Name: Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Leer hoe u polyacrylamidegels kunt gieten door commerciële Invitrogen Nupage Novex minigel-cassettes te hergebruiken. Deze kosteneffectieve methode vermindert plastic afval en biedt laboratoria een duurzaam alternatief voor dure voorgegoten gels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de Howard Hughes Medical Institute voor een UF Science for Life Award voor AH

1. Voorbereiden van de cassettes <ol><li> Schoon voor-en achterkant platen van een gebruikte Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassette, of andere commerciële MiniGel cassette. </li><li> Bereid ongeveer 1-3 ml kunststof epoxy en meng goed volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Breng de epoxy aan de binnenzijde van de voorplaat, waarbij de beide platen in aanraking komen, wanneer de cassette is gemonteerd. </li><li> Schuif een stuk filtreerpapier of karton door de bodem spleet van de achterplaat montage van de cassette om overmaat epoxy voorkomen afdichten van de opening. Het filtreerpapier zodra de twee platen zijn gemonteerd. </li><li> Plaats bindmiddel clips langs de randen voor een goede afdichting, en laat de cassettes zitten 's nachts voor de epoxy om volledig te genezen. </li><li> Sluit de sleuf aan de onderkant van de achterplaat met isolatietape. </li></ol> 2. Het gieten van de gel het oplossen van <ol><li> Om een ​​125 ml zijarm kolf, voeg het volgende:2,25 ml van de 4X Tris-Base Oplossen gel buffer pH 8,70, 3,50 ml van 30,8% acrylamide / bisacrylamide, 3,25 ml Type I reagenskwaliteit water (IRG-H 2 O) voor een totaal volume van 9 ml. </li><li> De-gas de oplossing gedurende 10 minuten door het aanbrengen van de zijarm van de kolf met een vacuuminrichting en plaatsen van een omgekeerde stop op de top van de kolf. </li><li> Breng de 9 ml ontgast oplossing 50 ml disposable polypropyleen centrifugebuis voeg 30 pl 10% ammounium persulfaat (APS) en 6 ul van N, N, N ', N',-tetramethylethyleendiamine (TEMED) en meng goed door omzwenken de oplossing te voorkomen dat er blaasjes. </li><li> Onmiddellijk giet de oplossing in de cassette, waardoor het te lopen langs de zijkant van de cassette om luchtbelletjes te voorkomen de vorming van de gel platen. Vul de cassette op ongeveer 2 cm van de bovenrand van de voorste (kortere) plaat. </li><li> Voorzichtig 0,5 ml 1-butanol verzadigd met 1X oplossing gel buffer en laat de gel polymeriseren van eenuur. </li></ol> 3. Gieten de stackinggel <ol><li> Voeg de volgende een 125 ml kolf zijarm: 0,75 ml van 4x Tris-base stackinggel buffer pH 6,80, 0,40 ml van 30,8% acrylamide / bisacrylamide, 1,85 ml IRG-H 2 O een totaal volume van 3 ml. </li><li> De-gas de oplossing gedurende 10 min zoals beschreven in stap 2. </li><li> Hoewel de stackinggel oplossing ontgassen, giet het 1-butanol verzadigd met 1X oplos gel buffer van de bovenkant van het oplossend gel. Spoel wanneer de bovenkant van de oplossing gel met IRG-H2O Giet het water af en gebruik maken van een aan de drank verslaafd of Whatman filtreerpapier om de resterende vloeistof op te vangen. </li><li> Verwijder de 3 ml van uw ontgaste oplossing en voeg 9 pl van 10% APS en 2 pl TEMED en meng goed. </li><li> Snel giet de oplossing in de cassette, waardoor het te lopen langs de zijkant van de cassette totdat het in de buurt van de bovenkant van de kortere voorkant gelplaat. </li><li> Plaats een schone gel kam in de top van de gel cassette,plaats een bindmiddel clip op de cassette op de kam zijn plaats te houden. Laat de stackinggel polymeriseren gedurende 1 uur een nacht. </li></ol> 4. Opslag van de gel <ol><li> Wanneer de gel volledig is gepolymeriseerd, verwijder het bindmiddel clips en plaats de cassette in een warmte-afsluitbare plastic zakje, of een hersluitbare plastic zak. </li><li> Breng 20 ml 1X stackinggel buffer die 0,1% natriumazide bevat in het zakje. </li><li> Verhit verzegelen de buidel voor 5 sec en of er geen lekken in de tas te maken. </li><li> Bewaar de gel bij 4 ° C. </li></ol> 5. De voorbereiding van de monsters <ol><li> In een dunwandige microcentrifugebuisje op tot 6,5 pl proteïnemonster, 7,5 ul 2x Novex Tris-glycine SDS-monsterbuffer, 1 pi 100 mM dithiothreitol (DTT) en IRG-H 2 O (indien nodig) om een totale volume van 15 pi. </li><li> Meng het monster door vortexen, en kort gecentrifugeerd monster inhoud naar het einde van de buis. </li> &lt;li&gt; denatureren van het monster bij 70 ° C gedurende 10 minuten. </ol> 6. Het uitvoeren van de gel <ol><li> Stel de Novex gel apparaat. </li><li> 200 ml Tris-glycine running buffer 500 ul Nupage antioxidant de binnenkamer en 300 ml Tris-glycine loopbuffer de buitenste kamer bevat. </li><li> Laad het gedenatureerde eiwit monsters (15 ul) in de putten met behulp van een gel laden pipetpunt. </li><li> Voer de gel bij 200 V voor 60-70 min. </li></ol> 7. Kleuring de gel <ol><li> Verwijder de cassette uit de gel apparatuur en breek de epoxy afdichting door nieuwsgierige van de twee plastic gel platen uit elkaar met behulp van een gel mes of een stijve plamuurmes. Haal voorzichtig de gel van de platen, en zorg dat er geen scheur de gel. </li><li> Spoel de gel met IRG-H 2 O drie keer met zacht schudden. </li><li> Vlekken op de gel met Invitrogen SimplyBlue SafeStain gedurende 1 uur onder zacht schudden. </li><li> Giet de kleuroplossing endestain de gel met de IRG-H 2 O. </li></ol> 8. Het reinigen van de cassettes <ol><li> Gebruik een metalen spatel te schrapen of loslaten van alle epoxy op de cassettes, zodat ze opnieuw kunnen worden hergebruikt. </li><li> Was elk van de kunststof gel platen met een mild schoonmaakmiddel en goed spoelen met kraanwater en vervolgens met gedestilleerd water. </li></ol> 9. Representatieve resultaten Omdat epoxy een waterdichte afdichting (figuur 1) te vormen, de cassettes geen lekken wanneer de acrylamide oplossing wordt uitgegoten in zijn. Bovendien kan de gel cassettes eenvoudig worden geopend om de gel te halen voor vlekken en de epoxy kunnen worden afgepeld van de cassettes om de verdere hergebruik maken. Zoals getoond in figuur 2, de gel toont duidelijke scheiding van proteïne markers monster banden voor routine eiwit elektroforese. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Applitoepassing van epoxy MiniGel cassettes verzegelen. een dunne laag epoxy wordt toegevoerd aan de rand van een van de cassettes vóór de montage. Om de epoxy te benadrukken, het was vals-rood gekleurd in dit beeld. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Scheiding van eiwitten op een SDS-Tris-glycine gel gegoten met hergebruikt MiniGel cassettes. SDS-PAGE werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Na elektroforese werd de gel uit de cassette MiniGel, gekleurd SimplyBlue SafeStain volgens fabrikant en gefotografeerd met uitgezonden witte licht. Lane M bevat SeeBlue Plus2 pre-eiwit gekleurd normen. De molecuulgewichten van de eiwitten in laan M aangegeven aan de rechterzijde van de gel in kilodalton (kDa). De andere doorgangen laten eiwitten uit een helder gemaakt lysaat van bacteriën expressie een glutathion-S-transferase (GST)-gemerkte eiwit. De getoonde eiwitten die wassen van het glutathione kralen voor elutie van de GST-gemerkte eiwit.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Protein gel electroforese een onmisbaar methode voor de meeste laboratoria moleculaire biologie. In de handel verkrijgbare minigels bieden een hoge mate van gemak, maar kan kostbaar zijn. Hier laten we zien hoe de MiniGel cassettes van een populair merk in de handel verkrijgbare minigels opnieuw te gebruiken. Deze methode houdt het gemak van een kant en klaar bron van gels, maar een fractie van de kosten van commercieel beschikbare minigels. Een belangrijke stap in de procedure wordt de toepassing van de juiste hoeveelh...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Invitrogen Nupage Novex MiniGel Cassette (1,0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> In 2, 5, 10, 12, 15 en 2D putten </td></tr><tr><td> Plastic Epoxy </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrische Tape </td><td> Scotch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 ml zijarm fles </td><td> Pyrex </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base het oplossen gel buffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-base pH 8,7 </td></tr><tr><td> acrylamide </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-acrylamide </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> 30,8% acrylamide oplossing </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H 2 O </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 0,1 g ammoniumpersulfaat in 1 ml IRG-H 2 O onmiddellijk vóór gebruik </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Arcos Organics </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-butanol verzadigd met 1X het oplossen gel buffer </td><td></td><td></td><td> 05:02 1-butanol tot 1X het oplossen gel buffer </td></tr><tr><td> 4X Tris-base stackinggel buffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-base pH 6,8 </td></tr><tr><td> Gel kam </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 goed, 1,0 mm dik </td></tr><tr><td> Impulse Sealer </td><td> TEW Elektrische Verwarming Equipment </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Warmte Verzegelbare Pouch </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 pint maat (6,5 &#39;x 8 &quot;) </td></tr><tr><td> Gel opslagbuffer </td><td></td><td></td><td> 1X stackinggel buffer met 0,1% natriumazide </td></tr><tr><td> Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X Tris-Gylcine loopbuffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1L van 10X stock: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g Glycine, 10,0 g SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Knife </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Veilig Stain </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van commercial cassettes

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

De evaluatie van eiwitten met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse een techniek die door biochemie en moleculaire biologie onderzoekers 1-4. Voor laboratoria die de dagelijkse analyses van eiwitten uit te voeren, kunnen de kosten van in de handel verkrijgbare polyacrylamidegels (~ $ 10/gel) aanzienlijk zijn in de tijd. Om deze kosten te beperken, sommige onderzoekers bereiden hun eigen polyacrylamide gels. Traditionele methoden van het gieten van deze gels meestal gebruik maken van gespecialiseerde apparatuur en glas gel platen die kunnen duur zijn en weg te gieten veel gels en op te slaan voor toekomstig gebruik. Bovendien kan de behandeling van glazen platen bij het schoonmaken of gel gieten resulteren in een onvoorziene breuk het creëren van een gevaar voor de veiligheid, waarin het gebruik ervan kan zich verzetten tegen in undergraduate laboratorium klassen. Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten tegelijk gels giet door recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkoop materialen gekocht bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu. Daarnaast plastic gel cassettes zijn uitermate bestand tegen breuk, waardoor ze ideaal zijn voor undergraduate laboratorium klaslokalen.

Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten gels gieten in een tijd van recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkope materialen die zijn aangeschaft bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu.

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

De evaluatie van eiwitten middels analyse met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) is een veelgebruikte techniek in de biochemie...

Mijn naam is David Oppenheimer en ik werk bij de afdeling Biologie van de Universiteit van Florida. Het aanschaffen van voorgegoten polyacrylamidegels voor routinematige proteïne-elektroforese is handig, omdat u altijd gels bij de hand heeft die klaar zijn voor gebruik. Commerciële gels kunnen echter duur zijn als uw laboratorium veel gels gebruikt.Bovendien worden commerciële gels doorgaans gegoten in plastic cassettes die ontworpen zijn om na gebruik te worden weggegooid, waardoor er plastic afval ontstaat dat meestal op een stortplaats terechtkomt. Vandaag laten we u zien hoe u deze plastic cassettes kunt hergebruiken om uw eigen polyacrylamidegels te gieten die wekenlang bewaard kunnen worden, waardoor uw laboratorium beschikt over een bron van goedkope, kant-en-klare gels voor routinematige proteïne-elektroforese. Oké, laten we beginnen.Bereid schone nieuwe Novak mini gelcassettes voor in Vitrogen. Verwijder ongeveer een theelepel epoxy en meng de oplossing volledig met een pipetpunt. Wanneer het mengen van de epoxy is voltooid, brengt u de epoxy aan op de achterzijde van de voorste cassette, op de plek waar de voor- en achterzijde met elkaar in contact komen.Wanneer u klaar b

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met cellulaire thermische verschuivingstest om de interactie tussen kleine moleculen en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.

Voorspelling en validatie van eiwitdoelen van een verbinding met kleine moleculen

Leer hoe u polyacrylamidegels kunt gieten door commerciële Invitrogen Nupage Novex minigel-cassettes te hergebruiken. Deze kosteneffectieve methode vermindert plastic afval en biedt laboratoria een duurzaam alternatief voor dure voorgegoten gels.

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

Meer video's verkennen