Name: RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer een RNAi-gebaseerde screeningsmethode voor postembryonale fenotypen in C. elegans met fluorescent gelabelde eiwitten. Deze techniek identificeert genen die eiwitexpressie en lokalisatie reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Rick Padgett (Waksman Instituut, Rutgers University, New Jersey) bedanken voor de gave van de DBL-1 cDNA en Dr Christopher Rongo (Waksman Instituut, Rutgers University, New Jersey) voor een injectie marker. Dr Barth Grant&#39;s lab uitgevoerd het gen pistool bombardement voor lage aantal kopieën integratie van de GFP-gelabelde dbl-1 construct. De Rene Garcia laboratorium technische bijstand verleend tijdens het maken van texIs100. De Rene Garcia, Robyn Lints en Hongmin Qin laboratoria die productief advies. Dit werk werd gefinancierd door het opstarten van middelen uit de TAMHSC Departement Moleculaire en Cellulaire Geneeskunde. De verbinding omvang en de draaiende schijf confocale werden aangekocht met geld van de afdeling en de TAMHSC College of Medicine bureau van de decaan.

1. Screening stam bouw Het zorgvuldige ontwerp van de screening stam is van cruciaal belang voor het succes van het scherm en is elders 3 beschreven. Voor sommige onderzoekers gebruikt een stam die een zichtbare product drukt een transgen nodig voor de proef. Veel stammen met geïntegreerde transgenen zijn verkrijgbaar bij de CGC of individuele onderzoekers. Als een transgene stam nodig is voor het scherm, maar niet beschikbaar is, dan kan worden opgewekt met een gepubliceerde methode zoals bombardement 4 UV / TMP 5 of Mos transposoninsertie 6. Om onze eiwit van belang zichtbaar te maken, we door het invoeren van de GFP-coderende sequentie in het frame met de volwassen cDNA-sequentie (wij gebruikten dbl-1 sequentie). Omdat dit GFP fusie-eiwit is niet zichtbaar door het ontleden van omvang, hebben we gebruik gemaakt van een co-injectie marker die zichtbaar was en had geen invloed op het bekijken van onze eiwit van belang (TTX-3p :: RFP 7). Vervolgens gemaakt geïntegreerde transgene de extrachromosomale array. Wij vonden dat bombardement van het transgen leverde een low-copy number geïntegreerde lijn die noch de stereomicroscoop fenotype gered, noch geproduceerd zichtbare niveaus van GFP-gelabelde product (Beifuss en Gumienny, niet gepubliceerd). UV / TMP integratie van meerdere kopieën extrachromosomale matrix oorspronkelijk door injectie 8,9 leverde zichtbaar redden niveau van transgenexpressie product (Figuur 3A). Western blot met anti-GFP antilichaam bevestigd dat het transgen (allel naam texIs100) wordt uitgedrukt en correct verwerkt (Beifuss en Gumienny, niet gepubliceerd). Geïntegreerde transgenen moet uitvallen of vijf keer op vreemde achtergrond mutaties te verwijderen, ongeacht de bron. Voor ons scherm, wilden we de enige eiwit van belang zijn voor de transgene, gelabeld vorm. Daarom hebben we verwijderd functionele endogene gENE door de invoering van een verlies-van-functie mutant dbl-1 allel. Ten slotte hebben we de stam gevoelig voor de effecten van RNAi. De RNAi uit de bibliotheek zal voor veel genen, produceren een meer ernstige vermindering van de gen-product als dieren bevatten een mutatie die de dieren gevoelig maakt voor de effecten van RNAi 10,11 Het weefsel (s) van de rente dient te worden overwogen bij het ​​kiezen van een geschikte RNAi sensibiliserende achtergrond 11. We gebruikten de canonieke RRF-3 (pk1426) allel aan onze screening stam te maken. SRF-3 is een RNA gestuurde RNA polymerase (RdRP) homoloog die normaal remt somatische RNAi 10. Mutaties in andere RNAi hypersensitizing genen zoals eri-1 of eri-1 lin-15b kan worden vervangen om de effectiviteit van de RNAi 11-13 verhogen. De screening stam hebben we over het genotype RRF-3 (pk1426); texIs100, dbl-1 (NK3). 2. Het kiezen en voorbereiden van eenRNAi-bibliotheek Commercieel beschikbare C. elegans cDNA bibliotheken voor ongeveer 55% of 87% van de theoretische genen C. elegans individueel (Vidal lab of Ahringer lab bibliotheken, respectievelijk). Individuele klonen zijn beschikbaar voor aankoop (Open Biosystems, Geneservice, Ltd). We kozen ORF-RNAi bibliotheek geconstrueerd door het Vidal lab (Open Biosystems) omdat de klonen meestal volledige lengte cDNA Gateway gekloneerd en klaar voor stroomafwaartse toepassingen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). De oorspronkelijke Ahringer lab genomische cDNA-bibliotheek bevat cDNA fragmenten die niet zo breed nuttig voor downstream karakterisering experimenten 14,15. Beide bibliotheken gebruik maken van een vector die twee T7 promoters aan weerszijden van de insert (figuur 1) bevat. De constructen worden gekweekt in bacteriestam HT115 die T7 polymerase uitdrukking na inductie door isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Bacteriën die bibliotheek klonen geïnduceerd met IPTG aanproduceren dsRNA (zie stap 3.4). Dupliceer de hele bibliotheek bij ontvangst en gebruik het dubbele voor alle experimenten. Het origineel en dubbele bibliotheken worden opgeslagen in verschillende -80 ° C diepvriezers die zijn verbonden met elektrische leidingen scheiden. 3. Voorbereiding van de bacteriën met bibliotheek klonen <ol><li> (Binnen twee maanden na het experiment) Streak bacteriën van geselecteerde voeding bibliotheek klonen, maar ook positieve en negatieve controles, op het label LB-carbenicilline / tetracycline platen (we groeien 8 culturen per 100 mm plaat) en bij 37 ° C gedurende de nacht (uitbroeden &gt; 16 uur) (figuur 1). Voor elke 24-wells plaat, gebruiken we twee controles. De positieve controle, bli-4 (K04F10.4), produceert een dosis-afhankelijke post-embryonale pheontype 16,17. De negatieve controle, C06C3.5, is een voorspelde pseudogen ( <a href="http://WormBase.org">WormBase.org</a> ) dat er geen waargenomen fenotypes (Beifuss en Gumienny, niet gepubliceerd) veroorzaakt. </li> (Binnen twee maanden van het experiment, bij voorkeur eerder) Bereid 24-well Nematode groeimedium (NGM) platen met 25 tot 50 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG. Bewaar bij 4 ° C. <li> (Dag 1) Voor elke kloon, inoculeren 2 ml LB medium dat 50 ug / ml carbenicilline met een kolonie van de strepen plaat (s) (in stap 3.1) met behulp van standaard steriele techniek. Incuberen bij 37 ° C geroerd (&gt; 16 uur) in een schudinrichting ingesteld op 220 tot 240 rpm (figuur 1). De oplossing dient helder te zijn na 16 uur. </li><li> (Dag 2) De volgende morgen induceren dubbelstrengs RNA (dsRNA) productie door toevoeging IPTG aan de cultuur tot een eindconcentratie van 1 mM. Incubeer culturen bij 37 ° C, 220 - 240 tpm gedurende 4 - 5 uur. Deze stap zorgt voor een meer consistente en robuuste RNAi geïnduceerde knockdown van genproduct dan alleen te vertrouwen op de IPTG in de agar van de NGM plaat (in stap 3.5). </li><li> Spot 30 ul van elk geïnduceerde bacteriële culture in afzonderlijke putjes van een 24-putjes NGM RNAi plaat met 25 tot 50 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG (Figuur 1, zie figuur 4 voor de sjabloon gebruikt voor de RNAi experimenten te volgen). Zet platen, ontdekt, in een steriele stroom kap voor 20 minuten of tot het bacteriële plekken droog zijn. Doe niet Kreukherstellend. Uitdrogen veroorzaakt de randen van de agar weg te trekken van de plaat en dieren onherstelbare indien zij kruip in de resulterende spleten. </li></ol> 4. Voorbereiding van nematoden Begin met een gefaseerde bevolking van nematoden. Staging dieren vermindert de kans dat de verschillen waargenomen tussen de controle en de experimentele RNAi proeven gewoon zijn te wijten aan verschillen in de ontwikkelingsfase van de dieren (maar als het RNAi veroorzaakt een vertraging in de ontwikkeling, dit dient te worden opgemerkt door de screener (Figuur 2)) . Verder is het starten van de RNAi experiment met L1 larven ondervangt mogelijke verstorende effecten van embryonale letaliteit door RNAi van Genes dat speelt mogelijk ook postembryonic rollen van belang. Classificatie is door eerst bleken een gemengde fase van de populatie screening stam, die op schalen beschermd embryo overleven. Deze fasen dieren binnen ongeveer 12 uren bij 20 ° C of ongeveer 18 uur bij 16 ° C 18. Om meer te strak podiumbeesten, arrestatie dieren in het eerste larvale stadium (L1) door te laten embryo luik in M9 medium zonder voedsel. Starved L1 dieren die op voedsel CV groei van dezelfde beginleeftijd 19. <ol><li> (Dag 1) Gebruik drie 100 mm platen gevoed, schone screening stam dieren die zwangere volwassenen en embryo's bevatten. Was de dieren uit platen met behulp van steriele M9 door het pipetteren vloeistof over de plaat oppervlak voorzichtig aan dieren en embryo's los te maken. Breng de was in een steriele 15 ml buis met schroefdop. </li><li> Als de was groter is dan 3,5 ml, spin down van de dieren (~ 3000 rpm gedurende 30 seconden) en vloeibare tot 3,5 ml. Indien de wasinstallatie is less dan 3,5 ml, voeg H 2 0 of M9 op de buis tot 3,5 ml bedragen. </li><li> Draag geschikte beschermende kleding (laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril) bij het werken met chemicaliën. Meng 0,5 ml 5 N NaOH met 1 ml verse bleekwater (5% natriumhypochloriet, minder dan 1 jaar oud). Voeg dit mengsel bij de 3,5 ml nematode wassen. Start een timer te tellen. Dit proces mag niet meer dan 10 minuten. Als dat zo is, dan is embryo's in gevaar komt en de opbrengst kan worden verminderd, of het bleekmiddel is oud en moet worden vervangen. </li><li> Vortex de buis gedurende ongeveer 10 seconden. Herhaal de vortexen om de twee minuten voor 4 tot 10 minuten. Na elke vortexen, leven zij de oplossing onder een dissectie ruimte voor kadavers. </li><li> Wanneer embryo vrijkomen en volwassenen versnipperd (6-8 minuten) pellet de embryo's draaien van de buis in een tafelblad centrifuge (~ 3000 rpm, 30 seconden). </li><li> Zuig zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk zonder de pellet. Wees voorzichtig, nietgulzig. </li><li> Voeg steriele M9 tot ~ 10 ml. Vortex kort of goed schudden om het pellet opnieuw in suspensie. </li><li> Spin en weer te verwijderen supernatant. Indien de geur van bleekmiddel kan worden gedetecteerd in de buis, opnieuw spoelen indien nodig. </li><li> Resuspendeer embryo's in 10 - 15 ml steriel M9 en transfer naar een kleine (25 ml) erlenmeyer (voor beluchting). Schudden op de juiste temperatuur voor de stam en experiment (15 - 25 ° C) gedurende een nacht (&gt; 16 uur bij 20 ° C). In deze tijd, zullen de dieren allemaal uitkomen en arrestatie in de L1 diapauze. </li><li> (Dag 2) spin down L1 stadium dieren in een 15 ml buis en resuspendeer in 0,5 - 1 ml M9 (~ 3000 rpm, 30 sec.). Plaats 5 pi oplossing op een apart bord en tel het aantal dieren. Pas de volume zo nodig 30 wormen / opbrengst 3 - 10 pi oplossing. </li><li> Spot ongeveer 30 hypochloriet gesynchroniseerd L1 fase dieren op de bacteriën in elke well van de bereide 24-wells plaat. Te veel moopnieuw dan 30 dieren per goed kan leiden tot de bevolking honger vóór het bereiken van de vervaldag. Laat de plaat droog met de deksels scheef. Plaats het deksel en zet deze vast met een elastiekje. Keer de plaat en plaats deze op de juiste temperatuur voor de tijd die nodig is om te scoren op het gewenste moment. Omdat de RRF-3 (pk1426) is een temperatuurgevoelig allel, werden onze screening stam dieren gegroeid bij 15 - 17 ° C gedurende drie tot vier dagen te observeren L4 naar volwassen stadium dieren (figuur 1). </li></ol> 5. Observatie van nematoden (Dag 5) Nadat de nematoden zijn uitgegroeid tot de gewenste stadium (figuur 2A), bevestigen dat de positieve en negatieve controles de verwachte fenotypes te produceren met behulp van een stereomicroscoop. We gebruiken bli-4 als controle voor RNAi werkzaamheid, omdat dosis-afhankelijke postembryonale gebreken die variëren van blaren volwassenen (mild RNAi fenotype niet weergegeven) ontwikkelingsgewijs aangehouden, kleine larven (sterk eERWACHTE RNAi fenotype) (Figuur 2B). Vervolgens nemen de dieren in elke experimentele en met een stereomicroscoop en merk duidelijk afwijkende fenotypen geïnduceerd door RNAi (Figuur 2C). Na de controles worden bevestigd en bruto fenotypes vermeld, onderzoekt de RNAi experimenten voor fenotypen van belang. We gebruiken een samengestelde microscoop uitgerust met fluorescentie en een 63x doelstelling om ten minste vijf dieren uit elke RNAi experiment te observeren, te beginnen met controles (figuur 3). <ol><li> Bereid een glijbaan (standaard 75 x 25 mm) door middel van een 4% agar pad (4% agar in H2O). Om een ​​uniforme dikte van agar pad te garanderen, plaatst u een schoon glasplaatje tussen twee afstandhouders (elk spacer is gemaakt van een microscoop dia met twee lagen van lab tape erop). Pipetteer ongeveer 100 ul (twee tot drie druppels van een glazen Pasteur pipet) gesmolten 4% agar op het midden van de schone glaasje. Vormen een agar pad door het bedekken van gesmolten agar met een extra dia snel maar voorzichtig bovenop de spacers eennd het gesmolten agar. Expose de agar pad door voorzichtig te schuiven de glazen dia's uit elkaar, waardoor het pad vast te houden aan een dia. </li><li> Plaats een ~ 5 ul druppel verdoving (levamisol of natriumazide, bijvoorbeeld) op de agar pad. Mount 8 tot 12 dieren in de narcose. Dek af met een 22 x 22 mm # 1,5 dekglaasje (of de dikte van dekglaasje het meest geschikt voor de samengestelde microscoop) en observeer dieren met behulp van een samengestelde microscoop. </li><li> Record gen aantal waargenomen dieren en fenotype resultaten per RNAi experiment. Voor een scherm, maken en gebruiken van een standaard template (zie bijvoorbeeld figuur 5). </li><li> Controleer de RNAi geproduceerd fenotype door andere secundaire fenotype, indien mogelijk, en herhalen van het experiment. (Bijvoorbeeld, het getoonde voorbeeld scherm dat wordt gebruikt wijziging van GFP-gelabelde DBL-1 lokalisatie als primair scherm en het lichaam zo groot als een tweede scherm 20.) Bacteriën kunnen worden gebruikt uit dezelfde streep (opgeslagen bij 4 ° C) gedurende maximaal twee maanden. Oudere strepen kan resultaat in slechte groei in vloeibare 's nachts culturen en moet eerst worden restreaked. </li><li> Sequentie die tenminste een uiteinde van de cDNA-insertie te bevestigen dat het inzetstuk de bibliotheek label (de Ahringer bibliotheek heeft een uitgevoerd betrouwbaarheidsanalyse, zie overeenkomt <a href="http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/">http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/</a> ) 21. Aanbevolen primers (voor inserts uit een bibliotheek) hybridiseren aan plaatsen in de L4440-afgeleide vector en flank de inbrengplaats: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'en 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 primer). </li></ol> Met deze methode kan een persoon redelijk te organiseren en te observeren twee tot vier sets van experimenten elke week. Bijvoorbeeld, dieren opgevoerd op maandag en dinsdag kunnen worden waargenomen donderdag en vrijdag, respectievelijk, en kan weer worden opgevoerd op vrijdag en zaterdag voor de maandag en dinsdag observatie. Afhankelijk van de fenotype (s) gescreend per dag een aantal kan een 24-wells plaat omvatten door verbinding microscopie of meer als fenotype snel geïdentificeerd. Zo kan tenminste 88 verschillende RNAi experimenten worden waargenomen in een week, rekening houdend positieve en negatieve controles en snelheid van screening. Een ontleden omvang scherm kan veel sneller worden uitgevoerd, zonder de noodzaak voor het monteren van dieren op dia's te bekijken. Meerdere mensen kunnen een lab van de doorvoer ook verhogen door duizelingwekkende schema's en / of het gebruik van meerdere microscopen. Een alternatieve methode voor het kweken dieren op een dunne film van agar en verplaatsen van een deel van de agar bevat dieren direct naar een dia weergave kan tijdwinst. Deze variatie werd met succes gebruikt voor het screenen van mannen staart afwijkingen bij 400x vergroting 22. 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van normale en veranderde lokalisatie van GFP-gelabeld DBL-1 in figuur 3. De normale expressie van GFP-gelabelde DBL-1 bevat ventrale zenuw koord cellichamen en een rij punctae (Figuur 3A). DBL-1 is sterk gedempt wanneer dieren gevoed RNA dat dbl-1 mRNA translation voorkomt (Figuur 3B). dbl-1 (RNAi) produceert ook kleine dieren, de secundaire screen in dit voorbeeld (gegevens niet getoond). Genen die DBL-1 lokalisatie van invloed zijn worden gemakkelijk geïdentificeerd door RNAi met behulp van een stam ontworpen voor dit scherm (Figuur 3C). <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Scherm regeling met de extracellulaire regulatoren van DBL-1-signalering te identificeren. Bacteriën uit de voeding bibliotheek overnacht gegroeid, geïnduceerd met IPTG, en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 4 uur om de bacteriën dubbelstrengs RNA (dsRNA) produceren. 30 pl van de geïnduceerde bacteriecultuur wordt per putje gespot op 24-well NGM (nematode groeimedium) plaat met 25 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG en drogen in een steriele stroming kap. We fase treden de eerse larvale stadium (L1) larven door te laten hypochloriet behandelde embrJo's uitkomen in de media zonder voedsel, die een L1 diapauze (Arrested Development) induceert. Ongeveer 30 gesynchroniseerde L1 stadium dieren worden uitgeplaat op elk putje met de bacteriën uit de RNAi-bibliotheek, die het mogelijk maakt geënsceneerde dieren om de groei te hervatten en de dsRNA gemaakt door de bacteriën 23 consumeren. Na 72 uur bij 15 ° C, de jonge volwassenen wormen worden gescreend voor een zichtbaar fenotype. Op deze leeftijd, lichaamsgrootte gebreken zijn duidelijk en fluorescentie is licht van texIs100 transgenexpressie. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeelden van fenotypes te identificeren voor de screening. Alle afbeeldingen van dieren in een plaat goed werden genomen bij dezelfde vergroting met behulp van een stereomicroscoop. De dieren werden al afgebeeld ongeveer 72 uur na plating als uitgehongerde L1 larven. Alle beelden werden op dezelfde manier behandeld. A) RNAi van een gen dat geen bruto morfologische defecten geeft. Dieren lijken wild-type. B) RNAi van bli-4. Dieren weer te geven gearresteerd ontwikkeling, en zijn kleine in vergelijking met de dieren in het paneel A. C) RNAi van dpy-13. Dieren zijn in hetzelfde stadium van ontwikkeling als dieren in panel A, maar geeft een "Dumpy" body morfologie. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voorbeelden van fluorescent gelabelde eiwitten en hoe RNAi van specifieke genen verandert lokalisatie patroon. Alle foto's werden genomen op 630x vergroting met draaiende schijf confocale microscopie, 5 sec. blootstelling. Schaal bar = 10 micrometer. Alle beelden werden op dezelfde manier behandeld. Open pijlpunten geven cellichamen. Pijlen markeren lijn van punctae. Gevuld pijlpunten geven aan een aantal afwijkend gelokaliseerde GFP-gelabelde DBL-1. A) RNAi gevoed pseudogen C06C3.5 ("wild-type"). B) dbl-1 (RNAi) controle. C) RNAi van een gen nodig normale lokalisatie van GFP-gelabeld DBL-1. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Template voorbeeld voor het bijhouden van RNAi experimenten (bibliotheek klonen) in 24-well platen. Deze sjabloon kan worden gebruikt om een ​​permanente registratie van de experimenten, in tegenstelling tot direct labelen platen maken. <img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Template bijvoorbeeld voor het opnemen RNAi fenotypen. Uit te breiden als dat nodig is.

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bli-4+%28I%29+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li>
<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De RNAi screening methode hier gepresenteerde zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van gen-producten die nodig zijn voor een normale (of transgene) postembryonic fenotype. Het voorbeeld is een scherm voor genen die betrokken zijn bij de subcellulaire lokalisatie van een fluorescent gelabeld eiwit. Toch kan dit protocol worden aangepast om genen die van invloed andere postembryonic fenotypen van belang vast te stellen. Deze methode maakt gebruik van een kandidaat-gen benadering met behu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> NGM Agar </td><td> Nematode groeimedium </td><td> IPM Scientific, Inc </td><td> Kan bereid worden met NGM agar-protocol 25 </td></tr><tr><td> M9 Medium </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSÜ4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> Merck Chemicals Inc </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% in water NGM platen. 4% in water voor microscoopglaasje pads (autoclaaf in eerste instantie en magnetron daarna te smelten). </td></tr><tr><td> Bacto pepton </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0,25% </td&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Research Products International Corp </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 mM eindconcentratie </td></tr><tr><td> carbenicilline </td><td> Research Products International Corp </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 ug / ml werkverdunning </td></tr><tr><td> LB-bouillon Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 g / liter </td></tr><tr><td> tetracycline </td><td> Sigma </td><td> 268054 </td><td> 12,5 ug / ml werkverdunning </td></tr><tr><td> natriumhypochloriet </td><td> Elk merk </td><td> 5% bleekwater </td><td> Gebruik verse bleekmiddel. </td></tr><tr><td> natriumhydroxide </td><td> Elk merk </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N voorraad </td></tr><tr><td> M9 medium </td><td> Wormlab Receptenboek </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31742 </td><td> 100 uM - 1 mM werkverdunning </td></tr><tr><td> natriumazide </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 mM in M9 werkverdunning </td></tr><tr><td> 24-wells plaat </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR verdeler </td></tr><tr><td> objectglaasjes </td><td> Elk merk </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> microscoop dekglaasjes </td><td> Elk merk </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Gebruik de dikte aanbevolen door de fabrikant microscoop. </td></tr><tr><td> samengestelde microscoop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1M </td><td> Gebruik doelstellingen en filters om de behoeften van het experiment te passen. </td></tr><tr><td> media-pomp</td><td> Manostaat Varistaltic pomp </td><td> Kate model # 72-620-000 </td><td> Gebruik slangen en de juiste instellingen voor de machine </td></tr></tbody></table>

rnai screening postembryonic fenotypes leg in c. elegans</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans heeft zich bewezen als een waardevol model voor de ontdekking en functionele karakterisering van vele genen en pathways 1. Meer geavanceerde tools en middelen voor studies in dit systeem zijn het vergemakkelijken van voortdurende ontdekking van de genen met meer subtiele fenotypes of rollen. Hier presenteren we een algemeen protocol waarin we aangepast voor het identificeren van C. elegans genen met postembryonic fenotypen van belang met behulp van RNAi 2. Deze procedure is eenvoudig aan te passen voor het testen van het fenotype van de keuze, hetzij door licht of fluorescentie optica op een dissectie of samengestelde microscoop. Deze screening protocol speelt in op de fysieke activa van het organisme en moleculaire technieken de C. elegans onderzoeksgemeenschap heeft geproduceerd. Als voorbeeld tonen we het gebruik van een geïntegreerde transgen een fluorescerend product uit in een RNAi scherm genen die voor normaal lokalisatie van deze identificatieproduct in een vergevorderd stadium larven en volwassenen. Eerst gebruikten we een commercieel verkrijgbare genomische bibliotheek met RNAi volle lengte cDNA-inserts. Deze bibliotheek vergemakkelijkt de snelle identificatie van meerdere kandidaten door RNAi vermindering van de kandidaat-genproduct. Ten tweede hebben we gegenereerd een geïntegreerde transgen dat onze fluorecently gelabeld eiwit van interesse uit in een RNAi-gevoelige achtergrond. Derde, door belichting gearceerde dieren RNAi, dit scherm kunnen herkennen genproducten die een belangrijke rol embryonale die anders zou maskeren postembryonale rol in het reguleren het eiwit van belang zijn. Tot slot, dit scherm maakt gebruik van een samengestelde microscoop uitgerust voor enkele cel resolutie.

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie identificeren<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische scherm en een geïntegreerde transgen dat een functionele, fluorescent gelabeld eiwit tot expressie brengt.

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans is een waardevol modelsysteem gebleken voor de ontdekking en functionele karakterisering van vele genen en genpaden1. Geavanceerdere ...

Het doel van deze procedure is om post-embryonale regulatoren van eiwitexpressie en lokalisatie in C. elegans te identificeren met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische screening en fluorescentie-gelabelde eiwitten. Zodra de geschikte screeningsstam is geconstrueerd, wordt een RNAi-bibliotheek gekozen. De eerste stap van de procedure is het verpakken van de bibliotheekklonen in bacteriën.De bacteriën worden vervolgens geselecteerd, opgekweekt en gevoerd aan C. elegans-nematoden in diverse stadia. Nadat de nematoden 72 uur lang zijn doorgegroeid, worden ze geobserveerd op veranderingen in het fenotype van belang. Tot slot worden veranderingen in de expressie of subcellulaire lokalisatie van het getargete eiwit gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie.Deze methode kan genen identificeren die vereist zijn voor de juiste subcellulaire lokalisatie van een fluorescent gelabeld eiwit. Echter kan dit protocol worden aangepast om genen te identificeren die andere post-embryonale fenotypes van belang beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande gepubliceerde protocollen is dat wij de consistentie en het niveau van de RNAi-respons in dieren hebbe

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neurexins en neuroligins zijn membraan-neuron hechting eiwitten die een essentiële rol in synaptische differentiatie en transmissie uit te voeren. Neuroligin gebrekkige mutanten...

Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype...

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.

Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans

Dit protocol biedt een eenvoudige, goedkope procedure om het tempo van embryonale dodelijkheid bij Caenorhabditis elegans te kwantificeren. Het maakt eenvoudige detectie van embryonale afwijkingen in populaties mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur of wormplukexpertise. Het protocol kan worden gebruikt om de effecten van genetische mutaties, RNA-interferentie-gemedieerde gen-knockdowns en dieet te kwantificeren.

Kwantificatie van embryonale dodelijkheidsgraad bij Caenorhabditis elegans

Leer een RNAi-gebaseerde screeningsmethode voor postembryonale fenotypen in C. elegans met fluorescent gelabelde eiwitten. Deze techniek identificeert genen die eiwitexpressie en lokalisatie reguleren.

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans

Meer video's verkennen