Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem
16 september 2011
We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.
Om de interactie tussen twee eiwitten te testen, moeten de twee gene van belang worden gekloond in onze BF- en vectoren met behulp van de gateway-lengtetechniek. Deze constructies worden getransformeerd in aerium GV 3 1 0 1. De GV 3 1 0 1 bacteriële culturen die het construct bevatten, worden gemengd en gecoïnfiltreerd in de bladeren.
Als de twee kandidaat-eiwitten met elkaar interageren, kan het YFP-signaal worden waargenomen met behulp van outcome focal Mexico. Het hoofddoel van de BFC-techniek is om de interactie tussen twee eiwitten te testen. In vavo hebben we een reeks gateway-compatibele BFC- en IS-twee hybride vectoren gemaakt die onderzoekers gemakkelijke te gebruiken hulpmiddelen bieden om zowel BFC- als ISTO-twee hybride assays uit te voeren.
In deze video gaan we de gemak van het gebruik van ons BFC-systeem demonstreren. Om de eiwit-eiwit-interacties op een onbe manier te testen, transcend Expressiesysteem. Eerst moet je de GV 3 1 0 1 bacteriecultuur voorbereiden.
Je moet een enkele kolonie van je plaat nemen en in vijf mannelijke YEB-medium inoculeren met geschikte antibiotica. Daarna moet je deze culturen een nacht bij 28 graden schudden. De snelheid is 200 omwentelingen per minuut.
De bacteriële culturen moeten de volgende ochtend klaar zijn. Zorg ervoor dat de bacteriën zijn overgegroeid. Haal de culturen uit de incubator en breng een mannelijke van elke cultuur over in een steriele 1,5 mannelijke centrifugeerbuis.
Plaats de centrifugeerbuizen in een desktopcentrifuge. Draai de bacteriën gedurende 10 minuten bij 1000 G neer bij kamertemperatuur, gooi het snijsel weg. Bewaak vervolgens de penate door één maaltijd infiltratiemedium toe te voegen en herbeoordeel door een paar keer te peperen.
Herhaal de wasstap nog twee keer. Dit is belangrijk omdat het helpt om de sporen van antibiotica in het bacteriële medium te verwijderen, waardoor je planten na infiltratie verzegeld raken. Na de laatste was, schorten de pallet opnieuw op in 0,5 mannelijke infiltratiemedium metingen vanwege 600 van deze bacteriesuspensies met behulp van een spectrofotometer met behulp van infiltratiemedium als bankcontrole.
Na de OD-meting moet je de OD aanpassen met behulp van infiltratiemedium. De uiteindelijke OD moet tussen de één en 1,2 liggen. Je moet alle bacteriesuspensies bereiden voordat je naar de volgende stap overgaat.
Breng een gelijke hoeveelheid bacteriesuspensies over die overeenkomt met je twee kandidaat-eiwitten en meng ze in een nieuwe 1,5 mannelijke buis. Negatieve bacteriemengsels zijn nu gerelateerd aan infiltreren. Bereid alle combinaties voor en vergeet niet een negatieve controle op te nemen. Je moet vijf tot zes weken code en beste manier planten gebruiken voor infiltratie.
Je kunt de planten uit de groeikamer verwijderen en ze een uur voor de infiltratie op We night plaatsen om de stormaanval te openen. Dit helpt bij het infiltratieproces. Trek ongeveer 100 microliter van de opgeschorte bacteriesuspensie op.
Meng bijna één mannelijke sliptip spuit zonder de naald. Plaats de punt van de spuit tegen de onderkant van het blad. Ondersteun de bovenkant van het kniepje met je vinger.
Druk over het algemeen op de plunjer. Je zou het vloeistof moeten kunnen zien diffunderen door het blad zoals je de Meso dunne luchtruimen voelt. Na infiltratie het geïnfiltreerde aero markeren met een mark pen. Anders, na twee dagen, zul je de geïnfiltreerde A niet kunnen identificeren. Als je met verschillende bacteriemengsels wilt infiltreren, zorg er dan voor dat je je handschoen besproeit met 50% ethanol of je handschoenen verwisselt tussen infiltraties.
Probeer een ruimte van één meter tussen de infiltraties te laten om kruisbesmetting te voorkomen. De PFA-signalen moeten elke 24 uur worden gemonitord vanaf infiltratie tot vijf dagen. Je kunt twee deksels van verschillende maten gebruiken om het monster vast te houden.
Plaats eerst een druppel miniwater op een deksel met een insnijding. Snijd vervolgens een klein stukje mesweefsel in de geïnfiltreerde zone. Probeer de walgelijke ader in het monster te vermijden.
Plaats het gesneden mesweefsel in het water op de glijbaan onder de set en bedek het met een kleinere huidige sleeve en druk voorzichtig. Nu kan het monster onder de Mexico-microscoop worden waargenomen. Hier gebruiken we deze NACA T CSS P twee confocale Mexico om het BIFC-signaal te visualiseren.
Zelfs reguliere geur Mexico kan worden gebruikt. Confocal biedt betere beelden en detecteert zwakke signalen. Je kunt de YFP-parameter gebruiken om de VFC-signalen in dit NCAs P twee systeem te detecteren.
Je kunt eenvoudig op deze YFP-voorinstelling hier dubbelklikken, waardoor de excitatie automatisch wordt ingeschakeld en het emissiedetectiebereik wordt ingesteld. Als je een ander systeem gebruikt, raadpleeg dan de handleiding om de parameters correct in te stellen. Het is onze hoop dat je na het bekijken van deze video de BFCE moet kunnen uitvoeren om eiwit-eiwitinteracties te testen met behulp van het onbe MI Transcend-expressiesysteem.
Je kunt deze procedure ook toepassen op tabak en AY-planten. Onze BFC-vectoren bevatten ook respectievelijk een HA- en flag-tag, zodat je ook co IP kunt uitvoeren om de interacties te valideren indien nodig.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe techniek voor het testen van eiwit-eiwit interacties in planten met behulp van een gesplitste gele fluorescente eiwit (YFP) aanpak. Door YFP fragmenten in frame te klonen met genen van belang, kunnen onderzoekers de YFP reconstituitie observeren, wat duidt op eiwitinteracties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Eiwitinteracties
- Fluorescente eiwittechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het verduidelijken van biologische processen.
- Traditionele methoden zijn mogelijk niet geschikt voor plantensystemen.
- De gesplitste YFP techniek maakt real-time visualisatie van interacties mogelijk.
- Gateway-klonen vergemakkelijkt de constructie van fusie-eiwitten.
Doel van de studie
- Om een efficiënte methode te ontwikkelen voor het bestuderen van eiwitinteracties in planten.
- Om onderzoekers te voorzien van hulpmiddelen voor het uitvoeren van BFC en ISTO twee-hybride assays.
- Om de begrip van eiwitfuncties in plantenbiologie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Klonen van YFP fragmenten in Gateway-compatibele vectoren.
- Transformatie van constructen in Agrobacterium GV3101.
- Co-infiltratie van bacterieculturen in plantenbladeren.
- Observatie van YFP signaal met behulp van microscopie om interacties te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle reconstituitie van YFP signaal duidt op eiwitinteracties.
- Demonstratie van de effectiviteit van de BFC techniek in plantensystemen.
- Verstrekking van gebruiksvriendelijke hulpmiddelen voor onderzoekers.
- Validatie van de methode door verschillende eiwitparen.
Conclusies
- De gesplitste YFP techniek is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitinteracties in planten.
- Deze methode kan verder onderzoek in plantenbiologie vergemakkelijken.
- Toekomstige toepassingen kunnen het verkennen van complexe eiwitnetwerken omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
