Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans

Het algemene doel van deze procedure is om genfuncties op een kwantitatieve manier te analyseren en de effecten op genoombrede schaal in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de expressie van elk gen via RNAi te onderdrukken in 96-wells platen.

Vervolgens wordt de relevante test voor genfunctie uitgevoerd. In dit voorbeeld wordt het vermogen van sea elegance om normaal te reageren op een schimmelinfectie beoordeeld door de expressie van een induceerbare fluorescente reporter te analyseren. Daarna wordt een geautomatiseerde kwantitatieve analyse uitgevoerd met de Coss bio sortt; uiteindelijk laat de analyse van kwantificeerbare kenmerken, zoals de expressie van een fluorescent reportergen, subgroepen van genen zien die vereist zijn voor het moduleren van specifieke pathways, die de ontwikkeling, het gedrag of de fysiologie sturen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in verschillende vakgebieden waar elegantie zichtbaar is, zoals de ontwikkeling, neurobiologie en interacties tussen gastheer en pathogenen. Het idee voor deze methode ontstond toen de eerste grootschalige RNAi-screens werden gepubliceerd door het laboratorium van Oranger. Het kostte aanzienlijke inspanning om de benodigde instrumenten te ontwikkelen en de automatisering te perfectioneren.

Ik zal de procedure demonstreren samen met Olivia ti, een staff scientist en een research assistant uit het laboratorium van Jonathan Eubanks. Om 10 tot 12 96-wellplaten te maken, begint u met het bereiden van 100 milliliters nematode growth medium of NGM in gedeïoniseerd water. Raadpleeg het geschreven protocol voor instructies.

Voeg toe terwijl het medium nog warm is 100 µg/mL ampicilline, 12,5 µg/mL tetracycline en 4 mM IPTG, en verdeel snel 75 µL over elke put van een 96-wells plaat met vlakke bodem. Controleer onmiddellijk op luchtbellen in de putten en verwijder deze. Bewaar de platen in een bevochtigingskamer bij 4 °C.

Bereid vervolgens 96 deep well plates voor door 1,5 milliliters LB toe te voegen dat ampicilline en tetracycline bevat. Voeg aan elke well een uniek label of een barcode toe. Dek elke plaat af en bewaar deze op vier graden centigrade indien vooraf bereid; agiteer de 96 well LB voorraadplaat die de RNAI bevat.

Maak bacteriële klonen met ampicilline, tetracycline en glycerol, en verdeel drie µL van elke bacteriële kloon over de overeenkomstige putjes van een vooraf geprepareerde 96-well deep-well plaat. Gebruik lege putjes voor de controles, dek de 96-well deep-well platen af met een adhesieve folie en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C met agitatie. Plaats de gebruikte 96-well replicate plaat op de ochtend na de nachtelijke cultuur bij -80 °C.

Verplaats de 96-wells NGM-platen van 4 °C naar een steriele laminaire flowkast en laat ze vijf tot 15 minuten opwarmen en drogen. Voeg vervolgens het juiste label of de barcode toe aan elke plaat. Haal de 96-deep-well platen met de overnight-culturen uit de incubator.

Centrifugeer de succesvol gegroeide bacteriële culturen. De 96-well deep-well platen gedurende vijf minuten bij 4,000 RPM. Giet het supernatant af door de plaat krachtig om te keren en droog deze snel.

Resuspendeer het bacteriële pellet in de resterende vloeistof door de platen op een papieren handdoek te plaatsen en te vortexen. Gebruik idealiter een speciale agitator zodat elke plaat precies dezelfde behandeling krijgt. Breng vijf µL van de geresuspendeerde bacteriën over naar de 96-wells NGM-platen met behulp van een 8- of 12-kanaals multichannelpipet.

Vermijd contact met het NGM. Laat de bacteriën ongeveer twee uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer regelmatig om te voorkomen dat het NGM te droog wordt en incubeer de 96-wells RNAi-NGM-platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigingskamer.

Raadpleeg het geschreven protocol voor het prepareren van een gesynchroniseerde populatie wormen nadat de 96-well R-N-A-I-N-G-M-platen op kamertemperatuur zijn afgekoeld. Voeg ongeveer 100 tot 200 wormen in twee µL M9 toe aan elk well. Controleer of elk well wormen bevat.

De wormen moeten zwemmen. Laat de platen maximaal één uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer de platen regelmatig.

De wormen moeten kruipen in plaats van zwemmen. Plaats de platen gedurende de nacht in een bevochtigingskamer bij 25 °C. Na het selecteren van een sterk infectieuze batch Judge Miria spora.

Gebruik M9-buffer om de sporen van een plaat van negen centimeter te oogsten. Verdeel vier µL sporen over elke put en controleer elke put op de aanwezigheid van sporen. De wormen moeten zwemmen.

Laat de platen ongeveer een uur drogen in een steriele laminaire flowkast. Controleer de platen regelmatig totdat de wormen beginnen te kruipen. Plaats de geïnfecteerde platen vervolgens gedurende de nacht in een vochtige kamer bij 25 °C.

Controleer de wormen vóór de analyse door ze snel onder een fluorescentiemicroscoop te observeren om te controleren op een succesvolle ontwikkeling, een goede GFP-inductie in de negatieve controle en een verminderde GFP-fluorescentie in de wells van de positieve controle. Als de inductie goed is, breng dan de wormen met een acht- of 12-kanaals multikanalenpipet over naar een nieuwe gelabelde of gebarcodeerde 96-well plaat met ronde bodem met behulp van 100 µL 50 mM NaCl en 0,05% triton.

Bevries de platen bij -80 °C tot aan de analyse; ontdooi de bevroren platen op de dag van de analyse bij kamertemperatuur. Zodra de platen zijn ontdooid, kan er worden overgegaan tot de geautomatiseerde analyse met behulp van het COPA bios.

De machine verwerkt de plaat putje voor putje en analyseert de parameters van elke worm, zoals hun fluorescentie. Transcribeer de verkregen informatie van de COPA bios sortt naar een Excel-bestand om de datakwaliteit te verifiëren. Sla vervolgens de ruwe gegevens, inclusief optische dichtheid, axiale lengte en fluorescente emissies, op in een limbs-pakket voor daaropvolgende gedetailleerde kwantitatieve analyses.

In dit experiment drukten transgene wormen constitutief een P call 12 ds red reporter en een induceerbare PNLP 29 GFP uit. Reporterwormen werden gedurende 48 uur blootgesteld aan een controle of een A-G-F-P-R-N-A eye-kloon. De panelen links tonen niet-geïnfecteerde wormen, en de panelen rechts tonen wormen 18 uur na infectie met D spora.

Wanneer het fenotype van belang de expressie van een GFP-reporter is, vormen putjes met het GFP-RNAi-kloon een robuuste controle. De COPA bios SORTT genereert numerieke gegevens voor elke geanalyseerde worm. Deze grafieken tonen het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk putje met transgene wormen.

Constitutieve expressie van een p call 12 DS red reporter en een induceerbare PNLP 29 GFP reporter na RNAI en infectie met diaspora. De sorter analyseert de time of flight of TOF, wat correspondeert met de grootte van de wormen, de rode fluorescentie en de ratio van groene fluorescentie ten opzichte van de TOF. Bepaalde klonen veroorzaken groeistoringen en/of beïnvloeden de expressie van P 12 DS red.

Andere beïnvloeden specifiek de FP-expressie. Bijvoorbeeld, deze specifieke kloon richt zich op het gen NS Y, waarvan eerder is aangetoond dat het belangrijk is voor de regulatie van NLP 29. Groene en rode fluorescentie en TOF worden gemeten in willekeurige maar constante eenheden.

Een van de innovaties van dit protocol is het gebruik van vriesplaten om de analyse uit te stellen. Bevriezen maakt het mogelijk om platen tot twee weken te bewaren zonder de resultaten wezenlijk te beïnvloeden, zoals hier wordt aangetoond. Hoewel de absolute waarden van de gemeten fluorescentie kunnen veranderen, blijven hun relatieve ratio's vergelijkbaar.

Vier wormen met PNLP 29 GFP en P call 12 ds red transgenen werden wel of niet geïnfecteerd met diaspora. Na 18 uur werd elke plaat ongeveer in tweeën gedeeld; de ene helft werd onmiddellijk geanalyseerd en de andere helft werd gedurende 24 uur bevroren bij -80 °C voordat deze werd ontdooid. Voor elk monster werden analysewaarden berekend voor de gemiddelde grootte, opaciteit en groene en rode fluorescentie.

De grafiek toont de verhouding tussen het gemiddelde van de geïnfecteerde monsters gedeeld door de niet-geïnfecteerde monsters voor de hier getoonde bevroren en levende monsters. Uit dubbele analyses van een representatieve plaat volgen de genormaliseerde fluorescentieverhoudingen voor elke put, wat de gemiddelde fluorescentie van een put is gedeeld door het getrimde gemiddelde van de plaat. Zodra dit protocol onder de knie is, kan een groep van twee tot drie personen in twee tot drie maanden een genome-wide screen uitvoeren.

De succesvolle uitvoering van dit protocol vereist een goede samenwerking in teamverband. De leden van mijn groep hebben een enorme inspanning geleverd om een protocol te maken dat efficiënt is en relatief eenvoudig kan worden uitgevoerd.