Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie
21 februari 2012
Hier beschrijven een werkwijze om direct zichtbaar microregional weefselhypoxie in de muis cortex In vivo. Het is gebaseerd op gelijktijdige twee-foton beeldvorming van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en de corticale microcirculatie. Deze methode is geschikt voor hoge resolutie analyse van weefsel zuurstof.
Het algemene doel van deze procedure is om direct microregionale weefselhypoxie in de muizencortex in vivo te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een open schedelvenster in een geanesthetiseerde muis voor te bereiden. Vervolgens wordt er fluorescente kleurstof intraveneus geïnjecteerd om de hersenvaten te labelen.
Ten slotte wordt er gelijktijdig fotonbeeldvorming van de intrinsieke NADH-fluorescentie en de fluorescent gelabelde corticale microvasculatuur uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die functionele hypoxie in microregio's van hersenparenchym laten zien door de aanwezigheid van de gereduceerde vorm van nicotinamide, adenine dinucleotide te visualiseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Clark-stijl elektroden is dat het een hoge speciale resolutie geeft over het grote beeldveld, en het is ook minder invasief.
Deze methode kan worden uitgevoerd op een standaard toegepast twee-fotosysteem met twee fluorescente kanalen. Hallo, ik ben Steve Hurst, professor en voorzitter van microbiologie en immunologie aan de Universiteit van Rochester. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Anita's zoon uit het Kishka Laboratorium, evenals Oxana Paulka, een onderzoeksassistent-professor uit mijn laboratorium. Dr.Kishka, die de NADH-beeldvormingstechniek heeft gepionierd, kan vandaag niet aanwezig zijn omdat hij onlangs naar Duitsland is verhuisd. Na het voorbereiden van de chirurgische locatie met de noodzakelijke instrumenten die zijn gesteriliseerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol en de muis is geanesthetiseerd met 5% isoflurine, plaatst u deze op een verwarmingspad en brengt u een gezichtsmasker aan om 1,3 tot 1,5% isoflurine in lucht af te geven.
Controleer het niveau van anesthesie door een staartprik uit te voeren. Breng vervolgens een rectale sonde in en meet continu de lichaamstemperatuur van het dier gedurende de procedure. Breng kunstmatig traanvochtgel aan in de ogen van de muis om te voorkomen dat ze uitdrogen.
Verwijder vervolgens het haar van het hoofd en beide dijen en breng haarverwijderaar aan op de dij gedurende twee minuten om het resterende haar te verwijderen. De dij zal worden gebruikt voor oximetrie. Desinfecteer ten slotte de hoofdhuid met een 10% povidon-jodiumoplossing en 70% ethanol. Om een schedelvenster te maken, begint u vijf millimeter vanaf de schedel met een schaar.
Maak een incisie in de hoofdhuid en ga één centimeter verder. Beweeg de huid naar de zijkanten om de schedel bloot te leggen. Om de membranen bovenop de schedel te verwijderen. Breng 10% ferrichloride-oplossing aan.
Veeg de overtollige oplossing weg en schraap de membranen weg met een hoek van 45 graden. Gebruik nummer vijf pincetten. Gebruik een dissectiemicroscoop om het gebied van belang te identificeren. Breng een dunne laag snel lijm aan rond de randen van het venster van de hoofdplaat.
Plaats de hoofdplaat zodanig dat het gebied van belang in het venster wordt blootgelegd en oefen lichte druk uit op de hoofdplaat. Breng een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm snel te laten polymeriseren. Houd 10 seconden vast terwijl de lijm polymeriseert.
Breng een kleine hoeveelheid snelle lijm aan op de randen van het venster om de hoofdplaat en de schedel te verzegelen. Schroef vervolgens de hoofdplaat op de dierhoud onder de dissectiescoop. Gebruik de micro-torque twee boor ingesteld op 6.000 RPM en de IRF 0 0 5 boorslijpsteen.
Verwijder alle overtollige lijm van de schedel en van de hoofdplaat. Stel vervolgens de boor in op duizend RPM en begin met het boren van de schedel door een cirkel te maken binnen het hoofdplaatvenster met een diameter van ongeveer vijf millimeter. Gebruik lichte veegbewegingen alsof u met een zeer zachte potlood aan het tekenen bent.
Stop elke 20 tot 30 seconden met boren en gebruik perslucht om botgruis te verwijderen. Terwijl het boren voortgaat, wordt er een holle ruimte gevormd rond de intacte schedel in het midden. Zorg ervoor dat u niet door de dunne schedel prikt, maar zorg er wel voor dat deze holte van gelijkmatige dikte is.
Wees bovendien extra voorzichtig rond grote bloedvaten. Deze mogen niet worden aangetast en indien mogelijk niet eens worden aangeraakt Met één punt van een pincet, tilt u het bot in het midden van het venster op en brengt u een druppel kunstmatige hersenvloeistof aan op het venster. Gebruik de hoek van een Kim-doek om voorzichtig de kunstmatige hersenvloeistof weg te vegen met een hoek van 45 graden.
Gebruik nummer vijf pincetten. Zoek een gebied met beschadigd duura langs de rand van het venster en til het op om het te verwijderen. Als er bloeding optreedt, brengt u een druppel kunstmatige hersenvloeistof aan en wacht u twee tot drie minuten totdat de lichte bloeding stopt.
Bereid vervolgens 10 milliliter 0,07% laag smeltende aero opgelost in kunstmatige hersenvloeistof. Breng de gesmolten aero's op lichaamstemperatuur. Veeg het overtollige kunstmatige hersenvloeistof weg van het oppervlak van de hersenen.
Plaats de aero's in het venster en dek het af met een glazen plaat. Druk vervolgens voorzichtig op het glas om contact tussen het glas en de hoofdplaat te maken en wacht 10 tot 20 seconden totdat de aero vast is. Gebruik pincetten en zacht weefselpapier om overtollig aero van de glazen afdekking te verwijderen.
Breng een kleine hoeveelheid snelle lijm aan rond het glas om het aan de hoofdplaat te lijmen. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm te verharden om in de femorale ader te injecteren. Draai het dier gedeeltelijk om om de binnenkant van de linkerdij bloot te leggen.
Gebruik tape om het dier vast te zetten. In deze positie brengt u antiseptisch scrub aan en vervolgens honderd procent ethanol op de huid. Maak vervolgens een incisie
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om microregionale weefselhypoxie in de muiscortex in vivo te visualiseren met behulp van twee-foton beeldvorming. De techniek maakt een hoog-resolutie analyse van weefsel zuurstoftoevoer mogelijk door gelijktijdige beeldvorming van NADH en corticale microcirculatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Beeldvormingstechnieken
- Fysiologie
Achtergrond
- Weefselhypoxie is een cruciale factor in verschillende neurologische aandoeningen.
- Traditionele methoden voor het meten van zuurstofniveaus kunnen invasief en minder nauwkeurig zijn.
- Twee-foton beeldvorming biedt een minder invasieve alternatief met hogere ruimtelijke resolutie.
- NADH is een belangrijke indicator van de cellulaire metabolische toestand en zuurstofbeschikbaarheid.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor real-time visualisatie van weefselhypoxie in de muiscortex.
- Om het begrip van microregionale zuurstoftoevoer in hersenweefsel te verbeteren.
- Om een minder invasieve techniek te bieden in vergelijking met bestaande methoden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een open schedel craniumvenster bij anesthetische muizen.
- Intraveneuze injectie van fluorescente kleurstof om hersenbloedvaten te labelen.
- Gelijketijdige twee-foton beeldvorming van NADH fluorescentie en microvasculatuur.
- Monitoring van bloedzuurstofverzadiging tijdens beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van functionele hypoxie in microregio's van de hersenen.
- Beeldvorming met hoge ruimtelijke resolutie van NADH en bloedvaten werd verkregen.
- De methode toonde minder invasiviteit aan in vergelijking met traditionele technieken.
- Resultaten wijzen op het potentieel voor een beter begrip van hersenmetabolisme.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van weefselhypoxie.
- Het verbetert het vermogen om zuurstoftoevoer in de hersenen te analyseren.
- Deze techniek kan leiden tot nieuwe inzichten in neurologische aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct visualization of microregional hypoxia in the mouse cortex using two-photon NADH imaging addresses a critical gap in understanding tissue oxygenation at high spatial resolution. This capability enables mechanistic de-risking of neurovascular targets and supports predictive confidence in early-stage CNS drug discovery. The method's non-invasive, quantitative outputs inform portfolio decisions where oxygen supply and metabolic stress are key risk factors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neurovascular metabolic pathways under hypoxic stress.
- Supports functional target validation by mapping oxygen gradients and tissue vulnerability.
- Facilitates predictive confidence in selecting targets linked to hypoxia-driven pathology.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantifying NADH fluorescence as a hypoxia biomarker.
- Enables reproducible, quantitative assessment of tissue oxygenation across experimental conditions.
- Supports assay standardization for evaluating compound effects on microregional oxygen supply.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of neurovascular compromise and stroke.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of hypoxia-modulating interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting oxygen delivery or metabolic resilience.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for CNS and neurovascular programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen diffusion and metabolic stress in brain tissue.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible NADH fluorescence readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables spatial mapping and statistical comparison of hypoxic versus oxygenated regions.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity for preclinical models of stroke and neurovascular disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse CNS hypoxia studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo hypoxia measurement with high spatial resolution and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for CNS programs by clarifying oxygenation risk factors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of assets targeting metabolic or vascular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy and in vivo surgical preparation.
- Needs access to standard two-photon imaging systems with dual fluorescence channels.
- Demands rigorous cross-team standardization for imaging and data analysis protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- Potential limitations include surgical complexity and the need for precise oxygen modulation.
