Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van de toegepaste elektrische velden op de migratie van neurale stamcellen in 2D-kweek en 3D ex vivo-modellen vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst neuron neurale stamcellen in vitro te isoleren en uit te breiden. De tweede stap is het bereiden van een enkele celsuspensie van neurale stamcellen.

Vervolgens worden neurale stamcellen voor de 2D-kweekvoorbereiding geplaatst in speciaal ontworpen elektrotactische kamers. Voor de voorbereiding van 3D ex vivo-modellen worden neurale stamcellen gelabeld met haken 3, 3, 3, 4, 2 en geïnjecteerd in een organotypisch model van een ruggenmergsnede. Uiteindelijk wordt een elektrisch veld toegepast op de elektrokamers en wordt time-lapse-opname uitgevoerd om te laten zien dat progenitorcellen in zowel 2D- als 3D-omgevingen naar de kathode van het elektrische veld migreren.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het een nieuwe methode biedt voor het live volgen van elektrische veldgeïnduceerde migratie van individuele cellen na transplantatie in een 3D organotypisch model, dat nauw aansluit bij de natuurlijke omgeving. Deze methode kan niet alleen inzicht geven in de elektrotechniek, migratie van neuro ental cellen getransplanteerd in ruggenmergsnede, maar kan ook worden toegepast op andere systemen die als hersensnedemodellen klein zijn. Om deze procedure te starten, bereid 22 bij 11 millimeter glazen strips voor door de autoclaaf 22 bij 22 millimeter te verdelen.

Numme een dikte deksels in het midden met een diamantpen. Maak vervolgens een vrijstaande glazen put met binnenmaten van 22 bij 10 millimeter door vier verticaal staande 22 bij 11 millimeter strips samen te lijmen met hoogvacuüm siliconenvet, laat de put volledig drogen en harden overnacht. De volgende dag bevestigt u 2 22 bij 11 millimeter glazen strips parallel aan elkaar, met een opening van 10 millimeter tot de basis van een 100 millimeter kweekschaal met behulp van siliconenvet.

Vervolgens verzegelt u het gebied tussen deze strips door een 22 bij 22 millimeter deksel met siliconenvet te bevestigen. Plaats de glazen put op de deksels zodat de binnenwanden een beperkte ruimte creëren voor het zaaien van de cellen. Maak alle verbindingen waterdicht met siliconenvet.

Bekleed dit beperkte gebied achtereenvolgens met poly de lycine, gevolgd door laminine zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Verkrijg in deze procedure de hersenen van E 14 tot E 16 muizen en plaats ze in koud D-M-E-M-F 12 basaal medium. Verwijder vervolgens de hersenvliezen onder een anatomische microscoop.

Breng de hersenen vervolgens over naar een 35 millimeter petrischaal. Gebruik de fijne pincetten om de hersenen in weefselfragmenten te dissociëren. Breng ze vervolgens over naar een 15 milliliter centrifugebuisje.

Centrifugeer de monsters bij 800 RPM gedurende drie minuten om D-debris te verwijderen. Voeg vervolgens A-D-M-E-M-F 12 met BFDF en DGF toe aan de monsters. Pipetteer ze met een pipet van één milliliter.

Verkrijg vervolgens de enkele celsuspensie met een celstrainer. Plateer de cellen in de kolven bij 20.000 tot 50.000 cellen per milliliter. Voer vervolgens om de drie dagen een volledige mediumverversing uit, wat het centrifugeren van de cellen bij 1.300 RPM gedurende vijf minuten inhoudt.

Gooi het supinate Resus weg, suspendeer de PT in vers medium en breng de cellen om de zes dagen terug naar de kolf na minimaal vijf dagen. Breng de NEUROSFEEREN over naar een 15 milliliter centrifugebuisje bij 1.500 RPM gedurende vijf minuten. Gooi het supinate weg.

Suspendeer het pellet opnieuw in trips in EDTA om een enkele celsuspensie te produceren. Voordat u een celtelling uitvoert, bereidt u één milliliter suspensie met 10.000 cellen. Verwijder vervolgens laminine uit de glazen put en laat het volledig drogen.

Vervang het met één milliliter celsuspensie. Plaats vervolgens de schaal in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende minimaal vier uur om hechting mogelijk te maken. Zodra de cellen voldoende confluent zijn, verwijdert u het medium uit de kamer.

Verwijder voorzichtig het glas. Vorm vervolgens een dak over de cellen door voorzichtig een autoclaaf 22 bij 22 millimeter glazen deksel tussen 2 22 bij 11 millimeter strips met siliconenvet te bevestigen. Vergeet niet om de cellen te bedekken met een paar druppels medium om uitdroging te voorkomen.

Vorm vervolgens een geïsoleerd mediumreservoir aan elk uiteinde van de kamer door twee waterdichte siliconenvet-barrières te maken die van het ene uiteinde van de schaal naar het andere lopen. Vul de kamer met vers medium en zorg voor een doorstroming van het ene mediumreservoir naar het andere. Plaats de schaal vervolgens 12 uur in de incubator om celherstel mogelijk te maken.

In de volgende stap bereidt u een deksel voor om de schaal te bedekken door twee gaten te boren, één gepositioneerd boven elk reservoir van de migratiekamer. Vervang vervolgens het medium in de kamer met gekweekt medium dat 25 millimeter hippies-buffer bevat. Breng vervolgens de schaal over naar het temperatuurgestuurde beeldvormingssysteem.

Stel de experimentele parameters in voor time-lapse en multi-positie opname. Richt de kamer zo uit dat de kathode en anode respectievelijk links en rechts staan, zodat het elektrische veldvector horizontaal loopt zoals gezien onder de microscoop en geregistreerd in het beeldvormingssysteem. Vul vervolgens twee bekers.

Met Steinberg's oplossing. Verbind een afzonderlijke beker met elk mediumreservoir met behulp van de vooraf bereide glazen bruggen gevuld met 2% Steinberg's agaroplossing. Plaats vervolgens de zilveren elektroden verbonden met een DC-voeding in de Steinberg-oplossing.

Stel in elke beker de spanningsregelaar op de voeding op nul en zet hem aan. Meet de spanning over de elektrotactische kamer met een voltmeter terwijl u de spanningsregelaar omhoog draait. Pas vervolgens de spanning aan om aan de experimentele vereisten te voldoen.

Start vervol