Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken en karakteriseren van nieuwe genfuncties door middel van genannotatie via een gecombineerde analyse van metabolietprofilering en co-expressieanalyse. Dit wordt bereikt door een experimenteel ontwerp waarbij de focus ligt op specifieke metabole routes en plantensoorten. Als tweede stap worden analytische benaderingen gebruikt om de volledige metabole route te reconstrueren op basis van de chemische structuren van de gedetecteerde verbindingen.

Vervolgens wordt de structuur van het voorspelde pad geïntegreerd met co-expressieanalyse om kandidaatgenen te beperken, die vermoedelijk wijzen op sleutelgenen van het metabolisme. Uiteindelijk worden resultaten behaald door minimale sets experimenten uit te voeren met efficiënt gebruik van diverse bio-resources om de functionele identificatie van genen te karakteriseren. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we een zeer hoge correlatie van Abosi OID bio cystische genen vonden in de co-expressiedatabase genaamd ate.

Wij beschouwen deze strategie als een van de snelste manieren om nieuwe genfuncties te vinden met behulp van publiek beschikbare databases en een efficiënt gebruik van biologische bronnen. Om met de extractie te beginnen, oogst u het plantmateriaal en bevriest u dit onmiddellijk in vloeibare stikstof. Vermaal het bevroren plantmateriaal tot poeder met een kogelmolen, verdeel het bevroren plantmateriaal in aliquots in een EOR-buis van twee milliliter en voeg vervolgens een metalen kogel aan de buis toe.

Voeg 250 µL extractiebuffer toe per 50 mg monster. De extractiebuffer bevat de interne standaard voor normalisatie. Homogeniseer vervolgens het bevroren poeder gedurende twee minuten met de mengermolen.

Centrifuge het monster bij een frequentie van 25 op 12 000 RPM gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een centrifugefilter. Na een tweede centrifugeerronde wordt de supernatant overgebracht naar een nieuwe einor-buis.

Stel vervolgens de HPLC in door eerst te controleren of de temperatuur van de kolomoven 35 °C is en die van de monsterplaat 10 °C. Stel de condities voor de massaspectrometrie in en controleer de status van het vacuüm en de verwarmde capillaire. Voer een massakalibratie van de MS-detector uit door infusie-injectie van het kalibratiemengsel.

Gebruik de automatische kalibratieapplicatie in de software. Draag vervolgens 50 µL van de extracten over naar een glazen vial. Voer voor HPLC ten minste vijf injecties van extractiebuffer uit voordat de analyse van het eerste monster wordt uitgevoerd, zoals beschreven in de schriftelijke procedure.

Select na het configureren van een massaspectrometrie-analyse-instrument de gegevens die verwerkt moeten worden. Stel een tabel op van de gedetecteerde pieken van belang, in overeenstemming met de stofklasse die in het geschreven protocol wordt weergegeven. Identificeer pieken door co-evolutie met standaardverbindingen en annoteer de gedetecteerde pieken in deze stap met behulp van MS/MS-analyse, literatuur, survey- en metabolietdatabanken.

Voorspellingen over de route moeten worden gebaseerd op de chemische structuren door de enzymatische functie in de metabole route te koppelen. Daarom moeten deze stappen worden uitgevoerd door middel van een precieze piekidentificatie van de gedetecteerde verbindingen. Databases van algemene metabole routes, zoals de KEGG-database en PlantACT, zijn zeer effectief voor het voorspellen van de metabole route van belang.

Om een genenlijst met Arabidopsis-orthologe genen en ID's voor te bereiden, downloadt u eerst een lijst met gen-ID's uit de genomische database. Voeg de Arabidopsis-gen-ID van orthologe genen toe in het geval dat de doelplant geen Arabidopsis is. Stel vervolgens een lijst op van genen in de betreffende signaalroute.

Annotaties van Arabidopsis-routegegevens en genfamiliegegevens zijn beschikbaar op de TAAR-website. Lijsten met Arabidopsis-orthologe genen kunnen vervolgens worden gecombineerd. Voer een co-expressienetwerkanalyse uit door de voorbereide gen-ID-lijst te gebruiken om in de beste database naar de voorspelde route te zoeken.

Controleren van de correlatie van bekende genparen in het betreffende pad. Indien de co-expressiedatabase of genexpressiedatabase niet beschikbaar zijn. In het betreffende plan dient de Arabidopsis co-expressiedatabase te worden gebruikt met een lijst van autologe Arabidopsis-genen.

Bouw vervolgens het raamwerk voor het doel-co-expressienetwerk. Voeg gecorreleerde kandidaatgenen toe op basis van de verbindingen van de bekende genen in het betreffende pad en controleer hun genannotatie in de voorspelde families binnen de verbindingen van dit netwerk om de beste kandidaat te vinden.

De drempelwaarde van de coëfficiënt voor genen moet worden afgestemd op de netwerkstructuur en de dichtheid van gecorreleerde genen. Stel nu een lijst op van genen die kunnen worden beperkt tot die welke gespecialiseerd zijn voor het doelpaden. Controleer met behulp van deze lijst de genexpressie van de organspecificiteiten en stressreacties van de kandidaatgenen.

Begin de integratie van de informatie door goed gekarakteriseerde genen, die zijn gebruikt voor query's in co-expressieanalyses, toe te voegen aan de voorspelde metabole route. Voer een literatuurstudie uit om te controleren of de niet-gekarakteriseerde delen van deze route nieuw zijn, inclusief niet-gekarakteriseerde enzymatische stappen, transporteiwitten en transcriptiefactoren. Voorspel op dit punt de meest geschikte genannotatie voor deze ontbrekende, niet-gekarakteriseerde stappen.

Combineer de resultaten van de metabolietprofilering en de kandidaatgenen uit de in silico genexpressie op basis van de voorspelde route. Plaats vervolgens de kandidaatgenen op de voorspelde route op basis van de genfunctie. Bijvoorbeeld: acetyltransferase voor geacetyleerde metabolieten, glycosyltransferase voor glycosiden en P450 voor geoxideerde verbindingen.

Controleer de consistentie van weefselspecificiteiten of stressreacties tussen de accumulatie van metabolieten en het expressieniveau van kandidaatgenen. Controleer daarnaast de verbindingen met andere metabole processen voor de levering van substraten en stress-responsieve genen. Voer als laatste stap een experiment uit voor de identificatie van de genfunctie met behulp van bioresources, zoals een knockout-mutantbibliotheek en een full-length cDNA-bibliotheek.

Hier is een voorbeeld van een co-regulatienetwerkanalyse van de anthocyanine-route. Co-expressieanalyses werden uitgevoerd met de PRAM co-expressie-index op basis van de dataset van toegevoegde versie drie met het PX-programma, weergegeven als rode knopen; 12 anthocyanine-enzymatische genen en twee transcriptiefactoren voor anthocyanineproductie werden gebruikt voor het zoeken naar kandidaatgenen. Een co-expressienetwerk, bestaande uit 68 gecorreleerde kandidaatgenen en 14 querygenen, werd gereconstrueerd via een onderlinge koppeling van een set-zoekopdracht met behulp van de PRAM-database, wat resulteerde in T-net outputbestanden die werden getekend met PX-software.

De blauwe knooppunten geven de kandidaatgenen aan die correleerden met anthocyaninegenen na hun ontwikkeling. Deze strategie biedt een goede aanwijzing om nieuwe genfuncties in plantmetabolismen te voorspellen.