RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans

Het doel van deze procedure is om post-embryonale regulatoren van eiwitexpressie en -lokalisatie in C elegantia te identificeren met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische screening en fluorescentie gelabelde eiwitten. Zodra de juiste screeningstam is geconstrueerd, wordt een RNAi-bibliotheek gekozen. De eerste stap van de procedure is om de bibliotheekklonen in bacteriën te verpakken.

De bacteriën worden vervolgens geselecteerd, opgevoed en gevoerd aan gestage C elegance nematoden. Na het laten groeien van de nematoden gedurende 72 uur, worden ze waargenomen op veranderingen in het fenotype van belang. Uiteindelijk worden veranderingen in de expressie of subcellulaire lokalisatie van het aangevallen eiwit gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan genen identificeren die vereist zijn voor de juiste subcellulaire lokalisatie van een fluorescentie gelabeld eiwit. Echter, dit protocol kan worden aangepast om genen te identificeren die andere post-embryonale fenotypen van belang beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande gepubliceerde protocollen is dat we de consistentie en het niveau van de RNAi-respons bij dieren hebben geoptimaliseerd door de productie van het dubbelstrengs RNA in bacteriën te induceren vóór het plateren.

Het demonstreren van de procedure zal Kathy fuss zijn, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium Binnen twee maanden na het begin van het experiment, bereidt u eerst de klonenbibliotheek voor. Streek bacteriën van geselecteerde voedingsbibliotheekklonen, evenals positieve en negatieve controles op LB carbonic tetracycline platen. Voor een positieve controle, gebruik een kloon die een gen bevat dat een dosisafhankelijk post-embryonaal fenotype produceert, zoals BLE vier. Voor een negatieve controle, gebruik een lege vector of een kloon die een voorspeld pseudogen bevat zonder waargenomen fenotypen.

Incubeer de platen overnacht voor elke kloon, inoculeer twee milliliter LB-medium bevattende 50 microgram per milliliter. Carbonzuur met een enkele kolonie van de streekplaten, incubeer de culturen overnacht met beroering de volgende ochtend. De oplossingen moeten troebel zijn. Geïnduceerde productie van dubbelstrengs RNA door IPTG toe te voegen aan de culturen en ze gedurende nog eens vier tot vijf uur onder dezelfde omstandigheden te incuberen.

Het toevoegen van IPTG zorgt voor een consistentere en robuustere RNAI-geïnduceerde knockdown van het genproduct dan alleen te vertrouwen op de IPTG en de auger van de NGM-plaat Na de IPTG-incubatie, breng 30 microliters van de cultuur van elke kloon aan in elke put van de voorbereide 24-wels NGM RNAi-platen. Eén kloon per put. Elke plaat moet twee putten hebben die zijn gewijd aan de controles.

Zorg ervoor dat de locatie van elke bibliotheekkloon in de 24-wels platen nu wordt geplaatst. Plaats de platen onbedekt in een steriele flow hood om ongeveer 20 minuten te drogen. Laat de randen van de agar niet wegzakken van de plaat.

Eenmaal gedroogd bij gestage nematoden naar de platen, worden instructies voor de bereiding van nematoden gegeven. In de volgende sectie, Begin met een gestage populatie van eerste larvale fase of L een nematoden. Het begin met L een larven voorkomt mogelijke embryonale dodelijke fenotypen.

Het hebben van een gestage populatie van dieren om te screenen, verhoogt ook iemands vertrouwen dat eventuele waargenomen variaties te wijten zijn aan de RNAi en niet simpelweg normale variaties die in verschillende stadia voorkomen. Echter, als de RNAi een ontwikkelingsvertraging veroorzaakt, moet dit worden opgemerkt door de screener. Een gemengde fase populatie van de screeningstam.

Alleen door eierschalen beschermde embryo's zullen deze stap overleven. Gestage dieren tot binnen 12 uur als uitgevoerd bij 20 graden Celsius of tot binnen 18 uur. Als uitgevoerd bij 16 graden Celsius op de dag dat de bacterieculturen worden geïnoculeerd. Selecteer drie 100 millimeter platen van gezonde screeningstamdieren die zowel gravide volwassenen als embryo's bevatten.

Was alle dieren in steriele M negen media en breng de was naar een steriele 15 milliliter buis met schroefdop. Als de was groter is dan 3,5 milliliter, draai op de dieren en verwijder alles behalve 3,5 milliliter vloeistof. Als minder dan 3,5 milliliter.

Verhoog het volume tot 3,5 milliliter met water of M negen om de embryo's van de volwassenen te bevrijden bij 1,5 milliliter van een mengsel van natriumhydroxide en bleekmiddel voor elke was. Laat de dieren niet langer dan 10 minuten in deze oplossing incuberen. Start een timer, vortex elke buis gedurende 10 seconden en herhaal het vortexen elke twee minuten.

Na elke vortexing, observeer de oplossing onder een dissectiemicroscoop op dierlijke karkassen. Binnen zes tot acht minuten zullen de volwassenen gefragmenteerd zijn en de embryo's zouden vrij moeten komen. Verwijder de embryo's uit de bleekvloeistof door ze te pellen en zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren.

Suspensieer vervolgens de pellet opnieuw in een volume van 10 milliliter door steriele M negen toe te voegen en te agiteren. Herhaal dit wasproces minstens nog een keer totdat de geur van bleekmiddel volledig onherkenbaar is. Om de dieren nauwer te stagen, arresteer ze in hun L een stadium door embryo's uit te komen in M negen medium zonder voedsel.

Dit wordt gedaan door de embryo's in M negen over te brengen naar een kleine erlenmeyer kolf. Schud de kolf overnacht bij de juiste temperatuur voor de stam en het experiment. Gedurende deze tijd zullen alle dieren uitkomen en arresteren in de L een diapause de volgende dag.

Hervat de groei van de larven vanaf een vast tijdstip door ze over te brengen naar de bereide bacteriën die dubbelstrengs RN tot expressie brengen. Dit is dezelfde dag dat de 24-wels platen zijn bespikt met bacteriën. Begin met het overbrengen van de L een dieren naar een 15 milliliter buis en ze naar beneden te draaien. Concentreer vervolgens de dieren in een halve tot een milliliter M negen en plaats vijf microliters geconcentreerde nematoden op een plaat.

Tel het aantal dieren op de