Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

Het algemene doel van het volgende experiment is om high-content assays in cellulaire ziektemodellen te gebruiken om pathways te kwantificeren die beïnvloed worden bij neurodegeneratieve ziekten. Om dit te bereiken, wordt een cellulair model van het ziektefenotype in het geautomatiseerde celkweeksysteem geplaatst en worden de cellen geïncubeerd tot het vereiste aantal cellen is bereikt. De cellen worden vervolgens gesplitst, geteld en gedistribueerd in 96-wells platen die lentivirus bevatten dat verschillende SH RNA's tot expressie brengt.

Na zes dagen van cellulaire differentiatie worden de cellen uit het systeem gehaald voor immunokleuring en high-content imaging. Tot slot worden de beelden geanalyseerd met behulp van diverse analyse-algoritmen om kenmerken met betrekking tot de celgezondheid te kwantificeren, zoals neuronale uitgroei en mitochondriale functie.

De resultaten worden ook geanalyseerd met een twee-weg ANOVA om significante interactie-effecten te identificeren. Deze methode kan het beantwoorden van kernvragen over de functie van ziektegerelateerde genen en de pathways waarin zij over het algemeen functioneren, bespoedigen. Dit zal vervolgens leiden tot een beter begrip van de pathogene mechanismen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten.

Om het celkweekproces te starten, dient het geautomatiseerde celkweeksystem voor de invoer van celkweekplaten te worden klaargezet. Laad verbruiksartikelen zoals pipetpunten, celkweekplaten en assayplaten in het systeem. Zorg er daarnaast handmatig voor dat er voldoende celkweekmedium, PBS en trypsine in het systeem aanwezig zijn.

Zaai twee omni tray-platen in met twee keer 10⁶ cellen per plaat van de SH SY five Y neuroblastoom-cellijn. Houd de cellen in stand in optimum media met 10% foetaal kalfserum FBS. Plaats de platen op het invoerrek van de celkweekrobot. Selecteer via de grafische gebruikersinterface of gui het protocol voor adherente celkweek en pas de parameterspecifieke bestanden voor de adherente cellijn aan zodat de confluentiedrempel is ingesteld op 70%.

Stel de totale ionisatietijd in op twee minuten. Instrueer het systeem om nieuwe omni tray-platen voor te bereiden met een celbezetting van 2 × 10⁶ cellen per plaat. Instrueer het systeem om assay-platen per omni tray-plaat voor te bereiden met in totaal 5.000 cellen per putje; incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.

De volgende stappen maken deel uit van dit protocol voor adherente celkweek. Platen worden geïncubeerd en gefotografeerd totdat de cellen de vooraf gedefinieerde confluentiedrempel bereiken. Als de cellen de confluentiedrempel niet binnen vijf metingen bereiken, worden de platen uit het systeem verwijderd.

Zodra de door de gebruiker gedefinieerde confluentiedrempel is bereikt, worden de cellen gewassen, getrypsiniseerd en geteld. Een vooraf bepaald aantal cellen wordt aan nieuwe omni trait-platen toegevoegd en, indien er voldoende cellen zijn, worden een gespecificeerd aantal assay-platen naar het deck getransporteerd en wordt een gedefinieerd aantal cellen in elke put gedispenseerd. Ten slotte kunnen assay-platen direct worden afgebeeld met de geïntegreerde microscoop of uit het systeem worden gehaald voor verdere verwerking om de procedure voor virusproductie te starten.

Inoculeer LB-medium met ampicilline met bacteriële glycerolstocks die de HRNA-vectoren bevatten en laat deze een nacht groeien. Centrifugeer de volgende dag de cellen en verwijder het supernatant. Extraheer de plasmiden met behulp van het wizard Magnus cell plasmid purification system. Het uiteindelijke eluaat met plasmide-DNA wordt opgevangen in 96-wellplaten. Het S-H-R-N-A lentivirus wordt geproduceerd via het RNAi-consortium, een lentivirale productie in 96-wellplaten. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in een ML2- of BSL2-laboratorium voor biologische veiligheid, en alle gebruikte reagentia en verbruiksartikelen moeten na gebruik worden gedecontamineerd met 30% chloor.

De procedure voor de productie van lentivirus wordt in deze video niet gedemonstreerd, maar deze duurt vier dagen en bestaat uit de volgende stappen. Op dag nul worden de verpakkingscellen gezaaid; de volgende middag is het dag één, waarop de verpakkingscellen worden getransfecteerd met drie lentivirus-plasmiden. 18 uur na transfectie volgt de volgende stap.

Op dag twee wordt het medium vervangen door vers medium met een hoge BSA- of serumconcentratie. 24 uur na de mediumvervanging, op dag drie, wordt het virus geoogst en wordt het medium opnieuw vervangen door vers medium met een hoge BSA- of serumconcentratie.

Ten slotte wordt het virus op dag vier, 24 uur na de eerste virus-oogst, opnieuw geoogst en worden de verpakkingscellen weggegooid om de multipliciteit van infectie of MOI van het lentivirus te berekenen. Transduceer SHSY-FY-cellen met seriële verdunningen van het virus en incubeer de cellen gedurende 72 uur na transductie bij 37 °C. Visualiseer de GFP-expressie onder een microscoop en bepaal het percentage GFP-positieve cellen. Plateer het SH-RNA-lentivirus op assay-platen met een MOI van 3. Nadat het SH-RNA-lentivirus op de assay-platen is geplateerd, worden de platen in het geautomatiseerde celkweeksyteem geladen voor lentivirale transductie.

Na 24 uur wordt het medium op de assayplaten vervangen door optimum met 0,5% FBS en 0,1 micromolar retinoïnezuur. Om het differentiatieproces te starten, worden de assayplaten nog vijf dagen geïncubeerd in het differentiatiemedium om op dag vijf een maximale knockdown van de expressie van het doelgen te waarborgen; voeg op dag zes H2O toe aan de helft van de assayplaten gedurende 24 uur om de translocatie van het DJ one-eiwit naar de mitochondriën te stimuleren. Voeg MitoTracker toe aan de cellen tot een eindconcentratie van 200 nanomolar per putje en incubeer 30 minuten bij 37 °C.

Daarna kunnen de platen naar de high content- of HC-imager worden getransporteerd voor beeldvorming. Als alternatief kunnen de platen uit het systeem worden geëxporteerd voor verdere verwerking, zoals immunokleuring. Voor high content-beeldvorming wordt in totaal 30 velden per putje gefotografeerd met de 20 x objectieflens, waarbij DJ one wordt gevisualiseerd met de fitzy-filterset, mitochondriën met de trixy-filterset, beta three tubulin met de S five-filterset en kernen met de UV-filterset.

Dit is een voorbeeld van samengestelde beelden van cellen die zijn verkregen via high-content imaging. In figuur drie worden onbehandelde cellen getoond in paneel A en cellen behandeld met H2O twee in paneel B. DJ one is groen gelabeld, mitochondria in rood en celkernen in blauw. Om de gemiddelde overlapcoëfficiënt tussen DJ one en de mitochondria te bepalen, analyseert u de beelden met de colocalization bio-applicatie.

Definieer de regio's van interesse. ROI als volgt: ROIA voor de nucleus, figuur vier A en E, en ROIB voor de mitochondria, figuur vier B en F; sluit ROIA uit van ROIB. Om te garanderen dat alleen het cytoplasma wordt geanalyseerd, definieert u de mitochondria als doelregio één en DJ1 als doelregio twee, figuur vier C en G. Analyseer de beelden met de com compartmental analysis bio-applicatie om de gemiddelde intensiteit van het MIT tracker-signaal binnen de mitochondria te bepalen.

Figuur vier B en F om de gemiddelde lengtes van de neurieten uit de bèta drie tubuline-kleuring te bepalen. Analyseer de beelden met de neuronal profiling bio-applicatie figuur vier D en H volgende beeldplaten met behulp van de opera lx geautomatiseerde confocale reader.

Visualiseer mitochondriën met de 561 nanometer laser en kernen met een UV-excitatiebeeld. In totaal worden 30 velden per put opgenomen met behulp van de 60 x objectieflens met waterimmersie. Analyseer ten slotte de beelden met het spot edge ridge of SER texture features algoritme.

Het SER-ridgefilter transmitteert intensiteit in pixels die rugachtige patronen vormen. Hoe gefragmenteerder de mitochondriën, hoe hoger de SER-ridge-score. In deze video werden high-content assays (HC-assays) gebruikt om modulatoren te identificeren voor het DJ-1-eiwit, waarvan het verlies leidt tot autosomaal recessief parkinsonisme.

Dit eerste representatieve resultaat illustreert een epistatische interactie met DJ one. De staafgrafiek links toont genormaliseerde fluorescentie-eenheden en de afbeeldingen rechts tonen SHSY five Y-cellen, rood gelabeld met mito tracker voor kwantificering van de cellevensvatbaarheid.

Er werd waargenomen dat knockdown van DJ one in cellen die waren blootgesteld aan toxine resulteerde in een groter verlies van celviabiliteit in vergelijking met cellen die waren geïnfecteerd met scrambled lentivirus. Knockdown van doelgen A had een vergelijkbaar effect als dat waargenomen in cellen met een DJ one-knockdown. Echter resulteerde knockdown van zowel DJ one als doelgen A in een significant groter verlies van celviabiliteit dan het verlies van elk van beide genen afzonderlijk, wat wijst op een epistatische interactie tussen DJ one en doelgen A. Dit volgende voorbeeld betreft een gen dat de translocatie van DJ one reguleert.

De staafgrafiek toont de genormaliseerde overlapcoëfficiënt tussen DJ one en de mitochondriën, wat de translocatie van DJ one van het cytoplasma naar de mitochondriën weerspiegelt. Panelen A tot en met D zijn beelden van SHSY five Y-cellen, gelabeld in het groen voor DJ one, rood voor mitochondriën en blauw voor kernen. Wanneer cellen worden blootgesteld aan een toxine, transloceert DJ one van het cytoplasma naar de mitochondriën, wat wordt gekwantificeerd door een hogere overlapcoëfficiënt tussen DJ one en de mitochondriën.

In cellen waarin doelgen B is onderdrukt, transloceert minder DJ one naar de mitochondriën wanneer cellen worden blootgesteld aan de toxine, wat suggereert dat doelgen B betrokken is bij het transport van DJ one naar de mitochondriën. Een voorbeeld van een gen dat betrokken is bij neuronale uitgroei wordt hier getoond. Genormaliseerde neuritelengtes zijn weergegeven in het staafdiagram en de cellen die zijn gebruikt voor de kwantificering van de neuritelengtes zijn te zien op de afbeeldingen, met beta drie tubuline in het groen en kernen in het blauw.

De knockdown van doelgen C in wild-type SHSY five Y-cellen resulteert in een significante toename van de neurietenlengte in vergelijking met cellen die zijn geïnfecteerd met lentivirus dat scrambled SH RNA tot expressie brengt. Dit effect gaat verloren in cellen die zijn geïncubeerd met toxine. Tot slot tonen deze resultaten een voorbeeld van een gen dat betrokken is bij de mitochondriële morfologie.

De gemiddelde segmentatiewaarden van de mitochondriale SER-richels voor SHSY five Y-cellen geïnfecteerd met scrambled HRNA of A-S-H-R-N-A gericht op gen D worden in de grafiek weergegeven. Afbeelding A en afbeelding C zijn samengestelde beelden van respectievelijk SHSY five Y-cellen geïnfecteerd met scrambled HRNA of A-H-R-N-A gericht op gen D. Mitochondriën zijn rood gekleurd, terwijl kernen blauw zijn gekleurd.

Afbeelding B en D zijn visualisaties van de kwantificering van de SER-kammen zoals hier waargenomen. Infectie van wild-type SHSY5Y-cellen met hRNA gericht op gen D resulteert in een toename van de segmentatiewaarde van de mitochondriale SER-kammen in vergelijking met cellen geïnfecteerd met een gescrambled lentivirus. Deze aanpak kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van neurodegeneratie om de betrokken pathways in de pathogenese van ziekten tijdig te verkennen en te annoteren.

Dit zal vervolgens leiden tot betere doelwitten voor therapeutische ontwikkeling.