Presynaptische Dopamine Dynamiek in het striatum Brain Plakjes met Fast-scan cyclische voltammetrie

Het algemene doel van deze procedure is het illustreren van een algemeen protocol voor slice fast scan cyclic V Telemetrie. Dit wordt bereikt door eerst het hersenweefsel voor te bereiden op coronale doorsnijding. Vervolgens worden elektroden geplaatst in het specifieke hersengebied van interesse.

De volgende stap is het aanbrengen van een spanning in de vorm van een driehoeksgolf via de elektrode om dopamine te detecteren. Ten slotte wordt een farmaceutisch middel van belang toegepast op de hersensectie en wordt het effect hiervan op de presynaptische dopaminedynamiek waargenomen. Uiteindelijk toont dit protocol veranderingen in de presynaptische dopaminedynamiek aan, zoals gestimuleerde dopamineafgifte en dopamine-opnamesnelheden via fast scan cyclic voltammetrie.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in presynaptische dopamine-dynamiek, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, inclusief andere dieren en neurotransmitters, zoals ratten en fruitvliegen, en respectievelijk serotonine en norepinefrine. De procedure zal worden gedemonstreerd door Francis Mena, MEA Khalid en Erin oo, promovendi uit mijn laboratorium. Om deze procedure te starten, bereidt u conform het bijbehorende manuscript drie typen kunstmatige cerebrospinale vloeistofoplossingen: sucrose-ACSF, ACSF-oplossing voor voltammetrische registraties en gemodificeerde ACSF-oplossing voor electrodekalibratie. Breng vervolgens 10 milliliters sucrose-ACSF over in een klein bekerglas en plaats dit in een ijsbad. Plaats daarna de instant Loctite-lijm in een ijsbad.

Bereid daarna een scheermesje en de benodigde dissectie-instrumenten voor, zoals een pincet, spatel en schaar, door deze af te vegen met een alcoholdoekje. Offer vervolgens een muis door onthoofding en verwijder snel de hersenen. Plaats de hersenen gedurende ongeveer 10 minuten in een bekerglas met ijskoud sucrose, A CSF.

Bereid ondertussen de VIBRAM voor op het snijden. Plaats wat geplette ijs in het monsterbad. Plaats vervolgens de monsterkamer in de Vibram en zet deze stevig vast.

Voeg meer ijs rond de monsterkamer toe om de openingen op te vullen en zorg ervoor dat er geen ijs in de kamer terechtkomt. Plaats vervolgens een schoon scheermesje in de meshouder. Vul daarna de monsterkamer met ijskoud sucrose A CSF.

Giet vervolgens wat koude sucrose A CSF op een stuk papieren handdoek in een omgekeerde Petrischaal. Breng de vers gedissecteerde muizenhersenen hierop over met een pincet. Verwijder vervolgens het cerebellum door langs de mediaal-laterale as te snijden met een scheermesje.

Dit creëert een vlakke basis die op de vibram-tafel kan worden bevestigd. Voeg vervolgens een druppel Loctite-lijm toe op de monstertafel. Bevestig het vlakke uiteinde van het geprepareerde brein onmiddellijk op de tafel en houd het zo rechtop mogelijk.

Plaats vervolgens de tafel in de monsterkamer en draai de schroef vast. Zorg ervoor dat de hersenen volledig zijn ondergedompeld in de sucrose A CSF in de kamer. Stel daarna de tafel met de bediening zo in dat het scheermesje uitlijnt met de bovenzijde van de hersenen.

Optimale parameters voor de vibrator worden verkregen door de frequentie en snelheid op laag in te stellen. Stel vervolgens de snijdikte in op 400 micrometers. De eerste paar coupes bevatten meestal geen striatum.

Herhaal het snijden totdat de coupes die het striatum bevatten zijn verkregen. Zodra de stri AAL-regio is bereikt, gebruik dan een penseel om de coupe op te tillen en deze in een bekerglas met geoxygeneerde CSF op kamertemperatuur te plaatsen.

Gewoonlijk kunnen er drie tot vier coupes worden verkregen die het thalame complex bevatten, waaronder het caudatus putamen en de nucleus accumbens. Laat de coupes minstens een uur acclimatiseren in A CSF onder een gasstroom van 95% O2 5% CO2 bij kamertemperatuur voordat het experiment wordt voortgezet. Sluit ter begin van deze procedure de slang aan op de onderdompelingsregistratiekamer.

Pomp vervolgens de zuurstofrijke A CSF op kamertemperatuur met een snelheid van 1 ml per minuut. Stel de temperatuurregelaar in op 32 °C zodra de A CSF de op maat gemaakte slice-houder heeft gevuld. Verwijder eventuele luchtbellen onder het gaas met een injectiespuit.

Creëer met een spuit negatieve druk in de uitstroomslang om de doorstroming te starten en de bufferoverloop te beheersen. Plaats een Kimwipe op de rand van de slicehouder om als lont te dienen. Draag vervolgens een slice over naar de slicehouder in de registratiekamer, die continu wordt geperfuseerd met oxygenatie A CSF bij kamertemperatuur.

Dompel de zilver-zilverchloride referentie-elektrode onder in de houder voor de hersensnijplaten en verbind deze met de head stage met een krokodillenklem. Bevestig de koolstofvezel-micro-elektrode aan de micromanipulator en verbind deze met de head stage met een krokodillenklem. Laat vervolgens de wolfraam stimulatieruim en de koolstofvezel-micro-elektrode zakken tot aan het oppervlak van de hersensnede van de rat.

De stimulerende elektrode wordt gebruikt om ofwel een enkele puls of meerdere pulsen elektrische stimulatie aan het slice toe te dienen om neurotransmittervrijgave op te wekken, zodat de elektrisch opgewekte dopamine gemeten kan worden met fast scan cyclic voltammetry of FSCV; breng een spanning in een driehoeksgolf aan op de elektrode. Houd het potentiaal van de koolstofvezel-microelektrode op -0,4 volt. Voer dit op naar een positieve limiet van 1,2 volt.

Breng het vervolgens terug naar -0,4 V met een scansnelheid van 400 V/s. Stimuleer het slice elke vijf minuten en voer telkens gedurende 15 seconden een volumetrische meting uit van de resulterende dopamine FLX, nadat er minstens drie stabiele registraties van elektrisch gestimuleerde dopamineafgifte zijn verkregen, gedefinieerd als een verschil van minder dan 10% tussen de piekhoogtes.

Schakel over naar het perfunderen van de slice met een CSF die het farmaceutische middel van belang bevat, met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut gedurende 30 minuten om een maximaal effect te bereiken dat vergelijkbaar is met de baseline-opname. Meet elke vijf minuten de elektrisch gestimuleerde dopamineafgifte tijdens de farmaceutische perfusie. Figuur A is een voorbeeld van de meting van de elektrisch opgewekte dopamineafgifte met behulp van FSCV, na een enkelvoudige pulsstimulatie in het caudatus putamen.

Figuur B toont een driedimensionale pseudokleurenplot waarin de informatie van zowel de stroom-tijdcurves als het cyclisch voltammogram is gecombineerd. Op vergelijkbare wijze tonen figuur A en C de dopaminevrijgave opgewekt door een enkele elektrische stimulatiepuls in respectievelijk de kern (core) en de schil (shell) van de nucleus accumbens, waarbij de driedimensionale pseudokleurenplots voor de nucleus accumbens kern en schil respectievelijk in figuur B en D zijn aangegeven. Hier worden de representatieve curves getoond nadat de slice gedurende 30 minuten was behandeld met een farmacologisch middel, gevolgd door enkelpulsstimulaties om dopaminevrijgave in het caudatus putamen op te wekken.

De middelen die in de experimenten worden gebruikt, zijn quinol, methamphetamine en brain derived neurotrophic factor. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het voorbereiden van coronale hersensecties van muizen voor het verkrijgen en meten van presynaptische dopamine-dynamiek met behulp van fast scan cyclic voltammetry en telemetry.