar voor geprogrammeerde celdood testen in real-time in een verscheidenheid van soorten cellen en weefsels.

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Het centraal zenuwstelsel kan worden blootgesteld aan een reeks stressfactoren en neurologische beschadigingen, die talrijke nadelige effecten kunnen hebben die uiteindelijk leiden tot een ...

Deze procedure maakt het mogelijk om de celdood van oligo DDR-gliacellen in real-time te monitoren. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te kweken, waarna de cellen worden voorbereid voor live-cell imaging. De volgende stap is het behandelen van de cellen en het monitoren van de effecten met behulp van fluorescentiemicroscopie.De laatste stap is het uitvoeren van de data-analyse. Uiteindelijk tonen de resultaten de sterftecijfers van cellen in een celpopulatie na een behandeling of stimulus door de nucleaire fluorescentie van een caspase-geactiveerde fluorescente kleurstof te monitoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunokleuring is de mogelijkheid om gelijktijdig meerdere tijdspunten vast te leggen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals reacties op farmacologische behandelingen, reagentia en diverse andere behandelingen. Momenteel kan deze methode inzicht bieden in celdood binnen celculturen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals ex vivo organotypisch weefsel, waaronder hersensnijden.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben bij de overgang van het werken met gefixeerd weefsel naar levend weefsel. Een visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk, aangezien er veel meer stappen nodig zijn voor het voorbereiden van levende celmonsters in vergelijking met gefixeerd weefsel. Ontdooi eerst bevroren geïmmortaliseerde N 19 oligo droog gliale cellen in een waterbad van 37 °C terwijl de cellen ontdooien.Voeg zeven milliliter high glucose DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine, toe aan een kweekschaal van 10 centimeter. Voeg vervolgens de cel-suspensie druppelgewijs toe aan de plaat en schud de Petrischaal voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Kweek de cellen vier uur lang bij 34 graden Celsius in een incubator met 5 procent koolstofdioxide.Aspireer het medium uit de platen om eventuele resterende DMSO-cryoprotectant te verwijderen. Vervang dit na vier tot zeven dagen groei door zeven milliliter vers medium. Wanneer de cellen een confluentie van 70 tot 80% hebben bereikt, aspireer dan het medium en pipetteer één milliliter druppels op de cellaag, en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.Oogst vervolgens de cellen en zaai ze in een weefselkweekschaal van 10 centimeter met de geoogste cellen bij een dichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter, en plaats deze schaal in de weefselkweekincubator. Na nog één passage kunnen de cellen worden uitgeplaat voor live-cell imaging-experimenten. Hiervoor oogst u de cellen zoals voorheen, neem dan 30 µL van de celsuspensie en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Plaats vervolgens met steriele pincetten onbehandelde glazen dekglasjes. Voeg in de wells van een six-well plaat cellen toe aan de well met een dichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter. Laat de cellen vóór transfectie overnacht groeien bij 34 °C en 5% CO2 in twee milliliter fenolvrij DMEM high glucose medium, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.Combine de volgende dag 100 µL serumvrij medium, 0,5 tot 4 µg gezuiverd plasmid-DNA en 4 µL FUgene HD. Vortex het mengsel voorzichtig twee keer en laat het DNA vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur complexeren. Wanneer de incubatietijd is verstreken, voegt u het FUgene HD-DNA-mengsel direct toe aan de gekweekte cellen.Kantel de plaat voorzichtig om te mengen. Kweek de cellen vervolgens nog 48 uur bij 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voorafgaand aan de behandeling of experimenten. Zet eerst de controlebox van het LCI Cham light live cell instrument aan.Dit dient drie uur voordat het experiment begint te gebeuren om een grondige opwarming van de objecttafel te garanderen. De bedieningskast moet in ieder geval één uur voor de start van het experiment worden ingeschakeld. Spuit vervolgens, terwijl u in een laminaire flowkast werkt, de LCI Cham light magnetische kweekkamer en de pincet in met 70% ethanol en laat deze vijf minuten drogen.Haal de cellen uit de incubator en onderzoek ze onder de microscoop om te bevestigen dat ze gezond zijn. De cellen moeten er turgid uitzien en goed verspreid zijn op het glazen dekglas, met talrijke membraanuitlopers. Cellen met een verminderd aantal procesuitlopers of een onregelmatig gevormde kern zijn waarschijnlijk gestrest door de transfectie en zijn ongeschikt voor verdere experimenten in de laminaire flowkast.Kantel de zeswellenplaat en verwijder het dekglas met een pincet. Plaats het dekglas snel met de celzijde naar boven in de bodemplaat van de kamer. Laat het dekglas niet uitdrogen.Bevestig vervolgens het magnetische hoofdlichaam van de kweekkamer en voeg 500 µL medium uit de oorspronkelijke zes-wellplaat toe aan de bovenkant van het dekglas. Het hergebruiken van het medium vermindert de stress voor de cellen die wordt veroorzaakt door omgevingsveranderingen en kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van extracellulair uitgescheiden factoren. Nadat het medium is toegevoegd, wordt het glazen kap op de kweekkamer geplaatst en wordt een Kim wipe met 70% ethanol gebruikt om eventuele restmaterialen van de onderkant van het dekglas te verwijderen die de microscopie kunnen hinderen.Plaats de kweekkamer gedurende 30 minuten in de incubator bij 34 °C en 5% koolstofdioxide. Deze stap zorgt ervoor dat de kamer zelf opwarmt tot 34 °C om verschuiving van het dekglas te verminderen. Terwijl het metaal opwarmt, is het noodzakelijk om tijdens de volgende stappen met een zo laag mogelijke omgevingsverlichting in de kamer te werken.Ten eerste had Thora eerder een aliquoot van nuke view bij kamertemperatuur klaargezet. Haal vervolgens de kweekkamer uit de incubator en plaats deze snel in de omgevingskamer van de microscoop. Zet de 5% vooraf gemengde kooldioxidecilinder met dubbele regelaar aan.Gebruik vervolgens het 10x objectief, waarbij de microscooplamp is ingesteld op ongeveer 2,5 volt en de belichtingstijd op 240 milliseconden. Focus met behulp van helderveldmicroscopie om de cellen op de computermonitor te visualiseren. Voeg daarna een concentratie van 80 millimol kaliumionen of een andere apoptose-induceerder toe aan de cellen via mediumwissel met langzame en lokale perfusie met behulp van een peristaltische pomp.Het nuke view 4 88 substraat is stabiel in celkweek voor experimenten met een duur tot 36 uur. Daarom is het mogelijk om experimenten over deze tijdsperiode uit te voeren. Stel eerst de microscoop zo in dat fluorescentie van rood en groen fluorescerend eiwit gevisualiseerd kan worden.Klik vervolgens op het rode kanaal om de getransfecteerde cellen weer te geven. Selecteer en sla ongeveer 12 frames op waarin meerdere getransfecteerde cellen zichtbaar zijn en sla deze XY-tabelposities op. Stel de microscoop zo in dat er elke zes minuten beelden in het brightfield-rode kanaal en het groene kanaal worden vastgelegd op deze opgeslagen posities.Nadat meerdere XY-punten zijn verzameld uit dubbele of driedubbele experimenten, compileert u de gegevens van afzonderlijke experimenten die op verschillende dagen zijn uitgevoerd en voert u de data-analyse en statistische toetsing uit zoals beschreven in het geschreven protocol om de verhouding tussen negatieve CASP-bay-cellen en positieve CASP-bay-cellen te vergelijken. Nuke view 4 88-substraat kan wijzen op een verhoogde apoptosesnelheid van N 19-oligo DDR-gliale celculturen. Na een behandeling met een hoge extracellulaire kaliumconcentratie werden deze basislijnbeelden verkregen met een 10-voudig objectief.De N 19-cellen werden getransfecteerd met RFP en behandeld met óf drie µL Nuke View 488-substraat voor de controlecellen, óf drie µL Nuke View 488-substraat en 80 mM kalium. Deze beelden illustreren dat het aantal apoptotische cellen in de loop van de tijd toeneemt, drie, zes en negen uur na behandeling met 80 mM kalium; onder controlecondities werden geen significante hoeveelheden apoptose waargenomen in vergelijking met de met 80 mM kalium behandelde culturen. Het groene achtergrondsignaal dat onder de controlecondities werd waargenomen, duidt op de cellen die apoptose ondergaan zonder de toevoeging van extracellulair kalium.Een tijdscursus van 12 uur is adequaat voor studies naar neurologische beschadigingen. Na 12 uur vertoonden de met kalium behandelde culturen ongeveer 45% celsterfte. Vrijwel geen van de cellen in het controle-experiment vertoont apoptose op het tijdstip van 12 uur. Hoewel in andere situaties de experimenten wellicht langer moeten doorlopen.Deze grafiek toont de toename van caspase three-positieve cellen gedurende het tijdsverloop van het 12-urige experiment. Eenmaal geoptimaliseerd kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd en kunnen de gegevens gedurende de nacht worden verzameld als dit correct wordt gedaan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om consistent te blijven tussen de behandelingen na het volgen van deze methode.Andere methoden, zoals immunokleuring, kunnen worden gebruikt om andere stroomafwaartse eiwitten te bestuderen die betrokken zijn bij de onderzochte signaalpaden. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u monsters voor beeldvorming voorbereidt. Verzamel een dataset en analyseer uw gegevens.

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video describes an in vitro Caspase-3/7 luminescent assay to quantify cell death or apoptosis. The assay measures luminescence produced following caspase-3/7 cleavage of a pro-luminescent DEVD substrate. The luminescence generated is proportional to caspase-3/7 activity.

Caspase-3/7 Assay: A Luminescence-Based Assay to Quantify Apoptosis by Measuring Caspase-3/7 Activities in Frog Skin Explants

This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Dit protocol beschrijft een live-cel beeldvormingsmethode voor het monitoren van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose, met behulp van fluorescerende sondes die veranderingen in de integriteit en verzuring van het lysosomale membraan detecteren.

Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

Leer live-cell imaging van caspase-3 gemedieerde apoptose in N19-oligodendrocyten met NucView 488. Deze methode maakt real-time monitoring van geprogrammeerde celdood mogelijk voor onderzoek naar gliale celbiologie.

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie (Video) | JoVE Journal

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Meer video's verkennen