Name: Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer eiwit-eiwitinteracties detecteren in planten met behulp van het BiFC-systeem met split YFP en Gateway-kloontechniek. Deze methode maakt real-time visualisatie mogelijk in levende plantencellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Vi Nguyen voor het lezen van het manuscript en de algemene lab hulp.

1. Voorbereiding van Agrobacterium cultuur <ol><li> Agrobacterium stam GV3101 eerder getransformeerd met Gateway compatibele BiFC vector pEarleyGate201-YC en pEarleyGate202-YN, elk met een fusie construct van Indiase overheid. </li><li> Inoculeren een 5-ml YEB (5g L -1 Beef-extract, 1 g L -1 Gistextract, 5g L -1 Peptone, 5g L -1 Sucrose, 2mm MgSO 4, pH 7,2) cultuur van BiFC fusie-eiwit constructen getransformeerd Agrobacterium met de geschikte antibioticum selectie. 'S nachts groeien cultuur bij 28 ° C schudden bij 200 rpm. </li><li> Verwijder 1 ml van de cultuur in een steriele 1,5 ml centrifugebuis. </li><li> Pellet-cellen bij 1.000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gooi supernatans. </li><li> Was de pellet door het toevoegen van 1 ml van infiltratie media (5 g L -1 D-glucose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosyringone) 11. Resuspendeer pellet door pipetteren, pellet-cellen opnieuw bij 1.000 g gedurende 10 minuten. </li><li> Herhaal de wasstap nog twee keer. </li><li> Resuspendeer de pellet in 0,5 ml infiltratie media. </li><li> Meet de absorptie bij 600 nm en stel laatste OD 600 tot 1.0 naar 1.2. </li><li> Aliquot een gelijke hoeveelheid van Agrobacterium opschorting van elk construct in een nieuwe 1,5 ml tube, vortex voor 10 sec. Voor een enkele infiltratie, 100 pi van elk construct is meer dan genoeg. </li><li> De agrobacterium mengsel is nu klaar voor infiltratie. </li></ol> 2. Infiltratie <ol start="11"><li> N. benthamiana planten worden gekweekt bij 21 ° C, met 16-h licht en 8 uur donker cycli. Vijf tot zes weken oude planten moeten worden gebruikt voor infiltratie. </li><li> Verwijder planten uit de groei kamer en plaats onder wit licht voor een uur voor infiltratring waardoor de huidmondjes volledig te openen. </li><li> Het opstellen van geresuspendeerd agrobacterium mengsel in een 1-ml slip-tip tuberculine spuit zonder naald. </li><li> Plaats het uiteinde van de spuit tegen de onderzijde van het blad en voorzichtig op de zuiger, terwijl direct ondersteuning van de bovenkant van het blad met een vinger. De vloeistof zal diffunderen door het blad als het vult de mesophyllar luchtruimten. </li><li> Label de geïnfiltreerd gebied met een marker pen voor toekomstige identificatie. </li><li> Bij het infiltreren met verschillende constructen, zorg ervoor dat beide veranderen je handschoenen of ze schoon met 70% ethanol tussen infiltraties. Indien mogelijk, laat een hoofdnerf ruimte tussen de verschillende monsters om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Plaats planten in een kast groei in normale groeiomstandigheden. </li></ol> 3. Observatie van de gereconstitueerde YFP-signaal <ol start="18"><li> Accijnzen een 5mm x 5mm segment van bladweefsel binnen de zone geïnfiltreerd </li><li> Monteer de steekproef, in het water, op een glazen microscoopglaasje, het monster te bedekken met een dekglaasje en onderzoekt de interacties met behulp van een confocale of fluorescentie microscoop. </li><li> Uitdrukking moeten gecontroleerd worden elke 24 uur vanaf de tijd van infiltratie maximaal 5 dagen later als overexpressie / handel kan resulteren in een tl-fusie-eiwitten het weergeven van verschillende locaties over een tijdsverloop. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van eiwit-eiwit interacties getest door BiFC assay is weergegeven in figuur 1. AtTHP1 en AtSAC3A worden verondersteld om onderdelen van de Arabidopsis homoloog van gist TREX-2 complex. Ze kan interageren met een nuclearporin AtNUP1 en faciliteren mRNA export 10. AtTHP1 en AtSAC3A werden gekloneerd in pEarlyGate201-YC, terwijl AtNUP1 werd gekloneerd in pEarlyGate202-YN. De constructen werden vervolgens omgezet in GV3101. De drie concepten werden gekoppeld met drie mogelijke combinaties (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) voor infiltratie. De gereconstitueerde YFP signaal werd waargenomen onder een LCSM 48 uur na infiltratie. De signalen werden waargenomen in de epidermale cellen en gelokaliseerd in de nucleaire periferie of nucleaire plasma, die in overeenstemming is met de sub-cellulaire lokalisatie van deze eiwitten. De negatieve controles toonde geen YFP signaal. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Arabidopsis TREX-2 mRNA export complexe componenten met elkaar interageren. N. benthamiana bladeren, co-getransformeerd met constructies van RVI gefuseerd aan pEarleyGate201-YC en pEarleyGate202-YN (zoals aangegeven), werden afgebeeld 48-72 uur na infiltratie, het gebruik van een Leica TCS SP2 confocol microscoop. Beelden worden weergegeven als samengevoegd confocale YFP en bright-field beelden van de epidermale N. benthamiana bladcellen

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

BiFC assay is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit interacties. In tegenstelling tot de traditionele Y2H test, BiFC kunnen niet alleen de visualisatie van eiwit-eiwit interacties, maar geeft ook meer informatie van het eiwitcomplex, zoals sub-cellulaire lokalisatie. Ook is het mogelijk om indirecte interacties te detecteren zo lang als de twee kandidaat-eiwitten kan dichtbij genoeg worden gebracht door een derde partner. Net zoals elke technologie, BiFC heeft zijn beperkingen. Als gevolg van de eis van ...

<table><tbody><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES-hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>1 mL tuberculinespuit met slip-tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van eiwit interacties in plant met behulp van een gateway-compatibele bimoleculaire fluorescentie complementatie (bifc) systeem

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We hebben een BiFC techniek om de interactie tussen twee eiwitten in vivo testen. Dit wordt bereikt door het splitsen van een geel fluorescerend eiwit (YFP) in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van interesse. Deze constructen kunnen vervolgens worden omgezet in co-Nicotiana benthamiana via Agrobacterium gemedieerde transformatie, waardoor de doorvoer expressie van fusie-eiwitten. De reconstructie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten interageren 1-7. Voor het testen en valideren van de eiwit-eiwit interacties, kunnen BiFC worden gebruikt in combinatie met de gist twee-hybride (Y2H) test. Dit kan detecteren indirecte interacties die kunnen worden over het hoofd gezien in de Y2H. Gateway-technologie is een universeel platform dat onderzoekers in staat stelt om de pendelbus van het gen van belang (GOI) in zoveel expressie en functionele analyse systemen mogelijk 8,9. Zowel de oriëntatie en het lezen van frame kan worden onderhouden zonder gebruik te maken van restrictie-enzymen of ligatie tot uitdrukking-ready klonen te maken. Als gevolg daarvan kan men elimineren van alle re-sequencing stappen om consistente resultaten in de gehele experimenten. We hebben een reeks van Gateway compatibele BiFC en Y2H vectoren die onderzoekers met eenvoudig te gebruiken tools om zowel BiFC en Y2H assays 10. Hier laten we zien het gemak van het gebruik van onze BiFC systeem om eiwit-eiwit interacties in N.-test benthamiana planten.

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

We hebben een BiFC-techniek ontwikkeld om de interactie tussen twee eiwitten in vivo te testen. Dit wordt bereikt door een geel fluorescent eiwit te splitsen ...

Om de interactie tussen twee eiwitten te testen, moeten de twee genen van belang in onze BF- en vectoren worden gekloond met behulp van de gateway-cloningtechniek. Deze constructen worden getransformeerd in aerium GV 3 1 0 1. De GV 3 1 0 1 bacteriële culturen die de constructen bevatten, worden gemengd en samen geïnfiltreerd in de bladeren.Indien de twee kandidaate eiwitten met elkaar interageren, kan het YFP-signaal worden waargenomen met behulp van outcome focal Mexico. Het hoofddoel van de BFC-techniek is het testen van de interactie tussen twee eiwitten. Bij vavo hebben we een reeks gateway-compatibele BFC- en IS-two-hybrid-vectoren ontwikkeld, die onderzoekers voorzien van gebruiksvriendelijke instrumenten voor het uitvoeren van zowel BFC- als ISTO-two-hybrid-assays.In deze video gaan we de eenvoud van het gebruik van ons BFC-systeem demonstreren. Om eiwit-eiwitinteracties in een unbe-manier transcend-expressiesysteem te testen, moet u eerst de GV 3 1 0 1 bacteriële cultuur voorbereiden.Selecteer een enkele kolonie van uw plaat en inoculeer deze in 5 ml YEB-medium met de juiste antibiotica. Schud deze culturen vervolgens gedurende de nacht bij 28 °C. De snelheid is 200 rpm.De

detection-protein-interactions-plant-using-gateway-compatible

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie...

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.

Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Leer eiwit-eiwitinteracties detecteren in planten met behulp van het BiFC-systeem met split YFP en Gateway-kloontechniek. Deze methode maakt real-time visualisatie mogelijk in levende plantencellen.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem (Video) | JoVE Journal

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Meer video's verkennen