Name: Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer transretinale ERG-opnames van intacte muizenretina om staafjes- en kegelsfotoresponsen te isoleren. Deze elektrofysiologische methode verbetert de nauwkeurigheid van visieonderzoek aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door Career Development Award van Onderzoek om blindheid te voorkomen, NIH subsidies EY19312 en EY19543 (VJK), maar ook door onbeperkte subsidie ​​van Onderzoek om Blindheid en EY02687 (Afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences aan de Universiteit van Washington) te voorkomen.

1. Het maken van elektroden <ol><li> Bereid glas elektroden. Weeg 120 mg agar en meng dit in 10 ml gedestilleerd water (uiteindelijke concentratie van 1,2% agar). Smelt de agar oplossing in heet water bad. Vul het glas haarvaten (we gebruiken Word Presision Instrumenten TW100-4 capillairen met de volgende afmetingen: lengte = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, en de interne volume = 44 pi) met de agar oplossing met behulp van plastic spuit. Verstevigen de agar bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Zo tot ongeveer 200 capillairen worden gevuld (de rest van de agar mengsel kan worden bewaard bij 4 ° C en opnieuw gebruikt meerdere malen). </li><li> Snijd de haarvaten in twee helften met behulp van een diamant mes. </li><li> Geniet van de daaruit voortvloeiende glas elektroden in de muis elektrode oplossing ten minste 24 uur bij 4 ° C. Bewaar de elektroden bij 4 ° C en gebruik ze in de periode van 3-4 maanden. </li></ol> 2. Het experiment opzetten <ol><li> 'S nachts donker aan te passen een muis. Gebruik wild type (bijvoorbeeld C57Bl / 6) muizen voor staaf-driven transretinal opnamen en T α - / - muizen zonder hengel signalering 8 voor conus transretinal opnames. </li><li> Bereid 1 L perfusie-oplossing, 100 ml elektrode oplossing en 20 ml incubatie-oplossing (zie hieronder) en filteren de perfusie oplossing via een Millipore 0,45 pm of 0,22 micrometer filter (optioneel). </li><li> Kalibreer de lichtbron (505-nm LED of halogeen lamp optische stimulator) met behulp van een fotometer geplaatst op het vlak van het netvlies. Bij LED lichtbron gebruik van een optische diffusor licht uniformiteit. </li><li> Bereid de perfusie kamer voor experiment (kamer constructies kan variëren). De kamer wordt gemaakt van 3 mm plexiglas, met een bodem uit het deksel van een kunststof petrischaaltje en een actieve perfusie volume van 400 ul ~ (L = 25 mm, b = 8 mm, H ≈ 2 mm). Vul de onderelectrode ruimte van de kamer met elektrode oplossing die 2 mM L-glutamaat en 10 mM BaCl 2. Behulp plastic buis en een glazen capillair, een verbinding tussen de oplossing onderelectrode ruimte (van kunststof buis connector aan de kamer beneden) en de elektrodehouder. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de elektrode, het aansluiten van slangen, of de elektrode houder (zuiveren de oplossing om met plastic spuit indien nodig). </li><li> Monteer de opname kamer op het podium van de microscoop (optioneel: de microscoop kan worden gemonteerd op een anti-vibratie tafel en afgeschermd in een kooi van Faraday tegen mechanische en elektromagnetische ruis te minimaliseren). Sluit de onderelectrode houder met de positieve pool headstage van de verschilversterker (bijvoorbeeld Warner Instruments DP-311 versterker). Center en breng de kamer onderste elektrode openen met de stimulus lichte plaats. Sluit de perfusie lijn om de opname kamer en zet de doorbloeding aan. </li><li> Bubble de perfusie oplossing met 95% O 2/5% CO2 gedurende incubatie in 40 ° C watER bad. CO 2 wordt de pH van de oplossing 7,2. De oplossing stroomt uit de fles naar de opname kamer door de zwaartekracht die door een keramische weerstand opwarmen naar 36-37 ° C. Om warmteverlies te beperken, moet de verwarming worden geplaatst zo dicht mogelijk bij de opname kamer mogelijk zijn, idealiter op het podium van de microscoop. </li><li> Met een debietregelaar aan te passen het debiet tot ongeveer 1 ml / min. </li><li> Sluit de bovenste elektrode naar de tweede (negatieve) pool van de headstage met een tweede elektrode houder. Binden thermokoppelsonde de bovenste elektrode middel van een O-ring. Zorg dat de elektrode en thermokoppel uiteinden dicht bij elkaar, zodat de temperatuur wordt zo dicht bij het centrum van het netvlies mogelijk. Dompel het uiteinde van de bovenste elektrode in de perfusieoplossing en plaats in het midden van de kamer. Laat 10-15 minuten voor aanvang stabilisatie. </li><li> Stel de gelijkspanning voor de toestel, zodat de temperatuur van de oplossing 36 -37 ° C. </li></ol> 3. Het isoleren van de muis Retina <ol><li> Onder gedimd rood licht, euthanaseren het donker aangepaste muis met CO 2 en cervicale dislocatie. Optioneel: maak een merkteken op elke muis oogbol door het verbranden van de meest dorsale punt van de sclera met een cauterisatie pen of verwarmde ontleden pin. Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder infrarood licht met behulp van infrarood beeldomzetters fit aan een stereomicroscoop. </li><li> Ontleden de ogen met gebogen schaar door het toepassen van lichte druk en het uitrekken van de huid aan de zijkanten van elk oog. Hemisect beide oogbollen onder infrarood verlichting met behulp van microscissors of een scheermesje. </li><li> Verwijder het hoornvlies en de lens. Verwijder zo veel van het glasvocht mogelijk te maken. </li><li> Peel eerste netvlies van de pigmentepitheel laag en, indien nodig, grondig te reinigen met een tang om resterende pigmentkorrels epitheel verwijderen. Wij meestal met hele retina voor staaf en kegel transretrechtelijke opnamen. Echter, als u wilt specifiek op te nemen van het dorsale deel van de muis netvlies dat er meer M / L-kegeltjes 9 heeft, voor het schillen van de retina het ventrale deel van de oogschelp te verwijderen met een scheermesje of microscissors het gebruik van de cauterisatie merk als referentie. </li><li> Plaats de tweede hemisected oogbol in een klein petrischaaltje met een incubatie-oplossing en incubeer de bereiding in een lichtdichte doos verzadigd met zuivere zuurstof tot gebruik. Typisch, onder deze omstandigheden de tweede muis oogkap worden opgeslagen gedurende enkele uren bij kamertemperatuur en voor opnamen. </li><li> Een glazen of plastic pipet overdragen geïsoleerde retina een druppel perfusie oplossing (ca. 300 pi) op ​​het deksel van een petrischaal. Voeg 5-6 kleine druppels van de elektrode oplossing die BaCl 2 tot en met pre-incubeer het netvlies met BaCl 2. Plaats een vierkant stuk (ca. 5x5 mm) van de achterzijde hoek-ingevette (we gebruiken Dow Corning 111 klep smeermiddel en kit) Millipore filter papier (0,45 urn Harg type) met vooraf gemaakte gat in het midden (2-2,5 mm) tot dezelfde oplossing vallen. Met behulp van een tang positie van het netvlies op de top van het filterpapier (fotoreceptor kant naar boven) en druk de randen aan de rand van de vaste mounten. Het netvlies worden gecentreerd boven de opening in het filtreerpapier. </li><li> Met behulp van een tang overdracht van de filter papier met het netvlies aan de perfusie kamer en plaats deze boven de stimulus spot-lijn lager elektrode ruimte. Licht op de ingevette randen van het filterpapier te binden met de kamer. </li><li> Plaats de bovenste elektrode op het netvlies centrum (iets aan te raken de fotoreceptor laag). Het centreren van de bovenste elektrode op het netvlies verhoogt de signaalamplitude (tot ongeveer 20-40% in vergelijking tot het plaatsen van het dichter bij de retina rand). Hoewel een dergelijke elektrode locatie verstoort de lichtjes van de effectieve licht stimulusintensiteit het bereiken van een kleine sector van het netvlies (~ 12-15% van de totale gebied), is het nog steeds de optimale manier van het plaatsen van de elektronischevertrad. De voorbereiding is nu klaar voor transretinal opnames. </li></ol> 4. Transretinal Recordings <ol><li> Afhankelijk van uw muis lijn, record staaf of M / L-cone-driven proefflits reacties van zwak om heldere intensiteit van gekalibreerde 505 nm licht voorzien van LED-lichtbron of optische stimulator. In het geval van onze LED-lichtbron, wordt de flitsintensiteit door een combinatie van geautomatiseerde controle van de LED-ingangsspanning, schakelbare weerstanden, en een set van grijsfilters (we gebruiken E-Kleur # 211 0.9 ND film filters van Rosco Laboratories ) geplaatst tussen de LED en het netvlies. De duur van de LED-test flash (20 ms) wordt aangestuurd door een computer. Bij gebruik van een halogeenlamp optische stimulator kan proefflits intensiteit en golflengte worden bestuurd door een reeks grijsfilters smalle band interferentiefilters respectievelijk. Test flash duur kan worden gecontroleerd door computer-gestuurde rolluiken. </li><li> Optioneel: voor het behoud van een efficiënteonderdrukking van de gliale component van photoresponse met BaCl 2 de hele dag door, af en toe veranderen de onderste elektrode-oplossing (bijvoorbeeld voor het testen van elke retina) door zuivering met behulp van een plastic injectiespuit gevuld met verse oplossing. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Oplossingen <ol><li> Mouse retina perfusieoplossing: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinaat, 0,5 mM Na glutamaat, 0,02 mM EDTA, en 10 mM glucose. Bovendien wordt de oplossing aangevuld met 2 mM L-glutamaat en 10 uM DL-AP-4 hogere orde componenten van de photoresponse 10,11 blokkeren en met 0,1% MEM vitamines en MEM aminozuren oplossingen (Sigma) netvlies verbeteren levensvatbaarheid. </li><li> Mouse elektrode oplossing: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). De oplossing in het onderste elementctrode ook ruimte 2 mM L-glutamaat de synaptische transmissie 10 en blokkeren biedt bovendien, 10 mM BaCl 2 onderdrukken gliale component van de photoresponse 3,12. </li><li> Retina incubatie: los 272 mg L-15 medium (Sigma) en 20 mg BSA in 20 ml gedeioniseerd water. Final L-15 BSA concentraties 13,6 mg / ml en 1 mg / ml. Pas de pH tot 7,4 met 1 M HCl. </li></ol><img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1."> Figuur 1. Schematische weergave van de isolatie van muis netvlies van transretinal ERG opnamen. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2."> Figuur 2. Foto van de perfusie kamer en de opname elektroden met hun houders. Rode pijlen geven de richting van perfusie flow. <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3."> Figuur 3. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor transretinal ERG opnames. Rode pijlen geven de richting van perfusie flow. <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4."> . Figuur 4 vertegenwoordiger resultaten: opgenomen familie van muis staaf-driven transretinal reacties. Photoresponses waren low-pass gefilterd bij 30 Hz (8-polige Bessel), gedigitaliseerd bij 1 kHz en opgeslagen op een computer voor verdere analyse. Getoond sporen geven een gemiddelde van 5-6 reacties op weinig licht intensiteiten en 2-3 reacties op verzadigen lichtintensiteiten. <img alt="Figuur 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5."> Figuur 5 vertegenwoordiger resultaten:. Opgenomen familie van muis kegel-driven transretinal reacties. Photoresponses waren low-pass gefilterd bij 30 Hz (8-polige Bessel), gedigitaliseerd bij 1 kHz en opgeslagen op een computer voor verdere analyse. Getoond sporen zijn gemiddelde tees van 5-10 reacties op weinig licht intensiteiten en 3-5 reacties op verzadigen lichtintensiteiten.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M%2FL-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

De methode van staaf-en kegelvormige gedreven transretinal ERG opnames hierboven beschreven wordt een krachtig instrument voor het onderzoeken van de functie van de muis fotoreceptoren in zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren. Naast de gemakkelijke karakterisering van elementaire photoresponse eigenschappen deze eenvoudige techniek biedt grote respons stabiliteit tijdens langdurige experimenten uitgevoerd op nagenoeg in intacte retina preparaten. Zowel donker aangepaste hengel maximale respons amplitude en ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> TOCRIS bioscience </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Alle andere reagentia </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glas haarvaten </td><td></td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> TW100-4 </td><td> Voor het maken elektroden </td></tr><tr><td> Filtreerpapier </td><td> Harg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotometer </td><td></td><td> UDT Instrumenten </td><td> S350 </td><td> Voor lichte kalibratie </td></tr><tr><td> Radiometrische silicium sensor </td><td></td&gt; <td> UDT Instrumenten </td><td> 221 </td><td> Voor lichte kalibratie </td></tr><tr><td> Anti-triltafel </td><td></td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78 tot 239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Om de mechanische ruis te minimaliseren </td></tr><tr><td> Air compressor Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther International </td><td> P 15TC </td><td> Verbonden met anti-vibratie tafel </td></tr><tr><td> Stereomicroscoop </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Voor de muis oog dissectie </td></tr><tr><td> Infrarood beeldomzetters </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Gebonden aan stereomicroscoop </td></tr><tr><td> Verschilversterker DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel 8-polige filter </td><td></td><td> KROHN-HITE Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Keramische weerstand </td><td></td><td> TE Connectivity </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Voor opwarmen van de perfusie-oplossing </td></tr><tr><td> Thermokoppel </td><td> T </td><td> Physitemp Instrumenten </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuur-monitor </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Verbonden met thermokoppel </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Om te testen flitsen / bleken licht toe te passen </td></tr><tr><td> Cauterisatie pen </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Voor het markeren van de dorsale deelvan de muis oogbol </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Elektrofysiologie data-acquisitie en analyse software </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg opnames van mouse retina: staafjes en kegeltjes photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Er zijn twee verschillende klassen van beeldvormende fotoreceptoren in het netvlies gewervelde: staafjes en kegeltjes. Hengels zijn in staat om enkele fotonen van het licht te detecteren terwijl kegels werken voortdurend onder snel veranderende fel licht. Absorptie van licht door staaf-en kegelvormige specifieke visuele pigmenten in de buitenste segmenten van fotoreceptoren activeert een fototransductie cascade die uiteindelijk leidt tot de sluiting van de cyclische nucleotide-gated kanalen op de plasmamembraan en cel hyperpolarisatie. Dit licht-geïnduceerde verandering in membraan huidige en potentiële kunnen worden geregistreerd als een photoresponse, door een van beide klassieke zuig-elektrode opnametechniek 1,2 of door transretinal electrogram opnamen (ERG) van geïsoleerde netvlies met farmacologisch geblokkeerd postsynaptische respons componenten 3-5. Deze laatste methode maakt het mogelijk drugs-toegankelijke langdurige opnames van de muis fotoreceptoren en is vooral handig voor het verkrijgen van een stabiele photoresponses frOM de schaarse en kwetsbare muis kegels. In het geval van kegels, kunnen dergelijke experimenten worden uitgevoerd, zowel in donker aangepaste voorwaarden en volgende intense verlichting die in wezen bleekt alle visuele pigment, om het proces van kegel fotosensibiliteit herstel te volgen tijdens de donkere aanpassing 6,7. In deze video laten we zien hoe de staaf-en M / L-cone-driven transretinal opnames van donker aangepaste muis netvlies uit te voeren. Stang opnamen worden uitgevoerd met netvlies van wild type (C57BL / 6) muizen. Voor de eenvoud zal conus opnames worden verkregen uit genetisch gemodificeerde staaf transducin α-subunit knockout (Tα - / -) muizen die stang missen signalering 8.

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Er zijn twee verschillende klassen beeldvormende fotoreceptoren in het vertebratenretina: staafjes en kegeltjes. Staafjes zijn in staat om individuele fotonen van licht te detecteren ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van transretinale elektroretinogram-metingen bij een geïsoleerde, intacte muizenretina om fotoreacties gestuurd door staafjes en kegeltjes te verkrijgen. Eerst worden glazen capillairen en een perfusiekamer klaargemaakt voor de metingen. Beide oogbekers van een donkergeadapteerde muis worden gehemisecteerd.Onder infraroodverlichting worden de hoornvlieslens en het glasachtig lichaam verwijderd. Het netvlies wordt losgepeld van het pigmentepitheel en met de zijde van de fotoreceptoren naar boven op filterpapier geplaatst. Het netvlies op het filterpapier wordt overgebracht naar de perfusiekamer op de microscooptafel en geplaatst tussen twee elektroden die zijn verbonden met de headstage van een differentiaalversterker.Ten slotte worden staaf- en kegeltje-gemedieerde fotoreacties geregistreerd van het vlak gemonteerde netvlies van de muis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke enkelcelregistraties, is dat het langdurige registraties maakt mogelijk waarbij geneesmiddelen toegankelijk zijn voor staaf- en kegeltjereceptoren van wild-type en genetisch gemodificeerde muizen. Het wordt bijzonder nuttig voor het verkrijgen van stabiele responsen van de schaarse en fragiele muis.Begin met het voorbereiden van de glazen capillairen. Maak 10 milliliters van 1,2% agar in een warmwaterbad. Vul de glazen capillairen met de agarloplossing met behulp van een plastic spuit, waarna de agar snel stolt.Snijd de haarbuisjes doormidden met een diamantmes. Week de resulterende glaselektroden gedurende ten minste 24 uur in muiselektrolytoplossing bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens de microscoop in algemene zin voor om mechanische en elektromagnetische ruis te minimaliseren.Plaats de microscoop op een trillingsvrije tafel en scherm deze af met een kooi van Faraday. Deze voorzieningen zijn echter niet essentieel. Kalibreer de lichtbron met behulp van een fotometer die op het vlak van het netvlies is geplaatst.Gebruik in het geval van een LED-lichtbron een optische diffuser om lichtuniformiteit te bereiken met behulp van plastic buisjes en een glazen capillair. Maak een verbinding tussen de onderste elektrode en de elektrodehouder. Vul vervolgens de ruimte van de onderste elektrode van de perfusiekamer met elektrolytoplossing.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de elektrode, de verbindingsslangen of de elektrodehouders. Verwijder eventuele luchtbellen door de oplossing met een injectiespuit door te spoelen. Nadat de registratiekamer onder de microscoop is geplaatst, sluit u de onderste elektrodehouders aan op de positieve pool van de headstage van de differentiaalversterker.Centreer vervolgens de opening van de onderste elektrode van de kamer en lijn deze uit met de bel van de stimuluslichtvlek, de bicarbonaatgebufferde perfusie-oplossing met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide, terwijl deze wordt geïncubeerd in een waterbad van 40 °C. De pH van de oplossing zal 7,2 worden. Sluit de perfusielijn aan op de registratiekamer en schakel de perfusie in.De oplossing stroomt door zwaartekracht van de fles naar de registratiekamer. Deze passeert een keramische weerstand, waardoor de oplossing opnieuw wordt opgewarmd tot 36 of 37 °C. Om warmteverlies te beperken, dient de verwarmer zo dicht mogelijk bij de registratiekamer te worden geplaatst.Plaats bij voorkeur een stroomregelaar in het vloeistofpad op de microscooptafel en stel deze in op ongeveer one milliliter per minuut. Verbind nu de bovenste elektrode met de tweede negatieve pool van de headstage met behulp van een elektrodehouder en een O-ring; bevestig de thermokoppelprobe aan deze elektrode zodanig dat de uiteinden zo dicht mogelijk bij elkaar zitten, zodat de temperatuurmeting nabij het centrum van het netvlies plaatsvindt. Dompel vervolgens de punt van de bovenste elektrode in de perfusieoplossing en plaats deze in het centrum van de kamer.Laat de basislijn 10 tot 15 minuten stabiliseren. Stel tenslotte de DC-spanning van de verwarming zo in dat de temperatuur van de oplossing 36 tot 37 °C is. Bereid de muis voor door deze een nacht in het donker te laten adapteren.Gebruik wild-type muizen zoals C 57 black six voor staafjes-gestuurde transretinale registraties of staafjes-transducerende alfa-knockout muizen, die geen staafjes-signalering hebben, voor kegeltjes-transretinale registraties. Maak vóór het werken in het donker een stuk vierkant filterpapier klaar door in het midden een gat van 2 tot 2,5 millimeter te maken en de hoeken in te vetten. Alle volgende stappen moeten onder infrarood licht worden uitgevoerd. De dissectiemicroscoop is uitgerust met infraroodbeeldomvormers voor de halfgesneden oogballen.Verwijder beide hoornvliezen en lenzen. Verwijder tijdens deze processen zoveel mogelijk van het glasachtig lichaam. Ga verder door telkens met één oogcup te werken.De tweede oogbeker kan gedurende enkele uren bewaard worden in een schaal met incubatielosung in een lichtdichte box verzadigd met zuivere zuurstof bij kamertemperatuur om metingen te verrichten aan volledige retinae. Pel de eerste retina los van de pigmentepitheellaag en reinig deze, indien nodig, grondig met een pincet om resterende korrels van het pigmentepitheel te verwijderen. Om metingen te verrichten aan het dorsale gebied van de retina, verwijdert u het ventrale deel van de oogbeker met een scheermesje of microschaar voordat u de retina pelt.Verwijder, met referentie aan de markers van Corry, de ventrale oogbeker. Gebruik een pipet om het geïsoleerde retina over te brengen naar een druppel perfusie-oplossing op het deksel van een Petrischaal. Voeg vervolgens vijf tot zes kleine druppels elektrode-oplossing met bariumchloride toe.Plaats het voorbereide filter met het gat met behulp van een pincet in een druppel perfusie-oplossing met het netvlies. Positioneer het netvlies bovenop het filterpapier met de zijde van de fotoreceptoren naar boven. Druk vervolgens op de randen aan de periferie om het plat te monteren.Het netvlies moet gecentreerd zijn boven de opening in het filterpapier. Breng het filterpapier met het netvlies nu over naar de perfusiekamer en plaats het boven de stimulusplek, uitgelijnd met de ruimte voor de onderste elektrode. Druk de vetranden van het filterpapier lichtjes aan om het aan de kamer te hechten.Plaats ten slotte de bovenste elektrode over het centrum van het netvlies, zodat de elektrode de fotoreceptorlaag licht raakt. Ga nu verder met het experiment waarbij transretinale registraties worden gemaakt. Voor onze analyse gebruiken we de pClamp 10 data-acquisitie- en analysesoftware van Molecular Devices.We maakten gebruik van een 505 nanometers LED-licht van deze LED-bron tijdens lange opnamesessies. Om een efficiënte onderdrukking van de gliale component van de fotoreactie te behouden, wordt de oplossing van de onderste elektrode vervangen. Vóór het testen zou elk netvlies voldoende moeten zijn.De flitsintensiteit van de LED-lichtbron werd geregeld door een combinatie van computergestuurde controle van de schakelbare weerstanden van de LED-spanning en een set neutrale dichtheidsfilters die tussen de LED en het netvlies waren geplaatst. De duur van de LED-testflits, doorgaans 20 milliseconden, werd door een computer aangestuurd. Deze transretinale opnamen, gestuurd door staafjes bij C 57 black six-muizen, tonen sporen die gemiddelden vertegenwoordigen van vijf tot zes responsen bij lage lichtintensiteiten, en twee tot drie responsen bij verzadigende lichtintensiteiten.Elke trace van deze door kegeltjes gestuurde trans-retinale recoderinggegevens van de staafje-transducerende alpha-knockoutmuis vertegenwoordigt een gemiddelde van vijf tot 10 responsen bij lage lichtintensiteiten, en drie tot vijf responsen bij verzadigende lichtintensiteiten. Na het bekijken van deze video zouden we dus een goed begrip moeten hebben van hoe we elektroretinogrammetriesmetingen uitvoeren op geïsoleerde muisretina om door staafjes en kegeltjes gestuurde fotoreponses te verkrijgen.

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We zullen laten zien hoe te knipperen de reacties op te nemen van enkele muis kegels met behulp van een zuig-elektrode.

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

This video demonstrates the recording of a direct-coupled electroretinogram (DC-ERG) on a dark-adapted, anesthetized mouse retinal pigment epithelium (RPE). After applying dilating drops, the animal is placed in a recording setup, and the capillary electrode filled with a salt buffer is placed on the cornea. After establishing the baseline, DC-ERG is recorded.

Direct-Coupled Electroretinogram Recording of the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Het elektroretinogram (ERG) is een elektrisch potentiaal dat door de retina wordt gegenereerd als reactie op licht. Dit artikel beschrijft hoe de ERG kan worden gebruikt om de retinale functie te beoordelen, bij in het donker aangepaste ratten, en hoe het kan worden gebruikt om een neuroprotectieve interventie te evalueren, in dit geval afstandsischemisch preconditioning.

Met behulp van de electroretinogram om Function beoordelen in het knaagdier Retina en de beschermende effecten van Remote Limb Ischemische preconditionering

Ex vivo ERG kan worden gebruikt om elektrische activiteit van retinale cellen rechtstreeks op te nemen van geïsoleerde intacte netvliezen van dieren of mensen. We demonstreren hier hoe gebruikelijke in vivo ERG-systemen kunnen worden aangepast voor ex vivo ERG-opnamen om de elektrische activiteit van retinale cellen te ontleden.

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

Dit protocol beschrijft gelijktijdige meting van elektroretinogram en visueel geëvokte potentialen bij geanesthetiseerde ratten.

Gelijktijdig opnemen van Electroretinografie en Visual evoked potentials in verdoofde ratten

We tonen chirurgische implantatie en recording procedures visuele elektrofysiologische signalen van het oog (electroretinogram) en hersenen (visuele evoked potential) in ratten bij bewustzijn, dat meer analoog is aan de menselijke aandoening waarbij opnamen zonder verdoving uitgevoerd worden verwart meten.

Implantatie en Registratie van Wireless electroretinogram en Visual opgewekte potentiele in Conscious Rats

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

Leer transretinale ERG-opnames van intacte muizenretina om staafjes- en kegelsfotoresponsen te isoleren. Deze elektrofysiologische methode verbetert de nauwkeurigheid van visieonderzoek aanzienlijk.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Meer video's verkennen