Name: Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer de afleiding van gliale beperkte voorlopers uit E13 muizenruggenmergen met immuno-panning en selectieve media. Deze methode biedt een betrouwbaar protocol voor onderzoek naar oligodendrocytenontwikkeling en transplantatietoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr Devin Gary bedanken voor zijn inzicht en feedback over het gebruik van GRP cellen.

Introductie In dit protocol laten we zien hoe te winnen, te selecteren en de plaat gliale beperkte precursor (GRP) cellen van het ruggenmerg van de E13 muis foetussen. Deze cellen zijn vroege voorlopers binnen de oligodendrocytic en astrocytaire cellijnen en wordt bepaald door hun uitdrukking van A2B5. In het GRP medium aangevuld met FGF-2, zal de A2B5 + GRP's beginnen de uiting van de vroege oligodendrocytic lijn markers PDGFαR en NG2 1,2. Deze oligodendroglia lijn cellen langs een reeks afzonderlijke fenotypische fasen, elk gekenmerkt door morfologie, en expressie van markers specifieke ontwikkelingsstadia. Deze voorloper cellen worden momenteel bestudeerd als een potentiële bron voor cel-gebaseerde therapeutische benaderingen in aandoeningen van het centrale zenuwstelsel witte stof, met inbegrip van multiple sclerose, leukodystrophies en periventriculaire leukomalacie (PVL) 3,4,5,6 6,7,8,9. Deze gliale voorloper cellen zijn ook gebruikt in studies van andere wittestofziekte modellen zoals ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose 10,11,12,13. Ons laboratorium heeft een vroege postnatale hypoxie-ischemie muismodel waarmee we het evalueren van de werkzaamheid van deze ruggenmerg afgeleid GRP cellen als een restauratieve aanpak in PVL, de belangrijkste oorzaak van hersenverlamming 14,15,16. Er is ook een knaagdier hersenen afgeleide OPC model dat op grote schaal gebruikt voor het bestuderen witte stof schade omdat de polyester cellen neiging om te differentiëren in de astrocytic route 17. De OPC-fenotype is al ging de oligodendrocyt lijn weg, een fenomeen dat lijkt irreversible. We zijn echter geïnteresseerd zijn in de beoordeling van de respons van een breder spectrum van oligodendrocyt voorlopercellen ook GRP's en misschien zelfs de NEP's afgeleid op E10.5. Om deze reden hebben we aangenomen het ruggenmerg afgeleid GRP-model voor ons werk. Naast het gebruik van GRP voor celvervanging de afleiding van deze cellen van wildtype en transgene diermodellen van ziekte kan witte stof nader onderzoek naar gliacellen differentiatie onder normale en aandoeningen in een in vitro omgeving. Vorige publicaties aantonen van selectieve kwetsbaarheid van oligodendrocytic lijn voorloper cellen aan verschillende externe stressoren, zoals rijping afhankelijk van glutamaat excitotoxiciteit, oxidatieve stress, en selecteer factoren betrokken in ontstekingsprocessen 18,19. Onze studies hebben zich gericht op het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen achter de ontwikkeling van deze witte stof letsels, het evalueren van de gevoeligheid van cellen inde oligodendrocyt afstamming spectrum zo goed beledigen als het analyseren van vermeende therapeutische benaderingen. Materialen Alle procedures met betrekking tot dieren voldoen aan PHS beleid en de JHU IACUC. Alle procedures worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap om aseptische omstandigheden. Gewoonlijk secties worden uitgevoerd in een horizontale stroming kap en in vitro onderzoek in een verticale kap. Alle media dat koud wordt gebruikt tijdens de dissecties. De muizen die in deze studie zijn wildtype CD-1-stam en transgene GFP in een C57/BL6 achtergrond. Een CD-1 muis dam levert meestal 10 + foetussen die voldoende zijn om zaad 1-2 T25 flessen. Meestal worden twee dammen opgeofferd op een moment en foetale ruggenmerg samengevoegd en uitgeplaat in een T25 fles per dam. Wanneer cellen afgeleid kunnen worden uitgebreid en kenmerk vitro voor verdere studies. 1. Voorbereiding van de media en Kolven <ul type="disc"><li> GRP voorraadmedium wordt gebruikt als Dissection medium: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) N2 (100x, Invitrogen) en aanvullingen Bovine Serum Albumine (BSA, 0,5% w / v). </li><li> Dissociatie medium: hetzelfde als dissectie medium. </li><li> Cultuur medium: GRP voorraad medium + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) en heparine (1 pg / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminine gecoat 75 cm 2 of 25 cm 2 flessen (T75 of T25). </li><li> Weefselkweekflessen (75 cm2, Falcon) werden gecoat met 15-20μg/ml Poly-L-lysine (PLL, Sigma) in gedestilleerd H2O, geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur dan afgezogen. Flessen worden gewassen met PBS 1X vervolgens bekleed met 15-20 pg / ml laminine (Sigma) in PBS bij 37 ° C gedurende 1 uur, vervolgens afgezogen en verse PBS of media toegevoegd totdat cellen bereid worden uitgeplaat. Na coating moet kolven nooit drogen, maar kan worden gehouden in PBS of media bij 4 ° C voor korte perioden voor gebruik. </li></ul> 2. Instrumenten en Other Materiaal <ul type="disc"><li> Petrischalen: 4 per dam: 3 petrischalen voor dissectie (75 mm), een 20 mm schaal voor het verzamelen van de geoogste ruggenmerg. </li><li> Grote schaar (43 mm Operating schaar, Roboz) en weefsel tang voor het openen van de dam s buik. </li><li> Kleine schaar voor het ontleden van de baarmoeder en het verwijderen van de foetussen (15 mm Micro ontleden van Schaar, Roboz). </li><li> Micro ontleden van de lente schaar (6 mm) aan het ruggenmerg van de foetussen te ontleden. </li><li> Micro ontleden gebogen tang voor het verankeren van de dam en foetale lichaam tijdens de operatie en later verwijderen van het ruggenmerg een keer blootgesteld. </li><li> 40 of 70 micrometer cel zeef voor het verwijderen van celresten voor plating. </li><li> 0,05% Trypsine voorverwarmd tot 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml DNase 1 (Sigma), bereid zoals 100x voorraad (1 g / ml). </li><li> Bio-hazard tas voor dode dieren. </li><li> 15 en 50 ml centrifugebuizen voor de verwerking van gewonnen ruggenmerg. </li></ul> 3. Het bepalen van Timed Pregnancy Zwangere muis dammen zijn ofwel besteld uit commerciële bronnen met vermelding van levering op embryonale dag E12 of E13 van de ontwikkeling van de foetus of de zwangerschap bepaald in huis. In het kort worden twee vrouwtjes geplaatst samen met een man in de late namiddag en liet 's nachts samen. De volgende dag vrouwtjes waargenomen in aanwezigheid van vaginaal gelegen slijmprop. De slijmprop is slechts een indicatie dat de paring zich zo dieren vervolgens worden gewogen dagelijks aan snelheid van gewichtstoename te controleren. De dag dat de slijmprop wordt waargenomen wordt gedefinieerd als embryonale dag een (E1). 4. Tissue Afleiding <ol><li> Werken onder een horizontale stroming kap om aseptische omstandigheden te behouden. </li><li> Spuit het kap-en werkgebied met 70% ethanol. </li><li> Autoclaaf instrumenten of spray royaal met 70% ethanol. </li><li> Bereid instrumenten, media, en microscoop voor gebruik. </li><li> Breng 20 ml koud dissectie medium in steriele Petri dish. </li><li> Verdoven dier met chloorhydraat (500 mg / kg) intraperitoneaal toegediend (IP), gevolgd door cervicale dislocatie en onthoofd. </li><li> Spuit de buikstreek van de dam met 70-90% ethanol (desinfectie) </li><li> Open buik met grote schaar en tang. <ol type="a"><li> In CD1 en C57/BL6 stammen: Meestal 8 tot 14 foetussen zal zijn in de baarmoeder. Het aantal foetussen is stam afhankelijk. </li></ol></li><li> Pak de muis baarmoeder met inbegrip van de pups en doe dit in vers, koud dissectie medium in een schone petrischaal met bloed en weefsel puin te wassen van de foetus. </li><li> Uittreksel elke foetus uit de baarmoeder hoorn en scheiden ze van de embryonale zak en de placenta met de kleine schaar. Breng de gewonnen foetussen in verse dissectie medium in een nieuw petrischaal. <ol type="a"><li> Dissection medium moet bij lage temperatuur van de metabole activiteit te verlagen en het behoud van leefbaarheid van afgeleide cellen. </li><li> Werk van nu af aan met twee tangen enmicro ontleden van de lente-schaar. </li></ol></li><li> Werken onder dissectie microscoop, knip de huid langs het ruggenmerg met de micro-chirurgische schaar en pel de huid terug naar het ruggenmerg bloot te leggen. </li><li> Doorsnijden het ruggenmerg de microchirurgische schaar ongeveer C1 en het begin van de staart. </li><li> Verwijder het ruggenmerg met stompe tang, moeten alle bot en kraakbeen worden verwijderd en over te brengen naar 3 e petrischaal van ontleden medium. </li><li> Om overmatige groei van meningeale weefsel in de daaropvolgende celculturen te voorkomen proberen om zoveel mogelijk van de hersenvliezen als mogelijk te verwijderen van het ruggenmerg. Als gevolg van de opkomende uitstekende perifere zenuwen is dit moeilijker dan het verwijderen van meningeale weefsel uit gehaald hersenen. </li><li> Zodra hersenvliezen zijn verwijderd, over te dragen ruggenmerg tot 20 mm petrischaal </li><li> Opruimen door grondig spuiten met 70-90% ethanol. </li><li> De volgende stappen voor dissociatie snel worden uitgevoerd handhavenhoge levensvatbaarheid van de afgeleide ruggenmergweefsel. </li></ol> 5. Cultuur Oprichting <ol><li> Trypsine worden voorverwarmd ten minste 30 minuten in een 37 ° CH2 O-bad. Een passende hoeveelheid moet worden verwijderd uit de bouillon aan de blootstelling van voorraad om temperatuurschommelingen te verminderen. </li><li> Breng de geoogste ruggenmerg een 50 ml centrifugebuis met 10 ml voorverwarmde trypsine (0,05% kwaliteit Biologicals) en 100 ul DNAse (10 mg / ml) en vermalen kort. </li><li> Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. </li><li> Vermaal en incubeer gedurende nog eens 10 minuten. </li><li> 5 ml GRP medium (hierboven beschreven) en gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1000 rpm. </li><li> Zuig supernatant en pellet hersuspenderen met 10 ml medium polyester en voeg DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incubeer in 37 ° CH 2 O-bad gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer 5 min bij 1000 rpm en zuig supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met een frequentiesh GRP medium dan filter vuil met een 40 - 70 pm cel zeef. </li><li> Plaat PLL / laminine bekleed 25 cm2 flessen (T25) en incuberen bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. </li><li> 100% media te wijzigen op de volgende dag. </li><li> Op dit moment hebben GRP's bevestigd en begon uitbreiding van processen. </li></ol> 6. Immunopanning de GRP Bevolking <ol><li> Plaat ruggenmerg weefsel in PLL / laminine gecoat kolven totdat fles is 85-90% samenvloeiing of ongeveer een week. </li><li> Oogst cellen schrapen kolf met een rubberen spatel of 0,05% trypsine, grondig vermalen maar voorzichtig gecentrifugeerd op 1000 rpm gedurende 5 minuten en grondig Resuspendeer met 3 ml GRP medium. </li><li> Breng 1 ml per m 3 T25 flessen of 3 ml tot 1 T75 fles toe te voegen voldoende hoeveelheden van medium volledig te bedekken cellen en flacons tot 80-90% confluentie bereiken mogelijk te maken. </li><li> Wijzig de media om de andere dag, eerder als medium put snel. </li><li> Coat Bacteriologische Petri schotels (75 mm) gedurende een nacht bij 4 ° C met een anti-muis IgM antilichaam (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Zuig de overtollige buffer en was de petrischalen 3x met PBS. </li><li> Voeg A2B5 antilichaam (Millipore) bij een concentratie van 5 pg / ml verdund in PBS en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Was de plaatjes weer 3x met PBS en voeg dan 8 ml GRP medium om uitdroging te voorkomen van de plaat. </li><li> 5 ml van polyester medium uit Petrischalen oogst GRP cellen schrapen flessen met een rubberen spatel alle cellen los </li><li> Kort Vermaal celsuspensie te breken klonten en 5 ml celsuspensie over te dragen aan de A2B5 gecoate bacteriologische petrischalen. </li><li> Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur zonder schudden. </li><li> Na 1 uur aspiraat media en wassen platen 8x met PBS. </li><li> Voorzichtig schrapen cellen met een rubberen spatel in 2 ml GRP media dan naar PLL / laminine gecoate platen of flesjes over te dragen met de juiste volume van GRP medium. </li> 7. Invriezen en opslag van afgeleide cellen <ol><li> Cellen worden geoogst van een 85-90% samenvloeiing T25 of T75 kolf met 2 ml 0,05% trypsine. </li><li> Trypsine verdund en onwerkzaam 8 ml polyester stock medium en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Pellets van T25 flessen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml medium polyester invriezen (GRP stock medium aangevuld met 10% (v / v) DMSO en eventueel, 20% FBS). De grotere pellets van T75 kolven worden verdund tweeledig. </li><li> Celsuspensies van 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 cellen overgebracht naar cryogene flacons (Nalgene) en nacht in een cryogene container (Nalgene) met isopropanol bij -80 ° C langzaam invriezen nacht. </li><li> Na overnacht invriezen cellen overgebracht naar vriezer dozen bewaard 6 maanden 1 jaar bij -80 ° C of langere tijd in N (l). Ontdooide cellen typisch 60-80% haalbaar grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de PLL / laminine coating. </li></ol> 8. Representatieve resultaten CO 2 niet wordt gebruikt verlamming het dier wegens de mogelijke invloed waren op de levensvatbaarheid van de foetussen en uiteindelijk de afgeleide cellen. Bovendien zal het erg moeilijk zijn om volledig de meningen van het ruggenmerg te verwijderen tijdens de afleiding procedure, maar de combinatie van GRP medium en immunopanning een einde zal maken van deze snel groeiende cellen. Evenzo wordt de gehele ruggenmerg geoogst ondanks een hogere concentratie van de ventrale GRP populatie als gevolg van de uit de ventrale ruggenmerg migreren dorsaal 20. Echter, de GRP medium kiest voor de GRP fenotype en dat de bevolking wordt gemaximaliseerd door A2B5 immunopanning. Na plateren ruggenmergweefsel, worden de in vitro kweken geïncubeerd twee passages of een week. Na 2 dagen kweken kan cellen van verschillende morfologie worden waargenomen in de weefselkweekflessen waarin de heterodoorgaand identieke optiek de bevolking, maar de GRP medium kiest voor de GRP fenotype. Deze cellen zijn een combinatie van A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronale beperkte precursoren (NHP) en Nestin +, A2B5-neuro-epitheliale cellen en mogelijk fibronectine + meningeale cellen. Daarnaast is meer volwassen fenotypen aanwezig kunnen zijn uitdrukken markers waaronder doublecortin en Tuj1 voor neuronale afkomst, GFAP voor astrocyten en PDGFaR en GalC voor oligo lijn Met het oog op een zeer GRP verrijkt bevolking te maximaliseren van de start heterogene pool (Figuur 1A), kunnen cellen zijn dubbel immunopanned te selecteren en te verwijderen van de E-NCAM + cellen, gevolgd door de selectie voor de A2B5 + GRP bevolking een keer celdichtheid is toegenomen tot ongeveer 85-90% confluentie in T75 flessen. Deze polyester cellen behouden hun vermogen om astrocyten worden ondanks dat in een medium dat selecteert de oligodendrocyte fenotype zodat na A2B5 immunopanning nodig zijn om een ​​hoog verrijkt polyester populatie te houden. Immunopanning algebondgenoot rendementen tot 95% A2B5 + cellen, maar voor een nog grotere opbrengst A2B5 geconjugeerde magnetische korrels (Miltenyi Biotec Inc) kan gebruikt worden om een ​​maximaal rendement van 97% voorzien worden. Waakzaamheid in het onderhoud GRP culturen zoals reguliere media veranderingen zullen het minimaliseren van de verspreiding van niet-GRP celtypen. Ook bij afwezigheid van BMP-4 astrocyten kunnen nog gevonden en uitgeput media in het bijzonder blijkt induceren een astrocytic fenotype. Hoewel B27 supplement bevat tri-jodothyronine hormoon (T3), is er geen waargenomen neiging om te differentiëren tot oligodendrocyten in de polyester populatie, alleen wanneer hogere T3 worden toegevoegd aan het medium betekent dit verschijnsel optreedt. Echter, een T3 gratis B27 supplement worden vervangen als er een punt van zorg voor de besmetting met volwassen oligodendrocyten (Figuur 1B). Deze GRP cellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door hun morfologie van kleine soma met 2 of 3 korte processen, maar om te screenen op andere celtypen die aanwezig kunnen zijn, immunocytochemistry kan worden uitgevoerd voor de eerder genoemde gemeenschappelijke ontwikkelings-en celtype specifieke markers. Er zal vaak een kleine duurzame populatie van A2B5-cellen die neuroepitheliale (NEP), die geschikt worden ofwel GRP of NHP. Gelukkig zijn de langere cellen gehandhaafd in de GRP medium hoe groter de kans dat medium kiest voor de GRP fenotype. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1."> Figuur 1. A) vernikkeld ruggenmergcellen heterogene morfologie worden waargenomen na 2 dagen kweek. B) Immunopanning zeer GRP verrijkte populatie maximale vanaf de start heterogene pool. </ol>

<ol><li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Research+Foundation+workshop%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li>
<li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li>
<li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitors+survive%2C+proliferate%2C+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li>
<li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li>
<li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li>
<li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li>
<li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li>
<li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li>
<li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+glia+biology%22%5BJournal%5D)">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li>
<li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li>
<li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+cerebral+palsy%3A+which+ones+are+best%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+child+neurology%22%5BJournal%5D)">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability%2C+injury+distribution%2C+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+neurology%22%5BJournal%5D)">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li>
<li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+A2B5%2B+glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li>
<li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li>
<li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li>
<li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li>
<li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-permeable+AMPA%2Fkainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li>
<li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+white+matter%3A+clinical+and+pathophysiological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Mental+retardation+and+developmental+disabilities+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li>
<li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripotential+glial-restricted+precursor+%28GRP%29+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord%3A+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li>
<li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li>
<li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li>
<li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li>
<li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li>
</ol>

Deze studie werd gefinancierd door het National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), en R01NS028208 (MVJ)] en de Kinderneurologie Foundation. De inhoud van dit rapport zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Health, DHHS. De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen die relevant zijn voor deze studie.

<p class="jove_content"&gt; Aandoeningen van het centrale zenuwstelsel witte stof omvatten een groot aantal van de etiologie, waaronder genetische, opruiend, ischemische en toxische oorzaken<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Terwijl multiple sclerose en vasculopathies zijn de belangrijkste oorzaak van de witte stof ziekte bij volwassenen, periventriculaire leukomalacie geassocieerd met prematuriteit is de meest voorkomende oorzaak van witte stof schade in de kindertijd bevolking. Om verder af te bakenen ziektemechanismen verdere studie van cellen ofoligodendrocytic afkomst, die sterk worden beïnvloed door de perinatale belediging, is vereist. GRP&#39;s werden geïsoleerd uit het knaagdier embryonale ruggenmerg en aangetoond dat ze tripotential in de natuur, die aanleiding geven tot oligodendrocyten en astrocyten twee verschillende populaties, maar niet differentiëren tot neuronen<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Ook hebben oligodendrocyt precursor cellen (OPC), afkomstig van ratten optische zenuw en de late embryonale of vroege postnatale hersenen van de rat is aangetoond dat in het functionerend oligodendrocyten rijpen in de juiste media voorwaarden<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Daarnaast hebben foetaal of volwassen humaan OPC is verder gemanipuleerd in meer volwassen oligodendrocyt fenotypes<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GRP cellen zijn geïsoleerd van zowel het ruggenmerg van E13.5 ratten en E12-13.5 bij muizen. Bij de rat verschillen werden gemeld tussen rug-en buik-afgeleide GRP cellen in hun reactie op de voorwaarden die generatie van oligodendrocyten, astrocyten of te bevorderen, met ventrale afgeleide GRP&#39;s vertonen een grotere neiging om te differentiëren in de meer volwassen fenotypes<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Dit kan te wijten zijn aan de dorsale ventraal migratie van de ontluikende GRP cellen, waardoor minder gevoelig voor de differentiatie signalen. Immunopanning zorgt voor de subpopulatie die A2B5 tot uitdrukking te worden geïsoleerd en verzameld voor het onderhoud in de cultuur.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Onze muis GRP culturen worden afgeleid uit de totale ruggenmerg weefsel dat een heterogene, gepoolde populatie van cellen waaruit GRP cellen worden geselecteerd door chemische (medium) en antilichamen gebaseerde technieken oplevert. Terwijl onze studies hebben gebruik gemaakt van de ruggenmerg afgeleid muis GRP-cellen, is het meer recent is gemeld aan de afleiding van hersenen afgeleide muis oligodendrocyt stamcellen die ook in staat zijn om uit te groeien tot volwassen oligodendrocyten<sup&gt; 31</sup&gt;. Hier worden de afgeleide cellen worden in eerste instantie gekweekt als oligospheres dat het gebruik van de juiste kweekmedium worden gemanipuleerd in een verrijkte PDGFαR +, OPC bevolking<sup&gt; 31</sup&gt;. Onze studies hebben zich gericht op het effect van ons model van hypoxische-ischemische belediging op cellen in de oligodendrocyt lijn spectrum van A2B5 +, PDGFαR-GRP voorlopers van de myeline basis eiwit te drukken (MBP +) volwassen oligodendrocyten. Inderdaad onze<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering heeft aangetoond dat deze onvolwassen GRP uitrijping in MBP tot expressie brengen, hetzij in monoculturen of in co-culturen met corticale neuronen. Deze cellen kunnen worden gemanipuleerd in cultuur in specifieke differentiatie signaalwegen voor het bestuderen van de mechanismen die betrokken zijn bij perinatale witte stof letsel. Er zijn verschillende muismodellen van witte stof ziekten waarbij cellen van oligodendrocyt afstamming en de beschikbaarheid van deze populatie zorgt voor diepgaand onderzoek naar de mechanismen die zowel de schade als het nut van de mogelijke celtherapie opties te verkennen veroorzaken.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-basic </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsine (0,05%) EDTA </td><td> Kwaliteit Biologische, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020-1 mg </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

afleiding van gliale beperkte voorlopers van de e13 muizen

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Dit is een protocol voor de afleiding van gliale beperkte precursor (GRP) cellen van het ruggenmerg van de E13 muis foetussen. Deze cellen zijn vroege voorlopers binnen de oligodendrocytic cellijn. Onlangs zijn deze cellen onderzocht als mogelijke bron voor het herstelrecht therapieën in de witte stof ziekten. Periventriculaire leukomalacie (PVL) is de belangrijkste oorzaak van niet-genetische wittestofziekte in de kindertijd en treft tot 50% van extreem premature baby&#39;s. De gegevens wijzen op een verhoogde gevoeligheid van de zich ontwikkelende hersenen aan hypoxie-ischemie, oxidatieve stress en excitotoxiciteit dat zich selectief richt op ontluikende witte stof. Gliale beperkte precursoren (GRP), oligodendrocyt progenitorcellen (OPC) en onvolwassen oligodendrocyten (preOL) lijken de belangrijkste spelers in de ontwikkeling van PVL en zijn het onderwerp van verder onderzoek. Bovendien hebben eerdere studies geïdentificeerd een subset van CZS weefsel dat is toegenomen gevoeligheid voor excitotoxiciteit glutamaat alsen een ontwikkelingspatroon van deze gevoeligheid. Ons laboratorium onderzoekt momenteel de rol van de oligodendrocyt voorlopercellen in PVL en gebruik cellen in het GRP stadium van ontwikkeling. Wij maken gebruik van deze afgeleid GRP cellen in verschillende experimentele paradigma&#39;s om hun reactie op de spanningen in overeenstemming met PVL te selecteren testen. GRP-cellen kunnen worden gemanipuleerd in vitro in OPC&#39;s en preOL voor transplantatie-experimenten met de muis PVL modellen en in vitro modellen van het PVL-achtige beledigingen waaronder hypoxie-ischemie. Door gekweekte cellen en in vitro studies zou worden verminderd variabiliteit experimenten interpretatie van de gegevens vergemakkelijkt. Gekweekte cellen kan ook verrijking van de polyester populatie met een minimaal effect van contaminerende cellen van niet-polyester fenotype.

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Dit is een protocol voor de afleiding van glia-beperkte precursorcellen (GRP-cellen) uit het ruggenmerg van muisfoetussen in stadium E13. Deze cellen zijn vroege precursors...

Het algemene doel van deze procedure is om glia-beperkte precursors of GRP-cellen te verkrijgen uit foetale ruggenmergen. Dit wordt bereikt door de ruggenmergen uit E 13-foetussen te extraheren en deze over te brengen naar kweekplaten met GRP-selectieve media. Vervolgens wordt immuno-panning gebruikt om de GRP-populatie te verrijken en de niet-GRP-lijn te elimineren.De gezuiverde GRP-cellen kunnen worden ingevroren en voor langdurige opslag worden bewaard. De gezuiverde GRP-cellen kunnen worden ontdooid en worden gebruikt voor toekomstige experimenten, zoals het aantonen van de migratie van getransplanteerde GRP-cellen door een passage ter breedte van één enkele cel. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de chirurgische stappen moeilijk aan te leren kunnen zijn, vooral voor een onervaren oog.Vandaag zullen Roche De Silva en Joel Marx dit demonstreren. Zij zijn studenten in ons laboratorium. Verkrijg drachtige muizenmoeders op embryonale dag E 12 of E 13 van de foetale ontwikkeling via een commerciële leverancier of bereid deze in-house voor. Dag E 1 wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van een vaginaal slijmplugje.De dag nadat een gedraagde vrouwelijke muis bij een mannetje is geplaatst, worden alle instrumenten en de weefselkweekkap gedesinfecteerd. Bereid een schone Petrischaal voor met 20 milliliters koud dissectiemedium. Bereid vervolgens de muis voor met een anesthetiserende injectie van chloralhydraat.Zodra de muis geen pijnreflex meer vertoont, bijvoorbeeld bij een kneep in de teen, wordt het dier geëuthanaseerd via cervicale dislocatie of decapitatie. Wij geven de voorkeur aan het niet gebruiken van CO2 voor de anesthesie van het dier vanwege het mogelijke effect op de levensvatbaarheid van de foetussen en uiteindelijk de afgeleide cellen. Na het desinfecteren van de abdominale regio wordt de buik geopend met een grote schaar en pincet om de uterus te verwijderen. Afhankelijk van de stam bevat de uterus acht tot 14 foetussen.Plaats de uterus in een schone Petrischaal met vers koud dissectiemedium om de foetussen te isoleren. Was eerst het bloed en overtollig weefsel weg. Haal vervolgens elke foetus uit de uterushoorn en scheid ze van de embryonale vlieszak en de placenta.Breng de foetussen met een klein schaartje over naar een schaal met vers, koel dissectiemedium. Het koele medium verlaagt de metabole activiteit en behoudt de levensvatbaarheid van de afgeleide cellen. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een pincet en veerscharen om de huid langs het ruggenmerg open te knippen, pel deze terug en leg het ruggenmerg bloot.Dвіde het ruggenmerg door rond C1 en aan het begin van de staart. Verwijder vervolgens voorzichtig het ruggenmerg samen met al het bot- en kraakbeentransplantat en verzamel elk geprepareerd ruggenmerg in een petrischaal. Met vers dissectiemedium oogsten we het gehele ruggenmerg, ondanks dat er een grotere populatie GRP-cellen aanwezig is.Uiteindelijk selecteert het GRP-medium echter op het GRP-fenotype en die populatie wordt verder gemaximaliseerd door H two B five immuno om overgroei van meningeaal weefsel te voorkomen. Verwijder bij opeenvolgende celculturen zoveel mogelijk van de hersenvliezen uit het ruggenmerg vanwege de beginnende uitstulpende perifere zenuwen. Dit is moeilijker dan het verwijderen van meningeaal weefsel uit geëxtraheerd hersenweefsel.Zodra er zoveel mogelijk van de hersenvliezen is verwijderd, worden de ruggenmergen overgebracht naar een Petri-schaal van 20 millimeter en wordt overgegaan tot dissociatie van de cellen in preparatie. Verwarm een aliquot trypsine gedurende ten minste een half uur voor in een waterbad van 37 graden Celsius.De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van het verkregen ruggenmergweefsel te vergroten. Breng de ruggenmergen over naar een centrifugebuis van 50 milliliter die trypsine en DNAs bevat. Tritureer vervolgens het mengsel kort met een pipetteur.Incubeer het mengsel 10 minuten bij 37 °C. Roer het opnieuw en zet de incubatie vervolgens nog 10 minuten voort. Voeg daarna 5 mL GRP-medium toe en centrifugeer gedurende vijf minuten.Aspireer het supernatant bij 1000 RPM en resuspendeer. Suspendeer het pellet in 10 milliliters GRP-medium met DNAs one. Incubeer vervolgens nog 10 minuten en pellet de cellen bij 1000 RPM gedurende vijf minuten.S吸ireer het supernatant af en resuspendeer het pellet in vers GRP-medium. Leid de cellen door een celzeef van 40 tot 70 micron en zaai ze uit in T 25-flesjes die zijn gecoat met PLL-laminine.Incubeer de cellen en vervang de volgende dag 100% van het medium, en daarna om de dag of vaker indien de nutriënten uitgeput raken. Op dit punt hebben de GRP's zich gehecht en zijn ze begonnen met het uitsteken van processen; deze kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van immunopanning. Laat de cellen doorgroeien totdat ze 85 tot 90% confluent zijn of er een week is verstreken.Oogst vervolgens de cellen met een rubberen politieagent of trypsine. Resuspendeer de cellen in vers medium en breid ze uit in drie T 25-kolfjes, waarbij het medium minstens elke 48 uur wordt ververst. Wanneer de kolfjes confluent zijn, oogst je ze zoals eerder beschreven in vijf milliliter GRP-medium. Tritureer de celsuspensie om klonters te verbreken en breng ze over naar een 2B5-gecoat bacteriologisch kolfje.Incubeer de cellen in de petrischalen op de A twee B platen gedurende één uur bij kamertemperatuur zonder te schudden. Aspireer vervolgens het medium en was de platen vier tot acht keer met PBS om een hoge strengentie te behouden voor aspecifieke binding van cellen aan de plaat. Gebruik hiervoor een rubberen policeman.Verzamel de gewassen cellen in twee milliliters GRP-medium en breng de suspensie vervolgens over naar PLL-laminegecoate platen of kolfjes met GRP-medium. Zodra de cellen een confluentie van 85 tot 90% hebben bereikt, oogst deze met trypsinisering, verdun en inactiveer vervolgens het trypsine met acht milliliters GRP-voorraadmedium, en verzamel de cellen als een pellet. Resuspendeer het celvolume uit een T 25-kolfje in één milliliter GRP-vriesmedium of cellen uit een T 75-kolfje in twee milliliters GRP-vriesmedium.Pas indien nodig de concentratie van de celsuspensie aan en breng de cellen over naar cryovials. Vries de cellen de volgende dag langzaam overnacht invriezen in een cryocontainer met isopropanol bij -80 °C. Breng de cellen over naar langetermijnopslag. De cellen zullen na ontdooiing zes maanden tot een jaar later nog voor 60 tot 80% levensvatbaar zijn.De levensvatbaarheid is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de PLL-laminine-coating. Na twee dagen in cultuur werd waargenomen dat geplaatste ruggenmergcellen met verschillende morfologieën maximaal verrijkt waren. De GRP-populatiecellen zijn immuun pan om te selecteren voor de A2B5-populatie.Indien er sprake is van contaminatie door neuro-epitheelcellen, kan dubbele immunopanning worden toegepast om eerst de NCA-positieve populatie te elimineren, gevolgd door A2B5-selectie. Een T3-vrije B27-supplement werd toegevoegd om de contaminatie van mature oligodendrocyten te verminderen. Gezuiverde GRP-cellen waren herkenbaar aan hun kleine soma en twee of drie korte uitlopers.Vaak was er ook een kleine, persistente populatie A twee B vijf negatieve cellen die neuro-epitheliaal waren en in staat waren om zich te ontwikkelen tot GRP of N rp. Gelukkig was de kans dat ze het GRP-fenotype aannamen groter naarmate de cellen langer op GRP-medium werden gehouden. De basistechnieken van deze procedure kunnen worden gebruikt om andere celtypen af te leiden, waarmee aanvullende vragen kunnen worden beantwoord, zoals welke cel beter geschikt is voor celvervangende therapie ofwel of uit de cortex afgeleide neuronen goede modellen kunnen zijn voor in vitro myelinisatie.

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.

Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Hier beschrijven we de isolatie van darmen-gliale cellen uit de intestinale submucosa-sequentiële EDTA incubations met divalente kationen en vervolgens incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de niet-enzymatische cel chelaat. De resulterende celsuspensie op poly-D-lysine en laminin plating resulteert in een sterk verrijkt cultuur van submucosal gliacellen voor functionele analyse.

Isolatie van darmen gliale cellen uit de Submucosa en de Lamina Propria van de volwassen muis

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer de afleiding van gliale beperkte voorlopers uit E13 muizenruggenmergen met immuno-panning en selectieve media. Deze methode biedt een betrouwbaar protocol voor onderzoek naar oligodendrocytenontwikkeling en transplantatietoepassingen.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Meer video's verkennen