Name: Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Ontdek genannotatie bij planten door metabolietprofilering en co-expressieanalyse te combineren. Deze methode identificeert kandidaatgenen voor metabole routes met behulp van HPLC en netwerkanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken prof. Kazuki Saito in RIKEN PSC en Dr Bjoern Usadel in MPIMP voor nuttige discussies. TT wordt ondersteund door een beurs van de Alexander von Humboldt Stichting.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Plantaardige materialen worden geoogst en direct ingevroren. </li><li> Ingevroren plantaardige materialen gemalen door mixer molen (of mortel) en opgeslagen in Falcon buis of eppendorfbuisje bij -80 ° C. </li></ol> 2. Extraction voor de metaboliet Profiling <ol><li> Aliquot bevroren plantmateriaal in een 2 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 5 pi extractiebuffer milligram versgewicht bevroren plantmateriaal. </li><li> Voeg een metaal (of gilconia) kogel en gehomogeniseerd bevroren poeder met de mixer Mill 2 min bij 25 ls -1. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 rpm. </li><li> Breng de bovenstaande aan centrifugaalfilter NANOSEP. </li><li> Centrifugeer 2 min bij 4.000 tpm. </li><li> Breng de bovenstaande nieuwe Eppendorf buis en bewaren bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 3. Metaboliet Profilering van LC-MS <ol><li> Stel HPLC en controleer de temperatuur van kolom oven en monsterhouder. </li><li> Stel MS conditie en controleer de staat van vacuüm-en verwarmings-capillair. </li><li> Voer m / z kalibratie van MS detector. </li><li> Overdracht van 50 pi van extracten glazen flesje voor LC-MS. </li><li> Injecteer 5 ul van extracten naar LC-MS. </li></ol> 4. Data-analyse <ol><li> Configureren Xcalibur of Metalign 4 en selecteer de data-analyse te verwerken. </li><li> Maak een tabel van de gedetecteerde pieken van uw interesse in overeenstemming met de klasse verbindingen in tabel I. </li><li> Identificeer pieken door co-elutie van standaard verbindingen. </li><li> Aantekeningen voorzien gedetecteerd pieken met behulp van MS 2 analyse, literatuuronderzoek, metaboliet database (figuur 2, 12,13). </li></ol> 5. Voorspelling van metabolische route <ol><li> Construct een mogelijke ingang met gedetecteerde verbindingen. Voorspelling van pad met piek aantekeningen moet worden gebaseerd op de chemische structuur van de gedetecteerde verbindingens door het voorspellen van het koppelen van enzymatische functies op de metabole route 13. Het structureren van biosynthetische stappen moeten worden uitgevoerd met nauwkeurige piek annotatie. Maar bepalen gedetailleerde chemische structuur, bijvoorbeeld glycaangedeelte is niet noodzakelijk deze stap, door voorspelling van suiker gedeelte en adductiestand zeer moeilijk te identificeren door MS-analyse. Bepaling van het soort suiker, zoals hexoside en pentoside zullen geïdentificeerd worden door enzymatische assay van suiker donor bij de laatste stap van het project. Meestal bouw van de voorspelling van de weg dient te worden uitgevoerd als kleine molecule is intermediair van grotere moleculen, behalve in de enkele gevallen, zoals uitdroging reactie. Lijst van atomaire molecuulgewicht, bijvoorbeeld 16 m / z tussen-H en-OH groep (oxidatie) 14 m / z (koolstofatoom) voor verschil-OH en-OMe (methylering) en 162 m / z ( MW-H 2 O) voor hexose (glycosylering), is nuttig voor het voorspellen. Bepaling vanwijziging type met correlatie analyse van weefsels specifieke helpt voorspelling van de metabole route. Database van de algemene metabole route, zoals KEGG database ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) en PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), is zeer effectief voor het voorspellen van metabole route van uw interesse. </li></ol> 6. Voorbereiding van Gene Lijst met Arabidopsis orthologe Gene ID <ol><li> Download gen ID-lijst van genomische database. </li><li> Voeg Arabidopsis gen ID van orthologe gen, in het geval van uw doelgroep plant is niet Arabidopsis. </li><li> Maak een lijst van genen in je pad-of-interest. Annotatie van Arabidopsis pad gegevens en gen-familie gegevens beschikbaar zijn in TAir website ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Als u een lijst opgesteld van Arabidopsis orthologe genen, kunt u vervolgens combine ze. </li></ol> 7. Co-uitgedrukt Gene Analysis <ol><li> Test het bereide gen ID-lijst om de beste database voor je pad zoeken op het controleren van de correlatie met behulp van bekende gen-paren in je pad-of-interest (Tabel II). Als co-expressie database of genexpressie-database zijn niet beschikbaar in de plant van uw interesse, moet Arabidopsis co-expressie-database worden gebruikt met een lijst van Arabidopsis orthologe genen. Bij gerst, rijst kan, populier, tarwe, soja Medicago en co-expressie analyse van plantensoorten worden (Tabel II). </li><li> Bouw het kader voor uw doelgroep co-expressie netwerk op basis van de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest. </li><li> Voeg gecorreleerde kandidaat-genen (r &lt;0,4 ~ 0,90, binnen de geschatte waarde van de coëfficiënt waarde tussen de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest) en controleren hun gen-annotatie in uw predicted families om de aansluitingen van dit netwerk voor het vinden van de beste kandidaat-genen (figuur 3). Drempel van de coëfficiënt de waarde moeten worden gecoördineerd op basis van netwerkstructuur en de dichtheid van gecorreleerde genen. </li><li> Maak lijst van genen die je in staat bent om in te perken als gespecialiseerde om uw doelgroep pad. </li><li> Controleer genexpressie van het orgel specifieke kenmerken en stress responsen van uw kandidaat-genen. </li></ol> 8. Integratie van alle informatie naar New Pathways Voorspel <ol><li> Voeg goed gekarakteriseerde genen die zijn voor de zoekopdracht van de co-expressie-analyse gebruikt om de voorspelde metabole route. </li><li> Controleer ongekarakteriseerde delen in deze route, bijvoorbeeld ongekarakteriseerde enzymatische stappen, transport eiwitten en transcriptiefactoren. </li><li> Voorspel het meest geschikt gen annotatie voor deze ontbrekende ongekarakteriseerde stappen. </li><li> Combineer de resultaten van de metaboliet profilering en kandidaat-genen van in silico gene expressie gebaseerd op de voorspelde route. </li><li> Regel uw kandidaat-genen op het voorspelde pad op basis van gen-functie, bijvoorbeeld, acetyltransferase voor geacetyleerde metaboliet, glycosyltransferase voor glycoside, P450 voor geoxideerd verbinding. Fylogenetische bomen analyse van aminozuursequenties is bruikbaar voor enkele brede genfamilie zoals P450 en glycosyltransferase. </li><li> Controleer de consistentie van weefsel specifieke kenmerken of stress responsen tussen metaboliet accumulatie en gen-expressie niveau van de kandidaat-genen. </li><li> Controleer de verbindingen met andere stofwisseling voor het leveren van substraat en stress responsieve genen. </li></ol> 9. Experimenten voor Gene Identificatie Met behulp van Bio-middelen <ol><li> Controleer de beschikbaarheid van Bioresources biedt om te experimenteren voor de kandidaat-gen identificatie. </li><li> Voer een experiment voor de identificatie van gen-functie met behulp van biologische rijkdommen, zoals KO mutant bibliotheek en volledige lengte cDNA bibliotheek. Thij experimenten voor functionele identificatie van genen met de voorbereiding van overexpressie planten en knock-out mutanten, enzymatische assay en promotor bindingstest, moeten worden uitgevoerd voor de beste kandidaat genen in je voorspelling. Recombinant eiwit assay voor de karakterisering van eiwit eigenschappen en bereiding van overexpressie planten beter worden uitgevoerd na bevestiging van metabolietenprofiel met KO mutant door het in aanzienlijk langer recombinant eiwit en gen klonen voorbereiden transformatie. </li></ol> 10. Representatieve resultaten De procedure van de geïntegreerde analyse beschreven in dit protocol heeft vele mogelijkheden, afhankelijk van specifieke experimentele doel en de keuze van biologische en analytische combinaties. Keuze van de procedures en de experimentele opzet moet worden goed uitgevoerd, op basis van uw doelgroep pad, verbindingen en plantensoorten. De integratie strategie beschreven in dit protocol is foc gebruikt op annotatie van plantaardige gen functie en de ontdekking van nieuwe genen functies met een efficiënt gebruik van verschillende bio-en data-bron. Verwachte resultaat is beloofd te voorzien van de enige geval van sluitende voorspelling. Dit feit geeft aan dat als er genoeg bewijzen kunnen niet worden gegeven door combinatie profielen, experiment niet worden gestart. Daarom in alle gevallen kunnen extra voorafgaandelijke zoals gerichte genexpressie door RT-PCR, ondersteunen de voorspelling van genfunctie. Nauwkeurigheid en juistheid van de voorspelling correleert hoger, afhankelijk van kwalitatieve verschil en het aantal van de variatie van combinatie. Daarnaast kunnen goede kandidaten en geldige resultaten alleen afkomstig zijn van nauwkeurige voorspelling van routes. Peak annotatie moet worden uitgevoerd door een combinatie van verschillende manieren, bijvoorbeeld literatuuronderzoek, referentie plantenextract, MS n analyse, orgel specificiteit en mutant analyse 13. 1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/&gt; Figuur 1. Overzicht van de experimentele stroom van gen-annotatie via gecombineerde aanpak. In sommige gevallen, projecten te beginnen met de ontdekking van een nieuwe piek die wordt gedetecteerd in bijzondere voorwaarden of weefsels, en de wens om haar rol te begrijpen binnen het metabolisme. In andere gevallen het doel van het project is genidentificatie of ontdekking van belangrijke regulerende factoren, zoals de transcriptiefactoren. Ontwerp van experiment worden geschaafd een gegevensverzameling die duidelijk verschillen van metabolietniveaus in het doelgebied pad met een breed scala van weefselmonsters van verschillende organen toont, en differentieel gekweekte planten of planten die aan stress, en het onderwerpen van het materiaal metaboliet profilering. Mutanten en transgene planten en QTL onderdak fokmateriaal vertegenwoordigen ook geschikt genetisch materiaal voor deze studies. Voorspelling van nieuwe pad moeten zorgvuldig worden uitgevoerd met nauwkeurigepiek annotatie en combinatie aanpak met verschillende soorten metabolotype zoals orgel effecten en stress responsen op basis van genexpressie gegevens van uw pad-of-interest. In de laatste stap moet metaboliet en transcript profilering uitgevoerd worden die uiteindelijk, in combinatie met in silico analyse van web-middelen en de in vitro karakterisatie van genexpressie via heterologe expressie, leiden tot de bevestiging van het gen kandidaat en opheldering van de functie en positie binnen een metabole route. Afkortingen: QTL, kwantitatieve Trait Loci. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Werk stroom van combinatievormen aanpak voor piek annotatie. Een procedure voor piek identificatie en annotatie door de standaard verbinding, vergelijking van de wild-type en knock-out mutanten, multi-dimensionale massaspectrometrie van de doel-piek verwijst naar de massa spectra van de zuivere compond uit de databases 12. Afkortingen: DB, database, KO, knock-out, 1-D, een-dimensionale, 2-D, twee-dimensionale, NMR, nucleaire magnetische resonantie, IR, infra-rood; MS n, massa-massa spectrometries. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voorbeeld co-regulering netwerk analyse van de anthocyaan pad. Coëxpressie analyses werden uitgevoerd met behulp van de PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) gebaseerd op de dataset van ATTEDII versie 3 8,2 met de Pajek programma ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Positieve correlaties (r &lt;0,5) worden gebruikt om netwerk verbindingen te maken. Rode knoop: twaalf anthocyaan enzymatische genen (At5g13930, CHS, TT4, chalconsynthase, At3g55120, CHI, TT5, chalcon isomeriseren, At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoïde 3'-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoïde 3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reductase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidine synthese; At4g14090, A5GT, anthocyaan 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, vermeende anthocyaan 3 - O-glucoside 2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyaan 5 - O-glucoside 6'' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyaan 3 - O-glucoside 6 "- O - p-coumaroyltransferase) en twee transcriptiefactoren voor anthocyaan productie (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) werd gebruikt voor het zoeken van kandidaat-genen kandidaat-genen werden gevonden door een "kruispunt van de sets" zoeken met een drempelwaarde met een coëfficiënt van r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 bevraagd door de kruising van de sets door bevraagd alle genen (Veertien anthocyaan biosynthetische genen). Een co-expressie-netwerk, inclusief gecorreleerde kandidaat-genen (68 genen) en bevraagd genen (14 genen), werd opnieuw gebouwd door een "interconnectie van sets" zoeken met r&gt; 0.50 met behulp van de PRIME-database. De output bestanden die zijn geformatteerd met bestand een. 'Net' van de Eerste database en netwerken werden getekend met behulp van Pajek software. Blauwe knooppunt geeft aan kandidaat-genen die correleren met anthocyaan genen. <table border="1"><tbody><tr><td> soorten </td><td> Belangrijke secundaire metaboliet </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolaat, flavonol, anthocyaan, sinapoyl afgeleide </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, anthocyaan, salicylaat afgeleide </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, anthocyaan, tannine, stilbeen </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, anthocyaan, glycoalkaloid, chrologenate verwante, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonol, anthocyaan, nicotianamide, chrologenate verwante, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, anthocyaan, sterol derivaten </td></tr><tr><td> Zea kan </td><td> Glycoflavone, anthocyaan, benzoxazinone, sterol derivaten </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavonen, anthocyaan, saponine, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavonen, flavonol, anthocyaan, saponine, </td></tr></tbody></table> Tabel I. De belangrijkste secundaire metabolieten in model plantensoorten. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-expressie-database </td><td> Adres </td></tr><tr><td> Plant kruis specs </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Plantensoorten </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIMe </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Rice Array Database </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabel II. Beschikbaar genexpressie-database voor het in silico co-expressie analyse.

<ol><li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li>
<li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMe%3A+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Silico+Biol%22%5BJournal%5D)">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li>
<li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li>
<li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li>
<li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li>
<li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlaNet%3A+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li>
<li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li>
<li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATTED-II%3A+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li>
<li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoP%3A+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li>
<li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li>
<li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana%3A+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics%3A+A+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genetic+diversity%2C+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li>
<li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, Forthcoming (2011).</li>
<li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+storage+metabolome%3A+profiling+the+barley+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li>
<li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Gezien het feit dat transcriptomics en metabolomics technologieën zijn gebruikt voor enkele jaren het proces van data-integratie voor metabolomics bijgestaan ​​gen annotatie begint meestal met de identificatie van een nieuwe piek vertegenwoordigt een onbekende metaboliet. Dit feit leidt tot de volgende fase, die is het evalueren van kwantitatieve variatie in metaboliet pieken of de nieuwe kandidaat-genen dacht verantwoordelijk te zijn voor hun biosynthese. De strategie beschreven in dit protocol, echter, heeft drie grote problemen i) moeilijke piek annotatie, ii) de complexiteit van de route voorspelling, iii) de resolutie van gen-informatie en de kwaliteit van genexpressie data. Om het eerste probleem tegen te gaan, moet piek annotatie worden uitgevoerd met co-elutie van standaard verbindingen of combinatoriële benadering gebruik te maken van informatie uit MS n analyse, referentie-extract, mutant-analyse, metaboliet database en literatuuronderzoek (figuur 2, 12). Voor sWEEDE probleem, pad voorspelling alleen worden verkregen door de juiste piek annotatie. Echter, metaboliet profilering van weefsel specificiteit kan ook ondersteuning piek annotatie, want metaboliet accumulatie moet worden gecorreleerd met het gen uitingen van gerelateerde genen. Daarom combinatie profielen van verschillende weefsels en de groei-omstandigheden kan nuttig zijn voor deze tweede probleem. Het derde probleem met betrekking tot de resolutie van de genetische informatie is afhankelijk van de voortgang van de sequence data. Bij het model plant zonder voltooiing van genoomsequentie, co-expressie analyse met ortholoog genen in andere planten model nuttig. Gedetailleerde aanpassing vergeleken en stamboom analyse aminozuursequentie kan steunen modelorganismen verbinding met andere soorten. Dit protocol is geschikt voor alle stofwisseling. Het is het meest efficiënt in de analyse van tussen-en secundaire metabolisme die goed worden gekenmerkt te worden onderworpen aan een sterke transcriptionele cCONTROLE 1,5,11,16. In sommige voorbeelden co-expressie analyse geslaagd worden uitgevoerd zwavel assimilatie genen voor β-oxidatie, vertakte keten aminozuursequentie degradatie, chlorofyl verdeling en lysine katabolisme 3 celwand metabolisme 10,7 en lichtsignaal cascade 14. Annotatie van gen-functie via gecombineerde genomics, metabolomics en informatica is niet alleen voor biosynthetische genen en directe regulator van de transcriptie factor, maar ook voor het begrijpen van fysiologische proces en respons (zie voorbeeld figuur 3. 14). Het ontwikkelen van deze aanpak van model planten van het gewas soorten, metabole vergelijking van de in plantensoorten is een krachtige aanpak in een aantal algemene stofwisseling. Als bijvoorbeeld dezelfde samenstelling is gedetecteerd in verschillende planten en sommige ortholoog genen zijn gevonden in deze planten, cross species co-expressie analyse met ortholoog genen voorzien strong ondersteuning voor uw voorspelling. Deze benadering kan worden uitgevoerd in Arabidopsis populier, medicago naast belangrijke gewassen, zoals gerst, rijst, tarwe en soja door co-expressie analyse van plantensoorten (6 PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> , zie voorbeeld 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Gedistilleerd water ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitril (ACN) ULC / MS klasse </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Methanol (MeOH) ULC / MS klasse </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Mierenzuur (HCOOH) ULC / MS cijfer voor vloeistofchromatografie </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Standaard verbindingen </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Lineaire ion trap (IT) ESI-MS systeem Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC systeem Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytische kolom Luna C18 (2), 2,0 mm diameter, 150 mm lengte, 100 een poriegrootte en bolvormige deeltjes van 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotatie van plant functie van een gen via gecombineerde genomics, metabolomics en informatica

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Gezien het steeds groter aantal model plantensoorten waarvoor complete genoomsequenties beschikbaar zijn en de overvloed van biologische rijkdommen, zoals knock-out mutanten, wilde toetredingen en geavanceerde broedpopulaties, is er een stijgende last voor gen-functionele annotatie. In dit protocol annotatie van planten-gen functie met behulp van gecombineerde co-expressie gen-analyse, is metabolomics en informatica voorzien (figuur 1). Deze benadering is gebaseerd op de theorie van het gebruik van target genen van bekende functie om de identificatie van niet-geannoteerde genen waarschijnlijk betrokken zijn bij een bepaalde metabolische proces, met de identificatie van doelverbindingen via metabolomics. Strategieën worden naar voren gebracht voor de toepassing van deze informatie op de bevolking die door zowel de voor-en reverse genetics benaderingen in weerwil van geen van deze zijn moeiteloos. Door logisch gevolg deze aanpak kan ook worden gebruikt als een benadering van onbekende pieken van nieuwe of specifieke se karakteriserencondary metabolieten in de beperkte weefsels, plantensoorten of stress behandeling, die op dit moment is het belangrijke proces tot het begrijpen van planten metabolisme.

Combinatie van genomics, co-expressie gen analyse en de identificatie van doelverbindingen via metabolisme geven gen functionele annotatie.

Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica

Gezien het steeds toenemende aantal modelplantensoorten waarvan volledige genoomsequenties beschikbaar zijn en de overvloed aan bio-bronnen zoals ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken en karakteriseren van nieuwe genfuncties door middel van genannotatie via een gecombineerde analyse van metabolietprofilering en co-expressieanalyse. Dit wordt bereikt door een experimenteel ontwerp waarbij de focus ligt op specifieke metabole routes en plantensoorten. Als tweede stap worden analytische benaderingen gebruikt om de volledige metabole route te reconstrueren op basis van de chemische structuren van de gedetecteerde verbindingen.Vervolgens wordt de structuur van het voorspelde pad geïntegreerd met co-expressieanalyse om kandidaatgenen te beperken, die vermoedelijk wijzen op sleutelgenen van het metabolisme. Uiteindelijk worden resultaten behaald door minimale sets experimenten uit te voeren met efficiënt gebruik van diverse bio-resources om de functionele identificatie van genen te karakteriseren. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we een zeer hoge correlatie van Abosi OID bio cystische genen vonden in de co-expressiedatabase genaamd ate.Wij beschouwen deze strategie als een van de snelste manieren om nieuwe genfuncties te vinden met behulp van publiek beschikbare databases en een efficiënt gebruik van biologische bronnen. Om met de extractie te beginnen, oogst u het plantmateriaal en bevriest u dit onmiddellijk in vloeibare stikstof. Vermaal het bevroren plantmateriaal tot poeder met een kogelmolen, verdeel het bevroren plantmateriaal in aliquots in een EOR-buis van twee milliliter en voeg vervolgens een metalen kogel aan de buis toe.Voeg 250 µL extractiebuffer toe per 50 mg monster. De extractiebuffer bevat de interne standaard voor normalisatie. Homogeniseer vervolgens het bevroren poeder gedurende twee minuten met de mengermolen.Centrifuge het monster bij een frequentie van 25 op 12 000 RPM gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een centrifugefilter. Na een tweede centrifugeerronde wordt de supernatant overgebracht naar een nieuwe einor-buis.Stel vervolgens de HPLC in door eerst te controleren of de temperatuur van de kolomoven 35 °C is en die van de monsterplaat 10 °C. Stel de condities voor de massaspectrometrie in en controleer de status van het vacuüm en de verwarmde capillaire. Voer een massakalibratie van de MS-detector uit door infusie-injectie van het kalibratiemengsel.Gebruik de automatische kalibratieapplicatie in de software. Draag vervolgens 50 µL van de extracten over naar een glazen vial. Voer voor HPLC ten minste vijf injecties van extractiebuffer uit voordat de analyse van het eerste monster wordt uitgevoerd, zoals beschreven in de schriftelijke procedure.Select na het configureren van een massaspectrometrie-analyse-instrument de gegevens die verwerkt moeten worden. Stel een tabel op van de gedetecteerde pieken van belang, in overeenstemming met de stofklasse die in het geschreven protocol wordt weergegeven. Identificeer pieken door co-evolutie met standaardverbindingen en annoteer de gedetecteerde pieken in deze stap met behulp van MS/MS-analyse, literatuur, survey- en metabolietdatabanken.Voorspellingen over de route moeten worden gebaseerd op de chemische structuren door de enzymatische functie in de metabole route te koppelen. Daarom moeten deze stappen worden uitgevoerd door middel van een precieze piekidentificatie van de gedetecteerde verbindingen. Databases van algemene metabole routes, zoals de KEGG-database en PlantACT, zijn zeer effectief voor het voorspellen van de metabole route van belang.Om een genenlijst met Arabidopsis-orthologe genen en ID's voor te bereiden, downloadt u eerst een lijst met gen-ID's uit de genomische database. Voeg de Arabidopsis-gen-ID van orthologe genen toe in het geval dat de doelplant geen Arabidopsis is. Stel vervolgens een lijst op van genen in de betreffende signaalroute.Annotaties van Arabidopsis-routegegevens en genfamiliegegevens zijn beschikbaar op de TAAR-website. Lijsten met Arabidopsis-orthologe genen kunnen vervolgens worden gecombineerd. Voer een co-expressienetwerkanalyse uit door de voorbereide gen-ID-lijst te gebruiken om in de beste database naar de voorspelde route te zoeken.Controleren van de correlatie van bekende genparen in het betreffende pad. Indien de co-expressiedatabase of genexpressiedatabase niet beschikbaar zijn. In het betreffende plan dient de Arabidopsis co-expressiedatabase te worden gebruikt met een lijst van autologe Arabidopsis-genen.Bouw vervolgens het raamwerk voor het doel-co-expressienetwerk. Voeg gecorreleerde kandidaatgenen toe op basis van de verbindingen van de bekende genen in het betreffende pad en controleer hun genannotatie in de voorspelde families binnen de verbindingen van dit netwerk om de beste kandidaat te vinden.De drempelwaarde van de coëfficiënt voor genen moet worden afgestemd op de netwerkstructuur en de dichtheid van gecorreleerde genen. Stel nu een lijst op van genen die kunnen worden beperkt tot die welke gespecialiseerd zijn voor het doelpaden. Controleer met behulp van deze lijst de genexpressie van de organspecificiteiten en stressreacties van de kandidaatgenen.Begin de integratie van de informatie door goed gekarakteriseerde genen, die zijn gebruikt voor query's in co-expressieanalyses, toe te voegen aan de voorspelde metabole route. Voer een literatuurstudie uit om te controleren of de niet-gekarakteriseerde delen van deze route nieuw zijn, inclusief niet-gekarakteriseerde enzymatische stappen, transporteiwitten en transcriptiefactoren. Voorspel op dit punt de meest geschikte genannotatie voor deze ontbrekende, niet-gekarakteriseerde stappen.Combineer de resultaten van de metabolietprofilering en de kandidaatgenen uit de in silico genexpressie op basis van de voorspelde route. Plaats vervolgens de kandidaatgenen op de voorspelde route op basis van de genfunctie. Bijvoorbeeld: acetyltransferase voor geacetyleerde metabolieten, glycosyltransferase voor glycosiden en P450 voor geoxideerde verbindingen.Controleer de consistentie van weefselspecificiteiten of stressreacties tussen de accumulatie van metabolieten en het expressieniveau van kandidaatgenen. Controleer daarnaast de verbindingen met andere metabole processen voor de levering van substraten en stress-responsieve genen. Voer als laatste stap een experiment uit voor de identificatie van de genfunctie met behulp van bioresources, zoals een knockout-mutantbibliotheek en een full-length cDNA-bibliotheek.Hier is een voorbeeld van een co-regulatienetwerkanalyse van de anthocyanine-route. Co-expressieanalyses werden uitgevoerd met de PRAM co-expressie-index op basis van de dataset van toegevoegde versie drie met het PX-programma, weergegeven als rode knopen; 12 anthocyanine-enzymatische genen en twee transcriptiefactoren voor anthocyanineproductie werden gebruikt voor het zoeken naar kandidaatgenen. Een co-expressienetwerk, bestaande uit 68 gecorreleerde kandidaatgenen en 14 querygenen, werd gereconstrueerd via een onderlinge koppeling van een set-zoekopdracht met behulp van de PRAM-database, wat resulteerde in T-net outputbestanden die werden getekend met PX-software.De blauwe knooppunten geven de kandidaatgenen aan die correleerden met anthocyaninegenen na hun ontwikkeling. Deze strategie biedt een goede aanwijzing om nieuwe genfuncties in plantmetabolismen te voorspellen.

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Plantaardige biomassa biedt een hernieuwbare grondstof voor meerdere producten, waaronder brandstof, diervoeders, levensmiddelen en een verscheidenheid aan materialen. In deze paper onderzoeken we de eigenschappen van de boom tabak (Nicotiana glauca) en populier als geschikte bronnen voor een bioraffinage pijplijn.

Transcript en Metabolite Profiling voor de Evaluatie van de Boom en Poplar Tabak als grondstof voor de bio-gebaseerde industrie

Dit artikel beschrijft de toepassing van ongerichte metabolomics, transcriptomics en multivariate statistische analyse om druivenbes transcripties en metabolieten om inzicht te krijgen in het terroir concept, dat wil zeggen, de invloed van de omgeving op bes kwaliteitskenmerken.

De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Dit artikel beschrijft de procedure voor de identificatie en karakterisering van de familie van een gen in grapevine toegepast aan de familie van Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.

Uitgebreide Workflow voor de genoom-brede identificatie en expressie Meta-analyse van de ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familie in Grapevine

Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.

Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

Een massaspectrometrie-geleide genoom mijnbouw protocol is hier vastgesteld en beschreven. Het is gebaseerd op genoomsequentie-informatie en LC-MS/MS-analyse en heeft tot doel de identificatie van moleculen uit complexe microbiële en plantenextracten te vergemakkelijken.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining als een instrument om nieuwe natuurlijke producten te ontdekken

Door de Pathway Association Study Tool (PAST) uit te voeren, hetzij via de Shiny-applicatie of via de R-console, kunnen onderzoekers een dieper inzicht krijgen in de biologische betekenis van hun genoombrede associatiestudie (GWAS) -resultaten door de betrokken metabole routes te onderzoeken.

Een Pathway Association Study Tool voor GWAS-analyses van metabole Pathway-informatie

In dit protocol presenteren we een geoptimaliseerde workflow, die een efficiënte en snelle monstervoorbereiding van veel monsters combineert. Daarnaast bieden we een stapsgewijze handleiding om analytische variaties te verminderen voor high-throughput evaluatie van metabole GWAS-studies.

Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

De ontwikkelde methode van 13C 6-Glucose-etikettering in combinatie met vloeistofchromatografie met hoge resolutie massaspectrometrie is veelzijdig en legt de basis voor toekomstige studies naar de primaire organen en routes die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in medicinale planten, evenals het uitgebreide gebruik van deze secundaire metabolieten.

13 okt.C 6-glucose-etikettering geassocieerd met LC-MS: identificatie van primaire organen van planten in secundaire metabolietsynthese

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Ontdek genannotatie bij planten door metabolietprofilering en co-expressieanalyse te combineren. Deze methode identificeert kandidaatgenen voor metabole routes met behulp van HPLC en netwerkanalyse.

Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica

Meer video's verkennen