Name: Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer kwantitatieve RNAi-screening in C. elegans voor genoomwijde genfunctieanalyse met geautomatiseerde fenotypische metingen. Deze methode identificeert genen betrokken bij antifungale aangeboren immuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken D. Braendle, CL Kurz en F. Montañana-Sanchis voor hun bijdragen. Dit project werd ondersteund door subsidies van de ANR en de Conseil Regional PACA en institutionele financiering van INSERM en het CNRS.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

De Ewbank lab werkt samen met Unie Biometrica en Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; De huidige protocol maakt op grote schaal RNAi screening in<em&gt; C. elegans</em&gt; Op vast medium, met het niveau van expressie van een reportergen fluorescerende als uitlezing. Het is geoptimaliseerd met geautomatiseerde tools om high-throughput testen te vergemakkelijken, zodat u gemakkelijk en snel behandelen van grote aantallen monsters, op een efficiënte, betrouwbare en reproduceerbare wijze. Andere methoden zijn beschreven die niet zo sterk afhankelijk geautomatiseerde vloeistofmonster handling<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een belangrijk organisatorisch aspect van het protocol is de ontwikkeling van een robuuste methode van het monster volgen door aanpassing van de commerciële MBioLIMS software om de RNAi-scherm procedure in samenwerking met het bedrijf ModulBio. In elk stadium van de procedure, worden de platen nu door de barcodes worden gegenereerd binnen het LIMS. Als LIMS ook registreert de identiteit van de klonen in elk putje op elke plaat, gaande van en naar vermeende gen eenvoudig. En dan dit, het LIMS links naar de community-database WormBase, die rechtstreeks toegang geeft tot de moleculaire en functionele gegevens over een bepaald gen. Het LIMS vergemakkelijkt ook analyses uit te voeren op de plaat of zelfs chromosoom en hele genoom-niveau. Voor deze analyse worden de gegevens opgeslagen op een wijze die volledig met eerder beschreven hulpmiddelen zoals COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een kritisch experimenteel punt in de werkwijze is de aanpassing van de hoeveelheid voedsel ten opzichte van het aantal wormen. Voor veel assays, is het essentieel dat wormen niet sterven na afloop van het experiment, maar het is ook belangrijk niet te veel voedsel bij de start. Wij hebben opgemerkt dat een hoge dichtheid van voedsel fluorescentie inductie neemt het protocol met wormen die de p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: GFP reporter. Dit kan wijzen op een verminderde infectie-efficiëntie als wormen worden gekweekt in te veel bacteriën (BS, niet gepubliceerde resultaten). Tegelijkertijd is de kweekomstandigheden van RNAi bacteriën is ook belangrijk omdat deze bepaald of dsRNA geproduceerd op een optimaal niveau. Sommige protocollen voor grootschalige RNAi vereisen cultuur van RNAi klonen op agarplaten voorafgaand aan het zaaien vloeibare culturen<sup&gt; 8</sup&gt;. We kregen robuuste gene silencing het weglaten van deze stap. We hebben gekozen voor het kweken van een overmaat aan elke cultuur homogene resultaten te garanderen. Het protocol beschreven in feite voldoende materiaal 2 of 3 schermen voeren parallel. In het belang van het verkrijgen van de meest robuuste resultaten geven we de voorkeur, echter, het uitvoeren van schermen in twee exemplaren, met behulp van onafhankelijke culturen van wormen, RNAi bacteriën en schimmelsporen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een andere belangrijke stap is gerelateerd aan het gebruik van medium dat is niet te vochtig of te droog. Als de platen niet droog genoeg is, wordt de RNAi bacteriën niet goed drogen en wormen zal zwemmen tijdens de test. Dit kan problemen veroorzaken. Bijvoorbeeld, wormen niet efficiënt besmet<em&gt; D. coniospora</em&gt; In vloeistof (C. Couillault, niet gepubliceerde resultaten). Aan de andere kant, in droge platen, de osmolariteit van het kweekmedium toe. Dit heeft directe gevolgen voor de worm fysiologie<sup&gt; 17</sup&gt;, Inclusief de inductie van enkele antimicrobiële peptide genen, zoals<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Het volume gebruikt om wormen en sporen afzien is cruciaal voor effectieve en snelle droging mogelijk te maken. Als meer dan 10 pi vloeistof wordt toegevoegd aan verse platen kunnen de putten vele uur drogen. Dit kan betekenen dat het moeilijk is robot methoden wormen aan de platen. Zo wordt elke worm afgegeven door de Biosort bij 1 ul vloeistof. Op dit moment handmatig verspreiden de wormen als die ook ons ​​in staat stelt om het overwinnen van de neiging van wormen in oplossing voor sediment.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; We hebben eerder gemeld een aanpassing van de Biosort toe waardoor een 96-well plaat worden geanalyseerd in 36 minuten<sup&gt; 19</sup&gt;. De machine fabrikant UBI biedt nu een wijziging van de Biosort verder verlagen analysetijd. Met de &quot;FastReFlex&quot;, worden monsters direct gerouteerd via de stroom cel voor de analyse, het omzeilen van de bubble-trap filter. Dit resulteert in een aanzienlijke vermindering van de tijd voor dataverwerving, geheel plaat worden geanalyseerd in 22 min waarbij ongeveer 20 platen te behandelen per dag. Als platen werden bevroren, echter, zou er een 8 uur interval tussen de eerste en laatste. Gezien de relatief korte duur van het experiment, waarbij de infectie duurt slechts 18 uur, zou dit een onaanvaardbare variabele te introduceren in platen. Niet alleen vriesplaten voorafgaand aan de analyse op te lossen dit probleem, maar het is ook essentieel in het kader van high-throughput analyses, met het huidige protocol en de standaard vloeistof-handling robots, 2 mensen gemakkelijk kunnen verwerken tot 50 platen per week. Momenteel zijn we regelmatig het scherm 30 platen per week, die het mogelijk maakt een hele genoom-schermeen keer uitgevoerd minder dan 2 maanden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Een interessante eigenschap van dit protocol is dat het vaste agar gebruikt, waardoor assays die niet kunnen worden uitgevoerd in vloeibare kweek. Als worm fysiologie verschilt afhankelijk van de kweekomstandigheden<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Het kunnen uitvoeren van testen op een vast medium kan ook gebruikelijk op vloeistof gebaseerde schermen aan te vullen. Voor bepaalde fenotypen (bijv. beweging), kan de analyse uitgevoerd worden rechtstreeks met de 96-well vast medium platen. Voor het huidige scherm, echter, als de Biosort niet kunnen genieten van een vast medium platen, zijn wormen eerst overgebracht naar vloeibare voor het invriezen. Aan de andere kant COPAS Biosort maakt een Multiparametrische kwantitatieve analyse verenigbaar met de meting van verschillende fenotypen. Het is aannemelijk dat elk scherm niet alle gemeten parameters zullen de primaire uitlezing. Toch kunnen deze metingen nuttig zijn om verschillende redenen. Ze laten ons toe om te bepalen of de test goed liep. Zo kan een controle van het aantal en de grootte van wormen in elk putje. Alleen wanneer een RNAi kloon zou de groei of reproductie te blokkeren moet er een afwijking van de verwachte waarden. Wells met minder dan 20 wormen en / of dieren 30% kleiner (TOF) vergeleken met een standaard controle zonder effect op de groei (<em&gt; Bijvoorbeeld GFP (RNAi</em&gt;)) Worden uitgesloten volgende analyses. De functie van deze klonen kunnen worden aangepakt met behulp van een alternatief protocol, waarin wormen worden blootgesteld aan de RNAi bacteriën na hun ontwikkeling is in een vergevorderd stadium<sup&gt; 15</sup&gt;. De verschillende parameters kunnen ook worden gebruikt voor kandidaat-gen (hit) selectie, verfijnen bijvoorbeeld beperken resultaten alleen die groene fluorescentie maar niet rood beïnvloeden. De exacte methode voor de selectie resultaten zal afhangen van de aard van het scherm en de exacte uitlezing. Gezien de complexiteit van de gegevens die zijn gegenereerd uit een kwantitatieve genoom-breed scherm, kan samenwerking met een statisticus nodig zijn.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Het protocol wordt beschreven kan gemakkelijk worden aangepast aan andere testen. Bijvoorbeeld, bij de infectie stap<em&gt; D. coniospora</em&gt; Kunnen worden vervangen door een ander pathogeen kunnen infecteren vaste media. Dit is mogelijk bruikbaar hebben wij gevonden dat veel van de virulentiefactoren belangrijk Serratia marcescens infectie in vloeibare kweek geen rol spelen tijdens de infectie op vast medium (E. Pradel, persoonlijke communicatie). Het protocol is ook volledig compatibel met het testen van chemische stoffen<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Of identificeren verbindingen met bioactiviteit met verschillende bibliotheken van bacteriën<sup&gt; 25</sup&gt;, Dienen dus zoek een algemene nut in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Onderzoeksgemeenschap.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal zelfklevende film </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSÜ4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 diepe put plaat </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 goed vlakke plaat </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 well ronde plaat </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecan robot </td><td> Tecan </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Unie Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde rnai schermen in c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA-interferentie is een krachtige methode om genfunctie begrijpen, vooral wanneer uitgevoerd bij een hele genoom schaal en in een kwantitatieve context. In C. elegans kan genfunctie worden neergeslagen eenvoudig en efficiënt door toevoer wormen bacteriën expressie van een dsRNA overeenkomt met een specifiek gen 1. Hoewel het oprichten van bibliotheken van RNAi-klonen die het grootste deel van de C. elegans genoom 2,3 opende de weg voor echte functionele genomische studies (zie bijvoorbeeld 4-7), de meeste gevestigde methoden zijn omslachtig. Moy en collega&#39;s hebben ontwikkeld, semi-automatische protocollen waarmee de toegang genoom-brede schermen 8. De aanpak is gebaseerd op microscopische beeldvorming en beeldanalyse. Beschrijven we een alternatieve protocol voor een hoge-doorvoer screen genoom, gebaseerd op robot behandeling van bacteriële RNAi klonen kwantitatieve analyse met COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) en eengeïntegreerde software: de MBioLIMS (Laboratory Information Management System van Modul-Bio) een technologie die een verhoogde doorvoersnelheid voor gegevensbeheer en monster tracking biedt. De methode maakt het mogelijk schermen te voeren op een vast medium platen. Dit is bijzonder belangrijk voor een aantal studies, zoals adressering gastheer-pathogeen interacties C. elegans, aangezien bepaalde microben niet efficiënt infecteren wormen in vloeibare cultuur. We tonen hoe de werkwijze kan worden gebruikt om het belang van genen kwantificeren schimmelwerende aangeboren immuunsysteem in C. elegans. In dit geval benadering berust op het gebruik van een transgene stam die een epidermale infectie induceerbare fluorescerende reportergen met GFP onder controle van de promotor van het antimicrobiële peptide gen nlp 29 en een rood fluorescent reporter die constitutief wordt uitgedrukt in de epidermis. Deze laatste bevat een interne controle voor de functionele toestand van de huiden niet-specifieke transgene zwijgen 9. Bij de besturing wormen zijn geïnfecteerd door de schimmel ze fluoresceren groen. Kloppen de door RNAi een gen die nodig zijn voor NLP 29 expressie resulteert in verminderde fluorescentie na infectie. Op dit moment wordt in dit protocol maakt het mogelijk meer dan 3.000 RNAi klonen worden getest en geanalyseerd per week, het openen van de mogelijkheid van een screening van het volledige genoom in minder dan 2 maanden.

We beschrijven een protocol met behulp van<em&gt; C. elegans</em&gt; En RNAi voeding bibliotheken die geautomatiseerde meting van meerdere parameters zoals fluorescentie, de grootte en dekking van de individuele wormen in een populatie mogelijk maakt. We geven een voorbeeld van een scherm om genen die betrokken zijn in anti-schimmel aangeboren immuniteit in te identificeren<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

RNA-interferentie is een krachtige methode om genfuncties te begrijpen, vooral wanneer dit op genoombrede schaal en in een kwantitatieve context wordt uitgevoerd. In C. ...

Het algemene doel van deze procedure is om genfuncties op een kwantitatieve manier te analyseren en de effecten op genoombrede schaal in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de expressie van elk gen via RNAi te onderdrukken in 96-wells platen.Vervolgens wordt de relevante test voor genfunctie uitgevoerd. In dit voorbeeld wordt het vermogen van sea elegance om normaal te reageren op een schimmelinfectie beoordeeld door de expressie van een induceerbare fluorescente reporter te analyseren. Daarna wordt een geautomatiseerde kwantitatieve analyse uitgevoerd met de Coss bio sortt; uiteindelijk laat de analyse van kwantificeerbare kenmerken, zoals de expressie van een fluorescent reportergen, subgroepen van genen zien die vereist zijn voor het moduleren van specifieke pathways, die de ontwikkeling, het gedrag of de fysiologie sturen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in verschillende vakgebieden waar elegantie zichtbaar is, zoals de ontwikkeling, neurobiologie en interacties tussen gastheer en pathogenen. Het idee voor deze methode ontstond toen de eerste grootschalige RNAi-screens werden gepubliceerd door het laboratorium van Oranger. Het kostte aanzienlijke inspanning om de benodigde instrumenten te ontwikkelen en de automatisering te perfectioneren.Ik zal de procedure demonstreren samen met Olivia ti, een staff scientist en een research assistant uit het laboratorium van Jonathan Eubanks. Om 10 tot 12 96-wellplaten te maken, begint u met het bereiden van 100 milliliters nematode growth medium of NGM in gedeïoniseerd water. Raadpleeg het geschreven protocol voor instructies.Voeg toe terwijl het medium nog warm is 100 µg/mL ampicilline, 12,5 µg/mL tetracycline en 4 mM IPTG, en verdeel snel 75 µL over elke put van een 96-wells plaat met vlakke bodem. Controleer onmiddellijk op luchtbellen in de putten en verwijder deze. Bewaar de platen in een bevochtigingskamer bij 4 °C.Bereid vervolgens 96 deep well plates voor door 1,5 milliliters LB toe te voegen dat ampicilline en tetracycline bevat. Voeg aan elke well een uniek label of een barcode toe. Dek elke plaat af en bewaar deze op vier graden centigrade indien vooraf bereid; agiteer de 96 well LB voorraadplaat die de RNAI bevat.Maak bacteriële klonen met ampicilline, tetracycline en glycerol, en verdeel drie µL van elke bacteriële kloon over de overeenkomstige putjes van een vooraf geprepareerde 96-well deep-well plaat. Gebruik lege putjes voor de controles, dek de 96-well deep-well platen af met een adhesieve folie en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C met agitatie. Plaats de gebruikte 96-well replicate plaat op de ochtend na de nachtelijke cultuur bij -80 °C.Verplaats de 96-wells NGM-platen van 4 °C naar een steriele laminaire flowkast en laat ze vijf tot 15 minuten opwarmen en drogen. Voeg vervolgens het juiste label of de barcode toe aan elke plaat. Haal de 96-deep-well platen met de overnight-culturen uit de incubator.Centrifugeer de succesvol gegroeide bacteriële culturen. De 96-well deep-well platen gedurende vijf minuten bij 4,000 RPM. Giet het supernatant af door de plaat krachtig om te keren en droog deze snel.Resuspendeer het bacteriële pellet in de resterende vloeistof door de platen op een papieren handdoek te plaatsen en te vortexen. Gebruik idealiter een speciale agitator zodat elke plaat precies dezelfde behandeling krijgt. Breng vijf µL van de geresuspendeerde bacteriën over naar de 96-wells NGM-platen met behulp van een 8- of 12-kanaals multichannelpipet.Vermijd contact met het NGM. Laat de bacteriën ongeveer twee uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer regelmatig om te voorkomen dat het NGM te droog wordt en incubeer de 96-wells RNAi-NGM-platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigingskamer.Raadpleeg het geschreven protocol voor het prepareren van een gesynchroniseerde populatie wormen nadat de 96-well R-N-A-I-N-G-M-platen op kamertemperatuur zijn afgekoeld. Voeg ongeveer 100 tot 200 wormen in twee µL M9 toe aan elk well. Controleer of elk well wormen bevat.De wormen moeten zwemmen. Laat de platen maximaal één uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer de platen regelmatig.De wormen moeten kruipen in plaats van zwemmen. Plaats de platen gedurende de nacht in een bevochtigingskamer bij 25 °C. Na het selecteren van een sterk infectieuze batch Judge Miria spora.Gebruik M9-buffer om de sporen van een plaat van negen centimeter te oogsten. Verdeel vier µL sporen over elke put en controleer elke put op de aanwezigheid van sporen. De wormen moeten zwemmen.Laat de platen ongeveer een uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer de platen regelmatig totdat de wormen beginnen te kruipen. Plaats de geïnfecteerde platen vervolgens gedurende de nacht in een vochtige kamer bij 25 °C.Controleer de wormen vóór de analyse door ze snel onder een fluorescentiemicroscoop te observeren om te controleren op een succesvolle ontwikkeling, een goede GFP-inductie in de negatieve controle en een verminderde GFP-fluorescentie in de wells van de positieve controle. Als de inductie goed is, breng dan de wormen met een acht- of 12-kanaals multikanalenpipet over naar een nieuwe gelabelde of gebarcodeerde 96-well plaat met ronde bodem met behulp van 100 µL 50 mM NaCl en 0,05% triton.Bevries de platen bij -80 °C tot aan de analyse; ontdooi de bevroren platen op de dag van de analyse bij kamertemperatuur. Zodra de platen zijn ontdooid, kan er worden overgegaan tot de geautomatiseerde analyse met behulp van het COPA bios.De machine verwerkt de plaat putje voor putje en analyseert de parameters van elke worm, zoals hun fluorescentie. Transcribeer de verkregen informatie van de COPA bios sortt naar een Excel-bestand om de datakwaliteit te verifiëren. Sla vervolgens de ruwe gegevens, inclusief optische dichtheid, axiale lengte en fluorescente emissies, op in een limbs-pakket voor daaropvolgende gedetailleerde kwantitatieve analyses.In dit experiment drukten transgene wormen constitutief een P call 12 ds red reporter en een induceerbare PNLP 29 GFP uit. Reporterwormen werden gedurende 48 uur blootgesteld aan een controle of een A-G-F-P-R-N-A eye-kloon. De panelen links tonen niet-geïnfecteerde wormen, en de panelen rechts tonen wormen 18 uur na infectie met D spora.Wanneer het fenotype van belang de expressie van een GFP-reporter is, vormen putjes met het GFP-RNAi-kloon een robuuste controle. De COPA bios SORTT genereert numerieke gegevens voor elke geanalyseerde worm. Deze grafieken tonen het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk putje met transgene wormen.Constitutieve expressie van een p call 12 DS red reporter en een induceerbare PNLP 29 GFP reporter na RNAI en infectie met diaspora. De sorter analyseert de time of flight of TOF, wat correspondeert met de grootte van de wormen, de rode fluorescentie en de ratio van groene fluorescentie ten opzichte van de TOF. Bepaalde klonen veroorzaken groeistoringen en/of beïnvloeden de expressie van P 12 DS red.Andere beïnvloeden specifiek de FP-expressie. Bijvoorbeeld, deze specifieke kloon richt zich op het gen NS Y, waarvan eerder is aangetoond dat het belangrijk is voor de regulatie van NLP 29. Groene en rode fluorescentie en TOF worden gemeten in willekeurige maar constante eenheden.Een van de innovaties van dit protocol is het gebruik van vriesplaten om de analyse uit te stellen. Bevriezen maakt het mogelijk om platen tot twee weken te bewaren zonder de resultaten wezenlijk te beïnvloeden, zoals hier wordt aangetoond. Hoewel de absolute waarden van de gemeten fluorescentie kunnen veranderen, blijven hun relatieve ratio's vergelijkbaar.Vier wormen met PNLP 29 GFP en P call 12 ds red transgenen werden wel of niet geïnfecteerd met diaspora. Na 18 uur werd elke plaat ongeveer in tweeën gedeeld; de ene helft werd onmiddellijk geanalyseerd en de andere helft werd gedurende 24 uur bevroren bij -80 °C voordat deze werd ontdooid. Voor elk monster werden analysewaarden berekend voor de gemiddelde grootte, opaciteit en groene en rode fluorescentie.De grafiek toont de verhouding tussen het gemiddelde van de geïnfecteerde monsters gedeeld door de niet-geïnfecteerde monsters voor de hier getoonde bevroren en levende monsters. Uit dubbele analyses van een representatieve plaat volgen de genormaliseerde fluorescentieverhoudingen voor elke put, wat de gemiddelde fluorescentie van een put is gedeeld door het getrimde gemiddelde van de plaat. Zodra dit protocol onder de knie is, kan een groep van twee tot drie personen in twee tot drie maanden een genome-wide screen uitvoeren.De succesvolle uitvoering van dit protocol vereist een goede samenwerking in teamverband. De leden van mijn groep hebben een enorme inspanning geleverd om een protocol te maken dat efficiënt is en relatief eenvoudig kan worden uitgevoerd.

quantitative-automated-high-throughput-genome-wide-rnai-screens-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype...

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

RNAi is een krachtig genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is voor onderzoekers van C. elegans.  Deze video introduceert een methode om meer wormen met RNAi te behandelen dan plaatvoeding door gebruik te maken van vloeibare kweekomstandigheden.

RNAi-voeding in vloeibare cultuur: een methode met hoge doorvoer om genexpressie in C. elegans neer te slaan

Source: Anderson, Q. L. et al. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a high-throughput screening method using Caenorhabditis elegans to study gene knockdowns during host-pathogen interactions. It outlines the procedure for preparing knockdown worms and transferring them to assay plates to evaluate the effects of pathogen-induced worm killing.

A Multiwell Liquid-Based Assay for Screening C. elegans Knockdowns

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Leer kwantitatieve RNAi-screening in C. elegans voor genoomwijde genfunctieanalyse met geautomatiseerde fenotypische metingen. Deze methode identificeert genen betrokken bij antifungale aangeboren immuniteit.

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans

Meer video's verkennen