Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Deze procedure maakt het mogelijk om de dood van oligo DDR gliacellen in realtime te monitoren. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te kweken en vervolgens de cellen voor te bereiden voor beeldvorming van levende cellen. De volgende stap is om een behandeling aan de cellen te geven en de effecten te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie.

De laatste stap is het uitvoeren van gegevensanalyse. Uiteindelijk tonen de resultaten de snelheid van celdood in een celpopulatie na een behandeling of stimulus door het monitoren van nucleaire fluorescentie van een caspase-geactiveerde fluo-kleurstof. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals immunokleuring, is de mogelijkheid om op verschillende tijdstippen tegelijkertijd gegevens te verzamelen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals reacties op farmacologische, reagentia en verschillende behandelingen. Nu kan deze methode inzicht geven in de dood binnen celculturen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals ex vivo, organotypisch weefsel, inclusief hersensneden.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden om zich aan te passen aan het werken met levend weefsel in plaats van gefixeerd weefsel. Visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk, omdat er veel stappen zijn om levende celmonsters voor te bereiden in vergelijking met gefixeerd weefsel. Ontdooi eerst ingevroren geïmmortaliseerde N 19 oligo droog gliacellen in een 37 graden Celsius waterbad terwijl de cellen ontdooien.

Voeg zeven milliliter hoog glucose DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline streptomycine toe aan een 10 centimeter kweekschaal. Voeg vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs toe aan de plaat en roer de petrischaal voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Kweek de cellen gedurende vier uur bij 34 graden Celsius in een 5 procent koolstofdioxide incubator.

Aspergeer het medium van de platen om eventueel overgebleven DMSO te verwijderen.Cryoprotectant. Vervang met zeven milliliter vers medium na vier tot zeven dagen groei. Wanneer de cellen 70 tot 80%Confluëntie hebben bereikt, aspireer het medium en pipet een milliliter druppels op de celplaat, gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen.

Verzamel vervolgens de cellen om ze vervolgens te zaaien, een 10 centimeter weefselkweekschaal met de verzamelde cellen met een dichtheid van 0,1 maal 10 tot de zesde cel per milliliter, en plaats deze schaal in de weefselkweekincubator. Na nog een massage kunnen de cellen worden geplaatst voor experimenten met beeldvorming van levende cellen. Om dit te doen, verzamel de cellen zoals eerder, verwijder 30 microliters van de celsuspensie en tel de cellen met behulp van een hemo cytometer.

Gebruik vervolgens steriele pincetten om ongecoate glazen deksels te plaatsen. Voeg in de putjes van een zes-putjes plaat cellen toe in de put met een dichtheid van 0,1 maal 10 tot de zesde cel per milliliter. Laat de cellen groeien in twee milliliter fenolvrij DMEM hoog glucose medium aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline streptomycine gedurende een nacht bij 34 graden Celsius en 5%koolstofdioxide voor transfectie.

De volgende dag combineer 100 microliters serumvrij medium 0,5 tot vier microgram gezuiverd plasmide, DNA en vier microliters FU gen hd. Vorm het mengsel zachtjes twee keer en laat het DNA vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur complexeren. Voeg na de incubatietijd de FU gen HD DNA-mengsel rechtstreeks toe aan de gekweekte cellen.

Kanteel de plaat zachtjes om te mengen. Kweek vervolgens de cellen gedurende nog eens 48 uur bij 34 graden Celsius en 5%koolstofdioxide voordat u behandeling of experimentering uitvoert. Zet eerst de LCI Cham light live cel instrument control box aan.

Dit moet drie uur voor het begin van het experiment worden gedaan om een goede opwarming van de stage te garanderen. Minimaal moet de controlebox een uur voor het begin van het experiment worden ingeschakeld. Vervolgens, werkend in een flowhood, spuit de LCI Cham light magnetische type kweekkamer en de pincetten met 70%ethanol en laat ze vijf minuten drogen.

Haal de cellen uit de incubator en onderzoek ze onder de microscoop om te bevestigen dat ze gezond zijn. De cellen moeten duurzaam en goed verspreid op het glazen deksel verschijnen met talrijke membraanprocessen. Cellen met een verminderd aantal procesuitbreidingen of een onregelmatig gevormde kern zijn waarschijnlijk gestrest van transfectie en zijn ongeschikt voor verdere experimenten in de flowhood.

Kanteel de zes-putjes plaat en verwijder het deksel met behulp van pincetten. Plaats snel het deksel met de celzijde omhoog in de onderplaat van de kamer. Laat het deksel niet drogen.

Bevestig vervolgens het magnetische hoofdlichaam van de kweekkamer en voeg 500 microliters medium van de originele zes-putjes plaat toe op de bovenkant van het deksel. Het hergebruiken van het medium vermindert de hoeveelheid stress die de cellen ondervinden door omgevingsveranderingen en kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van extracellulaire uitgescheiden factoren. Nadat het medium is toegevoegd, plaatst u het glazen deksel op de kweekkamer en gebruikt u een Kim wipes draad met 70%ethanol om eventueel overgebleven materiaal dat de microscopie zou kunnen storen van de onderkant van het deksel te verwijderen.

Plaats de kweekkamer in de 34 graden Celsius en 5%koolstofdioxide incubator gedurende 30 minuten. Deze stap zorgt ervoor dat de kamer zelf opwarmt tot 34 graden om verplaatsing van het deksel te voorkomen. Terwijl het metaal opwarmt, is het noodzakelijk om met zo laag mogelijk omgevingslicht te werken tijdens de volgende stappen.

Eerst, Thora eerder bereide elequa van nuke view bij kamertemperatuur. Haal vervolgens de kweekkamer uit de incubator en plaats deze snel in de omgevingskamer van de microscoop. Zet de 5%voorgemengde koolstofdioxidetank met dubbele regelaar aan.