Name: Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer microregionale hypoxie detecteren in de hersenschors van muizen met twee-fotonbeeldvorming van endogene NADH-fluorescentie. Deze methode biedt hoge resolutie voor het analyseren van weefselzuurstoftoevoer in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) voor de kopplaat ontwerp. Het werk werd ondersteund door NIH awards uit aan SD (R01DA026325 en P30AI078498 en de stichting subsidies aan KK (DANA Stichting Brein en Immunoimaging programma American Heart Association 0635595T en de ALS Association [# 1112)]).

1. Voorbereiding van het dier voor de beeldvorming Let op: We maken gebruik van volwassen C57BL muizen. Verschillende transgene stammen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Microvasculaire operaties en pulsoximetrie worden gefaciliteerd in muizen met een witte vacht (bv. FVB-stam). <ol><li> Bereid de chirurgische site op de bank. Alle chirurgische instrumenten moeten worden geautoclaveerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol. </li><li> Plaats een rectale sonde, en voortdurend van het dier lichaamstemperatuur te meten tijdens de gehele procedure </li><li> Verdoof de muis met behulp van in eerste instantie 5% isofluraan. In 15-30 s, Als het dier niet in beweging is, leg het op een verwarmingselement (37 ° C), en pas een gezichtsmasker voor de continue toediening van lucht met 1,3-1,5% isofluraan). Zorg ervoor dat het dier niet reageert op een pijnprikkel (bv staart knijpen). </li><li> Gebruik kunstmatige traan gel om de muis van de ogen te bedekken, om blootstelling aan droge lucht te voorkomen. </li><li> Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, verwijder haar from het hoofd en van beide dijen. Breng haar remover (bijv. Nair) om de dij gedurende 2 minuten, en dan voorzichtig veeg het om de resterende haren te verwijderen. Dit dij zal worden gebruikt voor oximetrie. </li><li> Desinfecteren de hoofdhuid met een 10%-ige povidonjood-oplossing en 70% ethanol. </li></ol> 2. Voorbereiding van het open schedel schedel venster <ol><li> Vanaf 5 mm caudaal van de schedel, maakt een sneetje in de hoofdhuid met een schaar, en vooruit een centimeter. Verplaats huid aan de zijkanten om de schedel bloot te leggen. </li><li> Om de membranen te verwijderen op de schedel toepassing 10%-oplossing naar de top van de schedel. Veeg de overtollige oplossing, en weg te schrapen van de membranen met 45 ° hoek # 5 pincet. Het is belangrijk om de plaats nauwkeurig op te stellen, zodat de kopplaat kan stevig worden bevestigd aan de schedel (de stappen 4-6). </li><li> Met behulp van een dissectie microscoop te identificeren op het gebied van belang. Merk op dat de schedelnaden moet worden vermeden, omdat de schedel ceen onvoorspelbaar breken in deze richting. </li><li> Een dunne laag van snelle lijm (bijv. Locktite 454) langs de randen van het raam van de kopplaat (figuur 1). Plaats de kopplaat zodanig dat het gebied van belang is blootgesteld in het venster. Breng lichte druk op het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm te snel te polymeriseren. Houd gedurende 10 seconden, terwijl de lijm wordt polymerisatie. </li><li> Een kleine hoeveelheid van snelle lijm op de randen van het raam van de kopplaat en de schedel dichten. Schroef de kop plaat om het dier houder onder de dissectie scope. </li><li> Met behulp van de Microtorque II boor vastgesteld op 6000 rpm en een IRF 005 boor, verwijder alle extra lijm van de schedel en van het hoofd plaat. Eventuele resterende lijm op het hoofd plaat dient te worden verwijderd, omdat ze anders interfereren met de bevestiging van de glazen afdekplaat. </li><li> Zet de boor bij 1000 rpm, en start het boren van de schedel door het maken van een cirkel in het hoofd plaat venster, een diameter van ~ 5 mm. Gebruik licht strijkende bewegingen alsof je tekenen met een zeer zacht potlood. Stop met het boren van elke 20-30 seconden op het bot stof met behulp van perslucht te verwijderen. Opmerking: De vorm van de opening in de kop plaat maakt het mogelijk extra toegang voor de boor (voor links-en rechtshandig chirurg), wat maakt het makkelijker om een ​​ronde schedel venster te maken. Bovendien zijn de twee oneven gevormde gaten de benodigde ruimte voor een Clark-elektrode of glas-electrode te voegen in het hersenweefsel onder de schedel venster extra polarografische of elektrofysiologische metingen. </li><li> Zoals het boren voortgaat een hol gevormd rond de intacte schedel in het midden. Wees voorzichtig niet te porren door de verdunde schedel, maar om dit hol van gelijke dikte te maken. Wees extra voorzichtig rond de grote bloedvaten, ze mogen niet worden aangetast en, indien mogelijk, zelfs niet aangeraakt. </li><li> Gebruik een "been" pincet # 3 heffen ("beweeg off") het bot in het midden van het venster. Breng een druppel artificial cerebrospinale vloeistof (aCSF) op het raam. </li><li> Veeg aCSF voorzichtig met een hoek van zacht weefsel papier (bijvoorbeeld Kimwipe). Gewoonlijk de duur beschadigd in een of meer plaatsen langs de rand van het raam. Vanaf een van deze sites, til en dan de dura te verwijderen uit de hersenen oppervlak, met behulp van hoek van 45 ° pincet # 5. Bij de keuze van de plaats waar beginnen verwijderen dura, voorkomen de gebieden grenzend aan grote bloedvaten. Als er een bloeding optreedt, breng dan een druppel aCSF en wacht 2-3 minuten voor kleine bloedingen te stoppen. </li><li> Bereid 0,07% bij lage temperatuur smeltende agarose opgelost in aCSF) de gesmolten agarose Breng aan de lichaamstemperatuur. Veeg de overmaat aCSF van het oppervlak van de hersenen. Giet de agarose in het venster, en dek af met een glasplaatje. Druk zachtjes op het glas om een ​​contact tussen het glas en het hoofd plaat te maken, en wacht 10-20 sec tot de agarose is solide. </li><li> Verwijder het teveel aan agarose uit de glazen afdekplaat met een pincet en het zachte weefsel papier. </li><li> Zet een kleinehoeveelheid van snelle lijm rond het glas te lijmen het glas naar het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm (figuur 1) stollen. </li></ol> 3. Intraveneuze injectie en bloedoxygenatie controle Let op: Wij routinematig gebruikt de lies voor intraveneuze toepassing van Texas rode in plaats van de staartader. Dit komt omdat dijader injecties een veilige en reproduceerbare bolusinjecties van de kleurstof. <ol><li> Draai het dier gedeeltelijk naar de binnenzijde van de linkerdij bloot. Gebruik tape om het dier veilig te stellen in deze positie. </li><li> Breng antiseptische scrub, en vervolgens 100% ethanol voor de huid. </li><li> Maak een insnijding langs de mediale dij van de knie tot het bekken. Aparte zachte weefsels door stompe dissectie met een pincet # 5. </li><li> Vul 1 ml spuit met 130 ul van Texas Red (2,5 mg / ml). Bevestig een nieuwe naald (gauge 30), en zorgvuldig buig het op 30 °, het bijhouden van de schuine kant op. Vul de naald wie Texas Red oplossing. </li><li> Onder een dissectie microscoop, steek de naald in de lies en injecteer 100 ul van Texas Red. Verwijder de naald en licht de ader drukt u op met een gaasje om het bloeden te stoppen. </li><li> Sluit de huid met behulp van 4-0 hechtdraad. </li><li> Voor continue bewaking van het bloed SpO 2 (voldoende bloedoxygenatie te garanderen) plaats de oximeter sonde op de rechter dij (waar haar werd eerder verwijderd). </li></ol> 4. Twee-foton beeldvorming Opmerking: Wij maken gebruik van een Olympus Fluoview1000 multifoton imaging-systeem (rechtop) met een Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtoseconde Ti: Sa laser als een excitatie bron. Voor de beeldvorming, gebruiken we × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), of × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) water-onderdompeling doelstellingen. We nemen beelden 12 bitdiepte met een resolutie van 512 x 512 pixels met een pixelverblijftijd van 2 ps. De NADH en Texas-Rood-dextran gelijktijdig enthousiast op 740 nm, en fluorescence is gescheiden van het excitatie licht met behulp van een dichroïsche spiegel / nabij-IR-sperfilter combinatie (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA), verdeeld in twee kanalen met behulp van een dichroïsche spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), en de bandbreedte gefilterd (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laservermogen gemeten na de doelstelling 10-20 mW voor beeldvorming bij laag I en 20-50 mW voor beeldvorming bij laag II. <ol><li> Breng de chirurgisch voorbereid muis om de microscoop podium. Neem een ​​eerste beeld van de schedel venster site met behulp van helderveld verlichting met 4-voudige vergroting om als referentie kaart voor registratie te gebruiken met een hogere vergroting twee-foton angiografieën. </li><li> Zoom in op het gebied van belang aan de hand × 10 vergroting. Een gebied van belang in corticale lagen I en II (tot 150 pm onder het oppervlak pial). Als er een hogere vergroting gewenst is, gebruik dan × 25 doel </li><li> Begin op te nemen de tijdreeks (FiguAd 2). Wij raden een gemiddelde van 3-5 frames om de kwaliteit van het beeld te vergroten. </li><li> Induceren hypoxie door toevoeging van 50% N2 in de lucht het dier ademt. Dit zal het O2-niveau tot 10%. Controleer of hypoxemie door het bewaken van oximeter gegevens. </li><li> Blijf de tijdreeksen op te nemen door middel van hypoxie (bijvoorbeeld voor 30 seconden), en na de normale O2-niveau is hersteld. </li><li> Verzamel gegevens voor de berekening van de zuurstof die de distributie door het detecteren, meten en kwantificeren van de oppervlakte van hypoxie en zuurstofrijk weefsel cilinders rond de bloedvaten. </li></ol> 5. Gegevensverwerking <ol><li> Bepaal de Krogh weefsel cilinder straal R. Dit kan manueel (figuur 3) door de afstand tussen het middelpunt van het bloedvat en de grens waarbij hoge NADH fluorescentie wordt waargenomen. </li><li> U kunt ook de computationele onderzoekers onafhankelijk semi-automatische bepaling van het weefsel cilinder straal R en de centrale blood schip r dat al eerder is beschreven in een aanvullende vorm en samengevat in de bespreking van dit protocol. </li><li> Bepaal het oppervlak van hypoxie met behulp van open-access beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ. Om dit te doen, gebruik maken van NADH-signaal, definieert u een drempel die de hoge NADH intensiteit gebied afbakent, en meet vervolgens het gebied met verhoogde NADH weefsel fluorescentie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Figuur 2 toont een video van NADH / angiografie beelden tijdens de voorbijgaande hypoxemie (voor de PDF-versie van deze figuur, geselecteerde foto's zijn gebruikt). De zuurstof concentratie werd verlaagd van 21% naar 10% voor een periode van 3 minuten. Dit niveau van experimenteel geïnduceerde hypoxemie is voldoende om ernstige hypoxie te induceren in de cerebrale cortex. Hypoxie leidt tot een toename van NADH fluorescentie, eerst in de domeinen die het verst van de arteriële bloedtoevoer. Let op de scherpe NADH weefselgrenzen, die waarneembare weefsel grenzen van zuurstofdiffusie vormen van de corticale microcirculatie. Het beeld in figuur 3 de geometrie van zuurstofdiffusie grenzen rond cerebrale bloedvaten. Het is af te leiden Krogh cilinder diameters van deze grenzen, zoals eerder beschreven 1. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) Muis met schedel venster voorbereid voor de beeldvorming. (B) Afmetingen van het hoofd van plaat. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Endogene NADH groene fluorescentie zichtbaar gemaakt met twee-foton beeldvorming door middel van craniale raam, ongeveer 50 urn onder het pial oppervlak. Bloedvaten worden gevisualiseerd met Texas Red dextran. Zuurstof in ingeademde lucht werd verlaagd tot 10% gedurende 3 minuten, en dan hersteld voor 21%. Schaal bar: 50 pm. &lt;img alt = "Afbeelding 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" /&gt; Figuur 3. Geometrie van NADH fluorescentie grenzen. Geel schets toont grens van functionele hypoxie; blauwe cirkels geven geprojecteerd zuurstof (Krogh) cilinders. Blauwe lijnen geven cilinder stralen; cijfers laten zien stralen in micrometers.

<ol><li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li>
<li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox.+Signal%22%5BJournal%5D)">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li>
<li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li>
<li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
<li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li>
<li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li>
<li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li>
<li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een hoge ruimtelijke resolutie informatie over zuurstofdiffusie is belangrijk om te begrijpen hoe de bloedstroom in de hersenen wordt geregeld om zuurstof aan hersencellen, en de metabole vraag te voldoen. Traditionele polarografische zuurstof metingen met behulp van Clark-stijl glazen elektroden zijn zeer ingrijpend en hebben een lage ruimtelijke resolutie 2-3 en significant (tweede reeks) responstijd. Tot nu toe de enige niet-invasieve methode voor het meten van pO 2 in hersenweefsel is fosforescentie afschrikken, waar de snelheid van het verval van de aangeslagen sonde is evenredig aan de zuurstofconcentratie 4. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige zuurstofconcentraties, maar vereist een eigen kleurstof en een technisch geavanceerde fosforescentie levensduur imaging systeem. Hier tonen we een eenvoudige, eenvoudiger aanpak die kan op een standaard twee-foton imaging-systeem worden uitgevoerd met twee flurescence kanalen. Onze aanpak maakt gebruik van een intrinsieke weefsel-signaal 5 and vereist slechts contrasterende visualisatie van de corticale microcirculatie. Vanwege de niet-lineaire, in hoofdzaak tweewaardig toename van NADH fluorescentie bij functioneel beperken zuurstofconcentraties 1 verhoogd intrinsieke NADH fluorescentie wordt alleen waargenomen in gebieden met aanzienlijke beperking metabolisch hypoxie. Een belangrijke implicatie is dat weefsel grenzen van zuurstof diffusie van corticale microvaten rechtstreeks waarneembaar zijn door de cilindervormige intensiteit veranderingen van de endogene NADH fluorescentie. We verwijzen naar deze structuren als Krogh cilinders, omdat het concept van cilindervormige structuren die de zuurstof volume van weefsel rondom een bloedvat te definiëren werd geïntroduceerd door August Krogh en is recent experimenteel waargenomen met behulp van twee-foton NADH imaging 1. Krogh cilinders beelden kunnen worden verzameld in 3D door een z-stapel scannen. Ze zijn vooral prominent in de buurt van indringende arteriolen en ze zijn congruent with capillaire uitgeput periarteriolar weefsel cilinders 1,4. Om een objectieve bepaling van de Krogh weefsel cilinder straal R (zie paragraaf 5.2) hebben we hun radiale pixel intensiteit gemeten waarden in een goed gedefinieerde segment tussen het centrum van de cilinder en de buitenste grens met behulp van de Matlab functie &quot;improfile&quot; te leveren. De buitenrand van het segment worden gekozen uit te breiden met een veiligheidsmarge buiten het zichtbare grens. Om de signaal-ruis niveau te verbeteren we averageed over alle radiale lijnen nodig zichtbare cilindersegment op 1 ° stappen omvatten. De resulterende gemiddelde radiale intensiteit profiel binnen het segment vertoonde een sterke stijging, die overeenkwam met de zichtbare weefsel grens R. De we past een sigmoïdale functie (bijvoorbeeld Boltzmann functie) de gemiddelde radiale intensiteitsprofiel en gebruikte de buigpunt (ook bekend als x 0) als een definitie van R. De bijbehorende twee photon microangiography (Texas-rood) bleek de doorsnede van een enkele centrale bloedvat in het centrum van de cilinder. De diameter van de centrale bloedvat kan direct worden toegepast r bepalen. Twee-foton NADH imaging biedt dezelfde ruimtelijke resolutie als de gelijktijdige hoge-resolutie afbeelding van de corticale microangiography. Een belangrijk kenmerk voor de kwantitatieve toepassing van deze methode is dat p 50 van de NADH fluorescentie toename gemeten als 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 en dat de NADH fluorescentie-intensiteit als functie van microregional weefsel pO 2 kan mathematisch worden beschreven met een sigmoïdale functie. . We tonen aan dat deze techniek maakt het mogelijk om vast hersendelen die het meest gevoelig hypoxie (door afnemende zuurstofgehalte in de lucht 10%). We tonen ook aan dat de zuurstof diffusie een eenvoudige geometrische perivasculaire patroon volgt. Een critsche stap van deze methode is de kwaliteit van de schedel venster preparaat. De operatie moet leiden minimale schade om niet om de bloedstroom te verstoren met het blootgestelde gebied. Een zorg is dat in een chirurgisch gecompromitteerd voorbereiding, de cortex onder het raam kan hypoxische om te beginnen, zich verzet tegen een zinvolle experimenten. Een goed voorbereide craniale venster moeten intact grote en kleine bloedvaten met levendige bloedstroom in alle types schepen en er geen significante bloedingen langs de randen. Onder normoxie (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) van de hersenen parenchym moeten vertonen een uniforme, homogene NADH fluorescentie zonder opvallende, lichte weefsel plekken met verhoogde NADH fluorescentie. Een fundamentele fysieke beperking van onze aanpak is beperkt diepte penetratie. De blauw-groene NADH fluorescentie in de hersenen wordt snel verzwakt door hemoglobine absorptie en verstrooiing weefsel op deze golflengten. Zelfs met een hoge numerieke apertuur (bijv. 1,05) wateronderdompeling doelstellingen twee-foton NADH beeldvorming is momenteel beperkt tot corticale lagen I en II. Deze beperking is wetenschappelijk relevant omdat energiemetabolisme in of in de nabijheid van de witte stof zal waarschijnlijk verschillen van de grijze stof. Echter, de onderzoek diepe corticale structuren zoals lagen IV-VI en subcorticale structuren zoals witte stof contracten of het striatum is het gebruik van speciale microlenzen zoals beschreven in de muis cortex in vivo 6. NADH op basis van meting van zuurstof diffusie grenzen kan vooral nuttig zijn in combinatie met andere metingen zoals analyses van functionele hyperemie, en detectie van capillaire fluxen 7. Bijvoorbeeld kan deze techniek worden aangepast aan hypoxie visualiseren beroerte en ziekte van Alzheimer (AD) modellen. De eenvoudige geometrie van zuurstof diffusie maakt het mogelijk om de zuurstof gradiënt in microvasculaire bedden te voorspellen onder omstandigheden waarin capillaire dichtheid is detoegenomen 8 (bijv. AD 9) en te onderzoeken of hersenweefsel regio&#39;s met een verminderde capillaire dichtheid hebben een verhoogd risico op hypoxie schade als gevolg van microstrokes. De mogelijkheid om microregionally maakt het ook mogelijk om de vorm en afmetingen van het weefsel microstrokes onderzoeken en het volume van weefsel waarin hypoxie optreedt bepalen, alsmede de verhouding tussen weefselhypoxie en vervolgens neuronale dood of capillair remodellering 10. Tot slot, aangezien stijgingen van de endogene NADH fluorescentie zijn het directe gevolg van acute mitochondriale dysfunctie, deze methode biedt de mogelijkheid om NADH beeldvorming te gebruiken als een specifieke verslaggever voor neurale energiemetabolisme 11 en een proxy voor mitochondriale dysfunctie. Tot slot, twee-foton beeldvorming van endogene NADH fluorescentie is een eenvoudige, niet veeleisend instrument dat kan worden gebruikt om zuurstof levering en het verbruik in de hersenen te begrijpen, zowel onder normaleen pathologische toestanden.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Verwarming pads </td><td> Beyond Bodi Warmte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oogzalf (kunsttranen) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidonjood-oplossing van 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ijzerchloride 10% oplossing </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cement </td><td> Stoelting Company </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanoacrylaat 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handstuk kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 boren </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pincetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Tang # 5/45 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 glazen dekglaasje </td><td> Elektronen Microscopie Wetenschappen </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fotomultiplicator </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: saffier-laser Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van microregional hypoxie in mouse cerebral cortex door twee-foton imaging van endogene nadh fluorescentie

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

De hersenen het vermogen om te functioneren op een hoog niveau van metabole vraag hangt af van continue toevoer van zuurstof door bloedtoevoer en weefsel zuurstof diffusie. Hier presenteren we een gevisualiseerde experimentele en methodologische protocol om direct te visualiseren microregional weefselhypoxie en perivasculaire zuurstof hellingen af ​​te leiden in de muis cortex. Het is gebaseerd op de niet-lineaire relatie tussen nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogene fluorescentie-intensiteit en de partiële zuurstofdruk in het weefsel, waar opgemerkt weefsel NADH fluorescentie abrupt verhoogt op weefsel zuurstof dan 10 mmHg 1. We maken gebruik van twee-foton excitatie bij 740 nm die het mogelijk maakt voor gelijktijdige excitatie van intrinsieke NADH fluorescentie weefsel en bloedplasma in contrast met Texas-Red dextran. De voordelen van deze methode boven bestaande benaderingen omvatten de volgende: profiteert van een intrinsieke weefsel signaal en kan worden uitgevoerd met standaard twee foton in vivo imouder materiaal; het maakt het mogelijk continue monitoring in het hele gezichtsveld met een diepte resolutie van ~ 50 um. We laten zien dat hersenweefsel gebieden die het verst van cerebrale bloedvaten overeen met kwetsbare stroomgebieden gebieden die als eerste functioneel hypoxische is geworden na een daling van de vasculaire zuurstoftoevoer. Deze methode maakt het mogelijk om beeld microregional corticale oxygenatie en is daarom nuttig voor de behandeling van de rol van onvoldoende of beperkte weefsel zuurstoftoevoer in neurovasculaire ziekten en beroerte.

Hier beschrijven een werkwijze om direct zichtbaar microregional weefselhypoxie in de muis cortex<em&gt; In vivo</em&gt;. Het is gebaseerd op gelijktijdige twee-foton beeldvorming van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en de corticale microcirculatie. Deze methode is geschikt voor hoge resolutie analyse van weefsel zuurstof.

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

Het vermogen van de hersenen om te functioneren bij een hoge metabole vraag is afhankelijk van een continue zuurstoftoevoer via de bloedstroom en zuurstofdiffusie in het weefsel. ...

Het algemene doel van deze procedure is om micro-regionale weefselhypoxie in de cortex van de muis in vivo direct te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een open schedelvenster te prepareren bij een geanestheseerde muis. Vervolgens wordt een fluorescerende kleurstof intraveneus geïnjecteerd om de cerebrale bloedvaten te labelen.Ten slotte wordt gelijktijdig fotonbeeldvorming van de intrinsieke NADH-fluorescentie en de fluorescentie-gemarkeerde corticale microvasculatuur uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die functionele hypoxie in microregio's van het hersenparenchym aantonen door visualisatie van de aanwezigheid van de gereduceerde vorm van nicotinamide-adenine-dinucleotide. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Clark-elektroden, is dat deze een hoge ruimtelijke resolutie biedt over een groot gezichtsveld en bovendien minder invasief is.Deze methode kan worden uitgevoerd op een standaard toegepast twee-fotonsysteem met twee fluorescentiekanalen. Hallo, ik ben Steve Hurst, professor en hoofd microbiologie en immunologie aan de University of Rochester. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Anita's son uit het Kishka-laboratorium, evenals Oxana Paulka, een research assistant professor uit mijn laboratorium. Dr. Kishka, die de NADH-imagingtechniek pionierde, kan vandaag niet aanwezig zijn omdat hij onlangs naar Duitsland is verhuisd. Nadat de chirurgische plaats is voorbereid met de benodigde instrumenten die zijn geautoclaveerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol en de muis is genarceerd met 5% isofluraan, plaatst u deze op een warmtepad en brengt u een gezichtsmasker aan om 1,3 tot 1,5% isofluraan in lucht toe te dienen.Controleer de diepte van de anesthesie door middel van een knijptest in de staart. Plaats vervolgens een rectale probe en meet continu de lichaamstemperatuur van het dier gedurende de gehele procedure. Breng kunsttranengel aan in de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.Verwijder vervolgens het haar van de kop en beide dijbenen; breng gedurende twee minuten haarverwijderaar aan op het dijbeen om het resterende haar te verwijderen; het dijbeen zal worden gebruikt voor oximetrie. Desinfecteer tot slot de hoofdhuid met een 10% povidonjodiumoplossing en 70% ethanol. Om een craniële opening te maken, wordt met een schaar vijf millimeter rondom de schedel ingesneden.Maak een incisie in de hoofdhuid en ga één centimeter verder. Verschuif de huid naar de zijkanten om de schedel bloot te leggen en de membranen op de schedel te verwijderen. Breng een 10% ferricchloride-oplossing aan.Veeg de overtollige oplossing weg en schraap de membranen weg onder een hoek van 45 graden. Nummer vijf, pincet. Identificeer het gebied van interesse met behulp van een dissectiemicroscoop. Breng een dunne laag snellijm aan rond de randen van het venster van de hoofdplaat.Positioneer de hoofdplaat zodanig dat het gebied van interesse in het venster zichtbaar is en oefen een lichte druk uit op de hoofdplaat. Breng een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm snel te polymeriseren. Houd dit 10 seconden vast terwijl de lijm polymeriseert.Breng een kleine hoeveelheid secondelijm aan op de randen van het venster om de hoofplaat en de schedel af te dichten. Schroef vervolgens de hoofplaat vast aan de dierhouder onder de dissectiescoop. Gebruik hiervoor de micro-torque twee boorset ingesteld op 6.000 RPM en de IRF 0 0 5 boorkop.Verwijder alle overtollige lijm van de schedel en van de hoofdplaat. Stel vervolgens de boormachine in op 1000 RPM en begin met het boren in de schedel door een cirkel met een diameter van ongeveer 5 mm te maken binnen het venster van de hoofdplaat. Gebruik lichte vegende bewegingen, alsof u met een zeer zacht potlood tekent.Stop elke 20 tot 30 seconden met boren en gebruik perslucht om het botstof te verwijderen. Naarmate het boren vordert, vormt zich een geul rondom de intacte schedel in het centrum. Let erop dat u niet door de dunne schedel heen boort, maar zorg ervoor dat deze geul overal dezelfde dikte heeft.Wees daarnaast extra voorzichtig in de buurt van grote bloedvaten. Deze mogen niet worden beschadigd en, indien mogelijk, zelfs niet worden aangeraakt. Til met één punt van een pincet het bot in het centrum van het venster op en breng een druppel kunstmatig cerebrospinaal vocht aan op het venster. Veeg het kunstmatige cerebrospinale vocht voorzichtig weg met de hoek van een Kimwipe in een hoek van 45 graden.Nummer vijf, pincet. Lokaliseer een beschadigd gebied van de dura langs de rand van het venster en til dit op om het te verwijderen. Indien er bloedingen optreden, breng dan een druppel kunstmatig CSF aan en wacht twee tot drie minuten tot lichte bloedingen zijn gestopt.Bereid vervolgens 10 milliliter 0,07% laagsmeltende agarose voor, opgelost in kunstmatig cerebrospinaal vocht. Breng de gesmolten agarose op lichaamstemperatuur. Veeg het overtollige kunstmatige cerebrospinaal vocht van het oppervlak van de hersenen.Giet de aeros in het venster en dek dit af met een dekglas. Druk vervolgens voorzichtig op het glas om contact te maken tussen het glas en de kopplaat en wacht 10 tot 20 seconden tot de aero gestold is. Verwijder met een pincet en zacht weefselpapier de overtollige aero van het dekglas.Breng een kleine hoeveelheid secondelijm rond het glas aan om het aan de hoofdplaat te lijmen. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm te verstevigen voor injectie in de femorale vene. Draai het dier gedeeltelijk om om de binnenzijde van het linker dijbeen bloot te leggen.Gebruik plakband om het dier te fixeren. Breng in deze positie een antiseptische scrub aan en vervolgens honderd procent ethanol op de huid. Maak daarna een incisie langs de mediale dij van de knie tot de pubische symfyse.Scheid indien nodig de weke delen door middel van botte dissectie. Vul een injectiespuit van één milliliter met 130 µL Texas red. Bevestig een nieuwe naald van 30 gauge en buig deze voorzichtig in een hoek van 30 graden, waarbij de schuin geslepen zijde naar boven blijft wijzen.Vul de naald onder een dissectiemicroscoop met Texas Red-oplossing, steek de naald in de vena femoralis en injecteer 100 µL Texas Red. Verwijder de naald en druk licht op de vene met gaas om de bloeding te stoppen. Sluit de huid met 4-0 hechtdraad voor continue monitoring van de zuurstofsaturatie in het bloed.Plaats de oximetersensor op de rechterdij waarvan het haar vooraf is verwijderd. Om te beginnen met de beeldvorming, brengt u de chirurgisch geprepareerde muis over naar de microscooptafel. Maak een eerste foto van de locatie van het craniële venster met Bright Field-verlichting bij een viervoudige vergroting om als referentiekaart te gebruiken voor registratie met een hogere vergroting voor foton-anisotropie.Zoom in op het gebied van belang met een 10x vergroting. Selecteer een gebied van belang in de corticale lagen. Druk op één of twee om de tijdserie op te nemen.We raden aan om een gemiddelde van drie tot vijf frames te gebruiken om de beeldkwaliteit te verhogen. Wek vervolgens hypoxemie op door 50% stikstof toe te voegen aan de lucht die het dier inademt. Dit zal het zuurstofgehalte naar 10% brengen. Verifieer de hypoxemie door de gegevens van de oximeter te bewaken.Ga door met het registreren van de tijdreeks tijdens de hypoxemie gedurende ongeveer 30 seconden en nadat het normale zuurstofgehalte is hersteld. Verzamel gegevens voor de berekening van de zuurstofdistributie door het gebied van hypoxie en de zuurstofrijke weefselcilinders rond de bloedvaten te detecteren, te meten en te kwantificeren. Om de straal R van de weefselcilinder te bepalen, meet u de afstand tussen het centrum van het bloedvat en de grens waarbij een hoge NADH-fluorescentie wordt gedetecteerd.Raadpleeg het geschreven protocol voor de methoden van gegevensverwerking. Deze figuur toont gelijktijdige NADH- en geografische beelden uit een video-opname tijdens transiënte hypoxemie, waarbij de geïnhaleerde zuurstofconcentratie gedurende een periode van drie minuten werd verlaagd van 21% naar 10%. Dit niveau van experimenteel geïnduceerde hypoxemie is voldoende om ernstige hypoxie in de cerebrale cortex op te wekken.Hypoxie leidde tot een toename van de NADH-fluorescentie, aanvankelijk in groen weergegeven in de gebieden die het verst van de arteriële bloedtoevoer afliggen. Let op de scherpe NADH-weefselgrenzen, die de waarneembare weefselgrenzen van zuurstofdiffusie vanuit de corticale microcirculatie vertegenwoordigen, weergegeven in rood. Hier is een gelijktijdige afbeelding van de fluorescentielabelled microvaten van de cortex in rood, en de intrinsieke NADH-fluorescentie van de grijze stof van de cortex in groen; de distributie van de NADH-fluorescentie-intensiteit is binair.Er zijn gebieden met uniform lage NADH-fluorescentie en gebieden met uniform hoge NADH-fluorescentie. De gele lijnen stellen de weefselgrenzen voor tussen de gebieden met lage en hoge NADH-fluorescentie. Deze weefselgrenzen vertonen een ruimtelijke relatie met de nabijgelegen microvaten.Deze relatie wordt bepaald door de zuurstofdiffusie vanuit de microvaten naar het weefsel. In sommige gevallen kan de cilindrische aard of de CRO-weefselcilinder van deze weefselgrenzen direct worden herkend, zoals aangegeven door de blauwe lijnen. Hier heeft de weefselgrens een cirkelvorm met een concentrisch centraal bloedvat zodra deze beheerst is.Deze techniek kan in 1,5 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden het dekglas op de metalen plaat te lijmen om verticale beweging van het corticale oppervlak als gevolg van oedeem te voorkomen. Na deze procedure kunnen aanvullende analyses worden uitgevoerd, zoals metingen van functionele hyperemie, met als doel aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de relatie tussen weefselhypoxie en cerebrovasculaire koppeling.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u micro-regionale weefselhypoxie in de cortex van muizen kunt visualiseren.

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video laat zien hoe u foto doorbloeding dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.

Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

We presenteren een experimentele procedure voor het meten van de partiële druk van zuurstof (pO2) in cerebrale vaatstelsel op basis van zuurstof-afhankelijke quenching van fosforescentie. Dier voorbereiding en beeldvormende procedures werden uiteengezet voor zowel grote beeldveld van CCD-gebaseerde beeldvorming van pO2 in ratten en twee-foton excitatie gebaseerde beeldvorming van de pO2 in muizen.

Cerebral Blood Oxygenatie meting op basis van zuurstof-afhankelijke Afschrikken van Fosforescentie

Het doel is om de mitochondriale redox toestand van geïsoleerde harten te volgen in het kader van fysiologische preload en afterload druk. Een biventriculaire werken konijn hart model wordt gepresenteerd. Hoge resolutie tijdruimtelijke fluorescentie beeldvorming van NADH wordt gebruikt om de mitochondriale redox staat epicardiale weefsel volgen.

NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

Source: Nishimura, C. et al. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (2016). This video demonstrates the in vivo visualization of cortical capillaries in the mouse brain using two-photon microscopy. It outlines the steps for injecting a fluorescent dye into an anesthetized mouse with a thin-skull cortical window, preparing the setup for imaging, and acquiring detailed images of brain...

 Two-Photon Microscopy for In Vivo Imaging of Mouse Brain Microvasculature 

Source: Ouyang, Y., et al. Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a technique to assess cerebral hypoxia injury via simultaneous positron-emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI). An anesthetized mouse undergoes common carotid artery (CCA) ligation, reducing blood flow to one brain hemisphere and predisposing it to hypoxia-induced injury. PET and MRI imaging evaluate glucose metabolism and structural...

Imaging Brain Damage Induced by Cerebral Hypoxia-Ischemia in a Mouse Model

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Hersenbeschadiging als gevolg van cerebrale ischemie kan niet-invasief worden gevisualiseerd en bestudeerd bij ratten met behulp van preklinische positronemissietomografie gekoppeld aan de injecteerbare radioactieve sonde, 18F-fluorodeoxyglucose. Verder verhogen de moderne softwaretools, waaronder hersentemplates voor volume van belang (VOI), aanzienlijk de kwantitatieve informatie die uit deze studies wordt verkregen.

Niet-invasieve beeldvorming en analyse van cerebrale ischemie in Living Ratten met behulp van positron emissie tomografie met<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG

De hier gepresenteerde methode gebruikt simultane positron emissie tomografie en magnetische resonantie beeldvorming. In de cerebrale hypoxie-ischemie model, dynamische veranderingen in diffusie en glucosemetabolisme optreden tijdens en na beschadiging. De evoluerende en reproduceerbare schade in dit model vereist gelijktijdige aankoop als zinvolle multimodale beeldvorming gegevens moeten worden verworven.

Gelijktijdige PET / MRI beeldvorming Tijdens Mouse Cerebral hypoxie-ischemie

Dit document beschrijft een methode waarmee de vasculaire architectuur in de hersenen kan worden gekwantificeerd met behulp van in vivo en ex vivo twee-foton microscopie.

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Leer microregionale hypoxie detecteren in de hersenschors van muizen met twee-fotonbeeldvorming van endogene NADH-fluorescentie. Deze methode biedt hoge resolutie voor het analyseren van weefselzuurstoftoevoer in vivo.

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

Meer video's verkennen