Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Het algemene doel van deze procedure is het vastleggen van het effect van aangelegde elektrische velden op de migratie van neurale progenitorcellen in 2D-culturen en 3D-ex vivo-modellen. Dit wordt bereikt door eerst neurale progenitorcellen in vitro te isoleren en te expanderen. De tweede stap is het prepareren van een suspensie van enkelvoudige neurale progenitorcellen.

Vervolgens worden, voor de voorbereiding van de 2D-cultuur, neurale progenitorcellen geplaatst in speciaal ontworpen elektrotactische kamers. Alternatief worden, voor de voorbereiding van het 3D ex vivo-model, neurale progenitorcellen gelabeld met hooks 3, 3, 3, 4, 2 en geïnjecteerd in een organotypisch model van een dwarsdoorsnede van het ruggenmerg. Tot slot wordt een elektrisch veld aangelegd over de elektrokamers en wordt een time-lapse-opname gemaakt om aan te tonen dat de progenitorcellen in zowel 2D- als 3D-omgevingen migreren naar de kathode van het elektrische veld.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nieuwe methode biedt voor het live volgen van de door elektrische velden geïnduceerde migratie van individuele cellen na transplantatie in een 3D organotypisch model, dat sterk lijkt op de natuurlijke omgeving. Deze methode kan niet alleen inzicht verschaffen in de elektrotechniek en de migratie van neurale stamcellen die in ruggenmergsnijplaten zijn getransplanteerd, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine hersensnijplaatmodellen. Om deze procedure te starten, bereidt u glazen strips van 22 bij 11 millimeter voor door geautoclaveerde platen van 22 bij 22 millimeter te verdelen.

Snijd dekglas van nummer 1 dikte in tweeën met een diamantstift. Maak vervolgens een vrijstaande glazen put met binnenafmetingen van 22 bij 10 millimeter door vier verticale stroken van 22 bij 11 millimeter aan elkaar te lijmen met hoogvacuüm siliconenvet; laat de put gedurende de nacht volledig drogen en uitharden. Bevestig de volgende dag twee glazen stroken van 22 bij 11 millimeter parallel aan elkaar, met een tussenruimte van 10 millimeter, aan de bodem van een kweekschaal van 100 millimeter met behulp van siliconenvet.

Sluit vervolgens het gebied tussen deze strips af door een dekglas van 22 bij 22 millimeter met siliconenvet te bevestigen. Plaats het glazen reservoir op de dekglazen, zodat de binnenwanden een afgesloten ruimte vormen voor het uitplaten van de cellen. Maak alle verbindingen waterdicht met siliconenvet.

Coat dit afgebakende gebied opeenvolgend met poly-D-lysin en daarna met laminine, zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Verkrijg bij deze procedure de hersenen van muizen in het stadium E 14 tot E 16 en plaats deze in koud D-M-E-M-F 12 basaal medium. Verwijder vervolgens de hersenvliezen onder een anatomische microscoop.

Breng daarna de hersenen over naar een Petrischaal van 35 millimeter. Gebruik de fijne pincet om de hersenen te dissociëren in weefselfragmenten. Breng deze vervolgens over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.

Centrifugeer de monsters op 800 RPM gedurende drie minuten om D-debris te verwijderen. Voeg vervolgens A-D-M-E-M-F 12 met BFDF en DGF toe aan de monsters. Tritteer deze met een pipette van één milliliter.

Verkrijg vervolgens de enkelcel-suspensie met behulp van een celzeef. Zaai de cellen uit in de kolfjes tegen een concentratie van 20.000 tot 50.000 cellen per milliliter. Voer vervolgens elke drie dagen een volledige mediumverversing uit, waarbij de cellen gedurende vijf minuten worden gecentrifugeerd bij 1.300 RPM.

Verwijder het supernatant, resuspendeer de PT in vers medium en breng de cellen elke zes dagen terug in de kolf, na ten minste vijf keer. Breng de NEUROSFEREN over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze bij 1.500 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant.

Resuspendeer het pellet in trips met EDTA om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Bereid vóór het uitvoeren van een celtelling één milliliter suspensie voor die 10 000 cellen bevat. Verwijder vervolgens de laminine uit de glazen well en laat deze volledig drogen.

Vervang dit door één milliliter celсусpensie. Plaats de schaal daarna in de incubator bij 37 °C gedurende minimaal vier uur om hechting mogelijk te maken. Zodra de cellen voldoende confluent zijn, wordt het medium uit de kamer verwijderd.

Verwijder het glas voorzichtig. Vorm vervolgens een dak over de cellen door een geautoclaveerd dekglas van 22 bij 22 millimeter voorzichtig tussen twee stroken van 22 bij 11 millimeter met siliconenvet te bevestigen. Vergeet niet de cellen te bedekken met een paar druppels medium om uitdroging te voorkomen.

Vorm vervolgens aan beide uiteinden van de kamer een geïsoleerd mediumreservoir door twee waterdichte barrières van siliconenvet aan te brengen die van het ene naar het andere uiteinde van de schaal lopen. Vul de kamer met vers medium, waarbij een doorstroming van het ene naar het andere mediumreservoir wordt gewaarborgd. Plaats de schaal daarna gedurende 12 uur terug in de incubator om herstel van de cellen mogelijk te maken.

Bereid in de volgende stap een deksel voor om de schaal af te dekken door twee gaten te boren, waarbij elk gat zich boven een reservoir van de migratiekamer bevindt. Vervang vervolgens het medium in de kamer door kweekmedium dat 25 millimeter HEPES-buffer bevat. Verplaats de schaal daarna naar het temperatuurgecontroleerde beeldvormingssysteem.

Stel de experimentele parameters in voor time-lapse en multi-positie opname. Lijn de kamer zo uit dat de kathode en anode respectievelijk links en rechts staan om te garanderen dat de vector van het elektrische veld horizontaal loopt zoals gezien onder de microscoop en vastgelegd in het beeldvormingssysteem. Vul vervolgens twee bekerglazen.

Met de Steinberg-oplossing. Verbind een apart bekerglas met elk mediumreservoir met behulp van de vooraf bereide glazen bruggen gevuld met een 2% Steinberg-agaroplossing. Plaats vervolgens de zilverelektroden, die zijn aangesloten op een gelijkstroomvoeding, in de Steinberg-oplossing.

Zet bij elk bekerglas de spanningsregelaar van de voeding op nul en schakel deze in. Meet de spanning over de elektrotactische kamer met een voltmeter terwijl u de spanningsregelaar omhoog draait. Stel de spanning vervolgens in volgens de experimentele vereisten.

Start daarna de time-lapse opname. Voer een mediumwissel uit en pas het voltage indien nodig opnieuw aan. Elk uur kunnen er, naar behoefte, vers medium, geneesmiddelen of chemische agentia aan de reservoirs worden toegevoegd.

Maak gebruik van extra gaten die in het deksel van de kweekschaal zijn geboord, waarbij één gat zich boven elk mediumreservoir bevindt. Dissekeer in deze stap de lumbale ruggenmergen van twee weken oude muizen. Snijd vervolgens de ruggenmergen met een Machel-June weefselhakker onder een anatomische microscoop in secties van 500 micron dik.

Scheid de coupes en selecteer die met een intacte sagittale axiale ruggenmergstructuur. Plaats de coupes vervolgens in een Petri-schaal van 100 millimeter met 30 microliters MA-gel. Positioneer ze zo dicht mogelijk bij het centrum.

Bewaar deze in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Om de Matrigel-eiwitten zelf te laten assembleren en een dunne film te vormen die het oppervlak van de dwarsdoorsneden van het ruggenmerg bedekt, is het zeer belangrijk dat de Matrigel volledig is geassembleerd. Incubeer de Petrischaal indien nodig nogmaals 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens vier tot zes milliliter DMEM/F12-medium toe dat 25 millimol HEPES-buffer en 15 tot 20% foetaal kalfsserum bevat.

Zorg er zeer voorzichtig voor, om te voorkomen dat het medium direct over de plakjes stroomt, dat de plakjes niet volledig ondergedompeld zijn in het medium, zodat het oppervlak van de aubergines goed aan de lucht worden blootgesteld. Verschoon het medium tweemaal per week. Incubeer nu de suspensie van neurale progenitorcellen in het medium met vijf micromolar hooks.

3, 3, 3, 4, 2 gedurende 30 minuten. Gebruik onder een microscoop een glazen capillair om twee microliters van de suspensie in de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg te micro-injecteren. Zorg ervoor dat de glazen capillair langzaam door de matrigel gaat en het binnenste van de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg bereikt.

Houd de glazen buis ten minste 30 seconden in de plakje ruggenmerg om cellessuspensie te voorkomen. Laat dit passeren en plaats vervolgens de Petrischaal met het plakje ruggenmerg gedurende de nacht in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Richt de volgende dag een elektrotactische kamer in rond het plakje ruggenmerg met haken 3 3 3 4 2 gelabelde neurogenese-cellen voordat er een elektrisch veld van 500 mV/mm wordt aangelegd.

Hier vertonen de neurale progenitorcellen een sterk gerichte migratie naar de kathode bij blootstelling aan de elektrische velden; de rode lijnen en blauwe pijlen representeren respectievelijk de trajecten en de richting van de celbeweging. En hier is de plot van de weergegeven migratiepaden. Hier zijn de neurale progenitorcellen gelabeld met hooks 3 3, 3, 4 2.

Ze werden getransplanteerd in de organotypische dwarsdoorsnede van het ruggenmerg aan het begin van de behandeling met het elektrische veld. Nadat de neurale progenitorcellen 2,5 uur lang directioneel naar de kathode waren gemigreerd, werd de polariteit van het elektrische veld omgekeerd. De veranderde polariteit van het elektrische veld veroorzaakte een scherpe omkering van de as richting de nieuwe kathode.

Hier is een afbeelding van de getransplanteerde neurale progenitorcellen binnen de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg. Aan het einde van de time-lapse opname wordt hier een 3D-reconstructie van de getransplanteerde neurale progenitorcellen binnen de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg getoond. Massa beheerst.

Deze techniek kan in twee weken worden voltooid als deze na de ontwikkeling correct wordt uitgevoerd. Deze techniek plaveit nu de weg voor onderzoekers in het veld van de celbiologie om de migratie van neurale progenitorcellen in 2D- en 3D-cultuursystemen als reactie op en onder invloed van een elektrisch veld te onderzoeken.