Name: Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Leer biophysische technieken om de cross-linkingcapaciteit van tomatencuticula te beoordelen en selectieve verwijdering van epi- en intracuticulaire was te monitoren met behulp van solid-state NMR en atoomkrachtmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation subsidies # MCB-0741914 en de MCB-0843627; extra infrastructurele ondersteuning werd verleend in het City College of New York door National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 van het National Center for Research Resources. We dankbaar erkennen de JKC Rose groep in het Cornell University Plant Biology Department voor het verstrekken van M82 (wild type) en CM15 (mutant) tomaat nagelriemen. Wij danken Dr Spyros Monastiriotis van de CCNY Chemical Engineering groep van prof. Alexander Couzis voor zijn genereuze hulp bij de AFM experimenten. Wij danken mevrouw Lauren Gohara voor grafische vormgeving ondersteuning.

1. Enzymatische Isolatie van Tomato nagelriemen 5 <ol><li> Plaats een aantal commerciële of gekweekte tomaten in een kom. Schil de huid van de vruchten in grote delen en schenk de binnenste vruchtwand weefsel. Was de tomaten skins met gedemineraliseerd water en het behoud van ze onder water in een beker. </li><li> Bereid een 50 mM pH 4,0 natriumacetaatbuffer (bij 31 ° C) waardoor 1,22 g natriumacetaat trihydraat (M r. 136,08 g / mol) en 2,34 ml ijsazijn (17.485 M) in een bekerglas, toevoegen van 200 ml gedeïoniseerd water en de pH op 4,0 bij 31 ° C. Een mengsel met 4 ml pectinase (EC 3.2.1.15, 10 U ml -1 TCI Amerika), 0,2 g cellulase (EG 232.734.4; 1,3 eenheden / mg vast, Sigma Aldrich) en 13 mg NaN3, en voeg 196 ml natriumacetaat buffer om het enzym mengsel 200 ml van de uiteindelijke enzymcocktail verkrijgen. 5 volledig de gepelde tomaten huid in de enzymcocktail dompelen en incubeerbij 31 ° C gedurende 24 uur met constant schudden (G24 Environmental incubator Shaker New Brunswick Scientific Co.) </li><li> Verzamel de tomaat huiden met behulp van een keuken zeef of Büchner trechter en hen met gedeïoniseerd water wassen. Daarna plaatst deze in een vacuümoven bij kamertemperatuur gedurende een uur. Bewaar de gedroogde tomaat vellen in een gemerkte en afgedekt fles voor de volgende ontdoen procedures. </li></ol> 2. Uitputtend was ontdoen door Soxhletextractie 6 <ol><li> De apparatuur die wordt gebruikt voor het volledig ontdoen bestaat uit een warmtebron (verwarming mantel en Variac controller), kolf met ronde bodem voor een oplosmiddel reservoir, Soxhletapparaat gesinterd glas vingerhoed of wegwerp extractiehuls, anti-stoten chips en een condensor (zie Fig. 1). Merk op dat de smalle sifon arm (delen 6 en 7 in figuur 1). Is zeer gevoelig en vatbaar voor breuk, die zorgvuldig gehanteerd. </li><li> Doe 0,5-1 g van tomaat huid (verkregen instap 1.) in een vijzel, en maal het monster tot een grof poeder met een stamper, tenzij de monsters dienen te worden gebruikt voor het AFM-metingen (hoofdstuk 5). Vul een gesinterd glas of wegwerp vingerhoed ongeveer halverwege met het monster en gebruik maken van een pincet voorzichtig plaats deze aan de basis van de extractie kolom. </li><li> Bevestig de condensor en wikkel het met aluminiumfolie. Verwarm de methanoloplosmiddel (ACS grade) in aanwezigheid van een paar kooksteentjes chips de kook zacht en refluxes op de wanden van de kolf. Bedek het oplosmiddel reservoir met zowel glaswol en aluminium folie. Controleer het proces voor een uur, komt voor het aanpassen van de Variac voltage, zodat het reservoir zich ophoopt ongeveer een druppel per seconde en overheveling binnen het soxhletapparaat wanneer de vingerhoed vol is. </li><li> Ga door de extractie proces voor 12 uur, dan laat de verwarmingsmantel en laat het apparaat afkoelen. Verwijder de afzuigkap en het reservoir als een geheel te ontdoen van het oplosmiddel. Gebruik tweezers aan de vingerhoed tot net onder de hals van de extractiekolom te verhogen, afvoer overtollige oplosmiddel uit het, en plaats de huls op een schoon oppervlak. Kantel de extractiekolom te laten hevelen in de kolf hieronder. Koppel de kolf en giet het afval in een bestemde afvalbak oplosmiddel opvangbak. </li><li> Herhaal stap 2.3 en 2.4 opeenvolgende oplosmiddelen geleidelijk afnemende polariteit, zoals chloroform en hexaan gedurende 12 uur in elk geval. </li><li> Laat de tomaat cutine monster drogen in de huls, door blazen een stroom stikstofgas over het of door het in een vacuümoven bij kamertemperatuur. Tenslotte meten massa van de monster en het op kamertemperatuur in een afsluitbare pot afgesloten met parafilm. </li></ol> 3. Selectieve Isolatie van Epicuticular en Intracuticular Wassen 3,4 <ol><li> Was eerst hele tomaten (een afzonderlijke partij van tomaten van die beschreven in 1.) Met gedestilleerd water. Droog ze met papER handdoeken en Kimwipes, en leg ze het gevolg zijn naar beneden op een stuk aluminiumfolie. </li><li> Verf de hele tomaten met 120% (w / w, massa-ratio) arabische gom waterige oplossing in een top-down mode en laat ongeveer een uur voor de Arabische gom om te drogen op de huid van het fruit, waardoor een dunne film. Verwijder deze film met een pincet, zorg dat u doorboren de tomaat huid. Herhaal de procedure nog een keer. </li><li> Voeg de films flacons 1:1 (v / v) chloroform-water mengsel gedurende drie minuten. Na het krachtige agitatie en fasescheiding en pipetteer de chloroformfracties en verdampen ze in aparte ontdekt flacons, waardoor epicuticular was. De tomaten blijft fysiek intact. Dompel ze in chloroform twee minuten bij kamertemperatuur en verzamelen intracuticular was na afdampen van het oplosmiddel. Nu, schil de tomaten en enzymatisch te behandelen (met cellulase en pectinase in natriumacetaatbuffer) om cellulose en pectine respectievelijk te verwijderen (zoals beschreven in <strong&gt; 1). </li><li> Indien gewenst, voert u volledig van was ontdoen van deze enzymatisch geïsoleerde nagelriemen door Soxhletextractie (zie stap 2), met behulp van drie oplosmiddelen van verschillende polariteit (methanol, chloroform, en hexaan, respectievelijk). </li></ol> 4. Moleculaire karakterisering van Tomato Fruit cutine door Cross-polarisatie Magic-angle spinning Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Plaats 4-6 mg van volledig was ontdane tomaten nagelriemen (cutins) in een 1,6 mm fastMAS zirkonia rotor met behulp van de leverancier geleverde verpakking tool. (Ofwel de grond was ontdane tomaten nagelriemen of zeer kleine stukjes van gedeeltelijk was ontdaan nagelriemen zijn geschikt.) Zorg ervoor dat het monster gelijkmatig is verpakt, maar niet te strak, in de rotor. Na het opzetten van de dop, verf de helft van de kap met een zwart-inkt stift om metingen van de spin-tarief te vergemakkelijken. </li><li> Pas de shimming van de NMR-spectrometer voor de minimale spectrale lijnbreedte op halve hoogte eennd kalibreren proton (1 H) en koolstof (13 C) 90 ° pulsbreedten een standaard samenstelling, zoals adamantaan. </li><li> Met behulp van glycine of glutamine als model verbindingen, krijgen een maximale intensiteit van het signaal door het optimaliseren van alle parameters (Hartmann-Hahn matching vermogen, 1 H - 13 C contacttijd, heteronucleair 1 H ontkoppeling sterkte) van de cross-polarisatie magic-angle spinning (CPMAS) experiment. Voor spectra verkregen van een 1 H frequentie van 600 MHz, de aanbevolen omvatten 10 kHz tot 15 kHz spinnen frequentie 3-Sec tussen aankopen en HERNIAVERWIJDERING heteronucleair proton ontkoppeling 7 op een magnetische veldsterkte overeenkomt met een frequentie van 185 kHz. </li><li> Plaats de cutine vol rotor in de cel. Plaats vervolgens de sonde in de magneet. Verhoog het spinnen snelheid tot 10 kHz geleidelijk aan om te controleren op een goede sample verpakking en rotor stabiliteit. Controleer de uiteindelijke draaiende stabiliteit van de rotor binnen± 20 Hz. </li><li> Pas de tuning en bijpassende condensatoren van de sonde iteratief naar minimum vermogen reflectie te bereiken op zowel 1 H en 13 C NMR frequenties. Stel de experimentele temperatuur tot 25 ° C (of kamertemperatuur). </li><li> Start de pre-geoptimaliseerde CPMAS experiment overeenkomt met het Hartmann-Hahn matching toestand vastgesteld op het 10 kHz draaien frequentie. </li><li> Acquire 4096 transiënten, staat het spectrum met exponentiële (Lorentziaans) lijn verbreding van 50-100 Hz, en doe een Fourier-transformatie van een NMR-spectrum van de intensiteit van het signaal ten opzichte van chemische afscherming (ppm) te genereren. </li><li> Referentie de 13 C chemische verschuivingen extern adamantaan ingesteld met op 38,4 ppm (-CH2 - groep) 8 als standaard. </li><li> Verhoog de rotor draaien frequentie tot 15 kHz en herhaal de CPMAS meting (stappen 4,6-4,8) voor de Hartmann-Hahn matching voorwaarde bepaald op dit laatste spinning frequentie. </li><li> Repeop de CPMAS experimenten (stappen 4.1 tot 4,9) met natuurlijke (wasachtige) en gedeeltelijk was ontdane vruchten cuticula monsters. </li></ol> 5. Onderzoek naar de Tomaat Cuticle Oppervlak met Atomic Force Microscopy (digitale instrumenten NanoScope IIIa; procedures zullen enigszins verschillen op de microscopen) 6 <ol><li> Zet de scanning probe microscoop (SPM) (fig. 2) en zorg ervoor dat de microscoop mode schakelaar is ingesteld op het contact Atomic Force Microscopy (AFM)-modus. </li><li> Handmatig verhogen van de SPM hoofd door te draaien aan de twee door de gebruiker instelbare knoppen. Maak de AFM tipholder van de SPM hoofd door het draaien van de klemschroef aan de achterkant van het hoofd. </li><li> Gebruik een pincet om de bestaande AFM cantilever te verwijderen uit de tipholder, dan voorzichtig pak een nieuwe siliciumnitride cantilever (AFM sonde) uit de verpakking en installeren in plaats van de oude cantilever. Gebruik een lichtmicroscoop te controleren of de nieuw geïnstalleerde AFM cantilever niet gebroken is. </li><li> Bevestig ee tomaat cuticula monster (een deel van de gedeeltelijk was ontdane tomaten cuticula ~ 10 mm x 10 mm) op een roestvrij stalen schijf (sample puck) met dubbelzijdig tape. Gebruik een lichtmicroscoop te controleren of de cuticula oppervlak blijft vlak en glad na plaatsing van het monster op de puck. </li><li> Plaats puck de tomaat opperhuid monster op de magnetische gebied op de top van de SPM scanner. </li><li> Zet de voorste twee handmatige aanpassing schroeven van de scanner hoog door te draaien aan de knoppen, stel de gemotoriseerde terug stelschroef tot ongeveer hetzelfde niveau als de andere twee voorste schroeven. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zijn hoog genoeg is om te voorkomen dat het breken van de AFM tip bij het plaatsen van de tipholder in de SPM hoofd. </li><li> Plaats de tipholder in de SPM hoofd en zet deze vast door de klemschroef aan de achterkant van het hoofd. </li><li> Na inschakelen van de laser, lijn de laserspot op AFM uitkraging met de centrale (y) en rechts (x) laserinstelling knoppen op de bovenkant van de kop.Controleer de gereflecteerde laserstraal op een stuk papier de laserspot positioneren precies op het einde van de slede AFM. </li><li> De positie van de beweegbare spiegel iteratief met de fotodetector verstelknoppen maximale signaal (SUM signaal) bereiken, waardoor de gereflecteerde laserstraal wordt gelijkmatig worden ontvangen door de vier kwadranten van de fotodetector. </li><li> Laat de AFM tip door het terugtrekken van de handmatige aanpassing voorste schroeven en de gemotoriseerde rugverstelling schroef van de SPM scanner, visueel toezicht op de aanpak van de AFM tip in de richting van het monster oppervlak met een omgekeerde microscoop. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zijn op hetzelfde niveau te artefacten voorkomen dat beeldvorming een gekantelde monster. Breng de tip in de richting van het monster, maar niet zo dichtbij dat de punt raakt of doorbreekt het monster oppervlak. </li><li> Op dit punt, de laser licht die door de AFM cantilever zal stuiteren de beweegbare spiegel om de fotodetector. Voor het contact AFM mode met een siliconecon nitride AFM tip, is het uitgangssignaal (verticale afbuiging) spanning tot en met -2 V voor een 0 V Setpoint en de DIFF Signaal (verticaal / horizontaal verschil) op 0 V door de positie van de spiegel. </li><li> Met behulp van de NanoScope software, klik op de microscoop en selecteer het juiste profiel (Contact mode AFM). </li><li> Met behulp van de &quot;Scan Controls Settings&quot; paneel, stelt u de scan snelheid en grootte van de scan bijvoorbeeld 10 micron grootte van de scan en 2 Hz scansnelheid. </li><li> Laat de AFM tip om het monster oppervlak gaan door op de nemen-tip icoon. Door het controleren van de gemotoriseerde terug schroef van de SPM basis, zal het programma nu verlagen de punt totdat hij in de steekproef oppervlak. Het scanproces start automatisch zodra de tip heeft met succes ingeschakeld. </li><li> Controleer het scanproces met behulp van zowel beeld en de omvang modi van de software, het aanpassen van parameters zoals setpoint, integrale versterking, proportionele versterking, grootte van de scan, scan rate, lijnen en monsters / lijn iteratief naar de hoogste te bereikenresolutie beelden. Start het scannen met een grote Z-as bereik (data-schaal), dan voorzichtig verlagen van de gegevens schaal waarde voor de beste contrast van oppervlakte-eigenschappen op de afbeelding te observeren. Minimaliseer het optreden van witte gebieden in het gescande beeld, waaruit blijkt dat de hoogte van het oppervlakte-eigenschappen van de beschikbare z-as bereik overschrijdt. </li><li> Leg de afbeelding om het bestand op te slaan, dan verwerkt de gegevens met behulp van afvlakking functies om beeld artefacten als gevolg van verticale (Z)-scanner drift, beeld bogen, en de verticale offset tussen de scan-lijnen te verwijderen; 9 Ten slotte berekent de gemiddelde ruwheid. Na het opslaan van de gegevens, terug te trekken van de AFM tip door het omkeren van de werking van de computergestuurde schroef motor die werd gebruikt om het in te schakelen. Beeldverwerking kan worden uitgevoerd in de offline-modus beeldanalyse en / of met behulp van een andere computer. </li><li> Gebruik de voorste onderste grijze metalen knoppen van de tip houder om de x-en y-posities van de te scannen gebied te wijzigen, dan wordt de meting herhaald op vijf locaties monstergen dat de reproduceerbaarheid te controleren, het vervangen van de AFM cantilever als de beeldkwaliteit achteruit gaat. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Chemische analyse van de verschuiving CPMAS 13C NMR spectra (Fig. 3) die de grote functionele groepen in de limitatief ontparaffineerde tomaat opperhuid (cutine). De belangrijkste koolstof groepen in de cutine biopolyester bleken lange alifatische keten (0-45 ppm), zuurstof alifaten (45-110 ppm) meervoudig gebonden en aromaten (110-160 ppm), en carbonylen (160-220 ppm). De zuurstofrijke alkylresten (CHO + CH 2 O) spelen een cruciale rol bij het ​​vaststellen van covalente verbindingen tussen de monomere eenheden van de cutine biopolymeer, waardoor het vormen van de moleculaire architectuur van de gemiddelde inschakelduur matrix. Verschillen in relatieve piek gebieden waargenomen in het spectrale gebied tussen 45 en 100 ppm suggereren dat de mutant cutine een relatief groot deel van de cross-link vormen CHO structura heeft<html> l groepen vergeleken met het wild-type cutine; voorzichtig kwantitatieve meting met behulp van directe polarisatie (DPMAS) NMR 5 methoden ondersteunen deze gevolgtrekking (gegevens niet getoond). CPMAS 13C NMR spectra werden ook door een geleidelijk afneemt was piek bij 31 ppm (Fig. 4) waarin de opeenvolgende verwijdering van epi-en intracuticular wassen van cutine wax composiet met behoud van de belangrijkste chemische structuur van de cutine biopolymeer. Parallel AFM beeldanalyse (afb. 5) is gebleken onregelmatigheden in het oppervlak als gevolg van de stapsgewijze extractie van epi-en intracuticular wassen van de vrucht nagelriem, betekenende veranderingen in de organisatie van de cuticulair montage. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Figuur 1 Soxhletapparaat (afbeelding bron: Wikipedia). &quot;/&gt; Figuur 2. A) Scanning Probe Microscope. B) SPM hoofd (overgenomen van de AFM training handleiding geleverd door Digital Instruments). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Figuur 3. 150 MHz CPMAS 13 C NMR-spectra van exhaustief was ontdane rode rijpe tomaat fruit nagelriemen (cutins) van wild-type (M82) en mutant (CM15) resonanties te tonen met chemische verschuivingen die overeenkomt met de functionele groepen van een cross-linked hydroxyfatty zuur gebaseerde polyester en een aantal meervoudig gebonden groepen. Alle spectra werden opgenomen met een 10 kHz draaien frequentie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Figuur 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-spectra van commerciële rode rijpe tomaat fruit nagelriemen vertonen veranderingen in de samenstelling na sequentiële verwijdering van epicuticular en intracuticular was door de Arabische gom mechanische afzuiging en een two-minuten chloroform dip, respectievelijk. Alle spectra werden opgenomen met een 15 kHz draaien frequentie. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Figuur 5. AFM beelden en ruwheid schattingen voor het gedeeltelijk ontwast commerciële tomaten opperhuid beschreven in Figuur 4 na de stapsgewijze verwijdering van epicuticular (links) en intracuticular (rechts) was.

<ol><li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+design+of+plant+cuticles%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li>
<li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li>
<li>Jetter, R., Schäffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li>
<li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+%C3%8E%C2%B2-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Botany%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li>
<li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties%2C+but+not+transpirational+water+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li>
<li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li>
<li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li>
<li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li>
<li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li>
<li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters%5BTitle%5D)+AND+%22Solid+State+Nucl.+Mag%22%5BJournal%5D)">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li>
<li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Amer.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li>
<li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li>
<li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin%2C+an+insoluble+plant+polyester%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li>
<li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li>
<li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li>
<li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li>
<li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li>
<li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+a+versatile+tool+in+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).</li>
<li>Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li>
<li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De protocollen beschreven voor gedetailleerde moleculaire en microschaal karakterisering van een complex hardnekkige plantmateriaal mogelijk zonder schadelijke chemische afbraak. Om het mengen van de cutine biopolyester te onderzoeken met verschillende lipiden (was) dat de structurele organisatie van het cuticulair assemblage, 10 hebben we uitgevoerd en bewaakt de procedures voor de selectieve verwijdering van epicuticular en intracuticular wassen van de heterogene cuticulair mix te controleren. Solid-state 13 C NMR werd gebruikt om de extractie van was moleculaire componenten te meten, en atomaire kracht microscopie gediend om gelijktijdige veranderingen in de ruwheid van het oppervlak te onderzoeken. 6,11 Om de verknoping mogelijkheden van cutins vergelijken van gekweekte wild-type en single-gen mutant tomaten, werd solid-state 13 C NMR gebruikt om de relatieve aantallen CHO en CH2 O chemische groepen schatten. Een aantal ontwerp-functies van dit protocol zijn opmerkelijk. Als de was materialen omvatten een groot aantal lipiden, behandeling van het fruit cuticula met een aantal oplosmiddelen met uiteenlopende polariteit essentieel is volledig ontparaffinering bereiken. Bovendien kan ontwassen tijd variëren van 8 tot 24 uur, afhankelijk van de aard van de opperhuid monsters. Om consequent uit te pakken epicuticular wassen van de intacte vrucht cuticula, is het noodzakelijk om de lijm coating gelijkmatig aan op het oppervlak. Halfgeleider CPMAS 13C NMR 12 een snelle kwalitatieve methode om verschillende structurele onderdelen zeer uiteenlopend en onoplosbare vaste biopolymeren behoud van hun oorspronkelijke fysische eigenschappen, 13 traditionele oplossing NMR kan ook worden gebruikt om de geëxtraheerde was mengsels karakteriseren. Als kwantitatieve schatting van functionele groepen is gewenst voor de intacte plant polymeren, 5 high-fidelity direct-polarisatie magic-angle spinning (DPMAS) 13C NMR 5,14 worden gebruikt als complementaire methode. Nauwkeurige kwantificatie van de functionele groepen vereist een zorgvuldige optimalisatie van recycle tijden, excitatie puls lengtes, en de kracht van heteronucleair ontkoppeling. 15 De heteronucleair ontkoppeling kan worden ingesteld voor een 1 H veldsterkte van 50 kHz tot 185 kHz met behulp van de TPPM 16 of HERNIAVERWIJDERING 7 methodieken. Naast deze parameters, de gevoeligheid van CPMAS metingen is afhankelijk van de spin-lock tijd en Hartmann-Hahn bijpassende staat. 15 In plaats van de traditionele CPMAS, kan een oplopende-amplitude CP (RAMP-CP) techniek worden uitgevoerd om het kruis te maximaliseren polarisatie efficiëntie door het variëren van de amplitude 1H lineair (~ 20-50%) of tangentiaal terwijl de amplitude van 13 C veldsterkte constant tijdens de rotatie-lock periode (of vice versa). 17,18 uitvoeren van de metingen op CPMAS ten minste twee verschillende rotor-spinning-frequenties is het noodzakelijk om draaiende zijbanden te onderscheiden van de belangrijkste spectrale pieken. Concurrent AFM metingen uitgevoerd in contact mode mogelijk te maken directe beeldvorming van de cuticula oppervlak conditie met hoge scansnelheden en een hoge resolutie, 19 bijvoorbeeld tijdens sequentiële verwijdering van wasachtige bestanddelen. Operationele AFM tikken (niet-contact) mode kan worden gebruikt als alternatief voor oppervlak karakterisering van delicate &quot;zachte&quot; plantaardige materialen, het vermijden van mogelijke schade door zijdelingse (shear) krachten en schrapen van het monster oppervlak. 5,20 In beide gevallen , opeenvolgende acquisitie van meerdere afbeeldingen van dezelfde plek op het oppervlak dient ter identificatie van elk oppervlak schade als gevolg van &quot;probe-oppervlak-interacties&quot; in AFM-metingen. 6,21 Voor een optimale reproduceerbaarheid, moeten AFM probes met veer constanten geschikt voor zachte cuticulair oppervlakken gebruikt en bestendigheid van temperatuur en vochtigheid te handhaven. 6,15,20 </sup&gt; Overwegende dat vaste-stof NMR een moleculair profiel van ensemble gemiddelde (bulk) eigenschappen in tomaten nagelriemen biedt, atomic force beeldvorming zorgt voor een aanvullende niet-invasieve sonde 22,23 voor het bijhouden van de oppervlakte topografie van deze prachtig complexe macromoleculaire assemblages. 1,2

<table><tbody><tr><td>Natriumacetaat trihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, koelkastbewaring</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 units/mg, koelkastbewaring</td></tr><tr><td>Ijsazijn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Extreem gevaarlijk</td></tr><tr><td>Inkubatorschudmachine</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model No.G24</td><td>MFG No.M1036-000G</td></tr><tr><td>Vacuümoven</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Variac-regelaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gesinterde glazen thimble (85 mm/25mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>wegwerp extractiethimble (80 mm/ 25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Glaswol</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Stikstofgas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Papieren handdoeken</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Gum arabicum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1,6 mm fastMAS zirkoniumrotor</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR-spectrometer</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>standaard bore magneet</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Modelverbinding voor CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Modelverbinding voor CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Voor kalibratie van 90&amp;#x00B0; puls in NMR</td></tr><tr><td>Multimode Scanning Probe Microscoop (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope-software</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Versie 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>AFM-probe (niet-geleidende siliciumnitride tip)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Model NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetische puck</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdige tape</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fruit-schilapparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;chner-trechter</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en biofysische studie van fruit nagelriemen

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

De cuticula, een hydrofobe beschermende laag op de bovengrondse delen van landplanten, fungeert als een veelzijdige defensieve barrière voor verschillende biotische en abiotische stress en regelt ook water vloeien voort uit de externe omgeving. 1 A biopolyester (cutine) en lange-keten vetzuren ( wassen) vormen de voornaamste structurele kader van de opperhuid; functionele integriteit van de cuticulaire laag hangt af van de buitenste &quot;epicuticular &#39;laag en het mengsel bestaande uit de cutine biopolymeer en&#39; intracuticular &#39;was 2 Hierin wij een uitgebreid protocol beschreven. uitputtend uit te pakken was van commerciële tomaat (Solanum lycopersicum) fruit nagelriemen of epicuticular en intracuticular wassen te verwijderen sequentieel en selectief van de cuticula composiet. De methode van Jetter en Schäffer (2001) werd aangepast voor een stapsgewijze extractie van epicuticular en intracuticular wassen van de vrucht cuticula. 3,4 Om de monitorproces van opeenvolgende wax verwijderen, solid-state cross-polarisatie magic-angle spinning-(CPMAS) 13 C-NMR-spectroscopie werd gebruikt in parallel met atomaire kracht microscopie (AFM), het verstrekken van moleculair niveau structurele profielen van de bulk materiaal aangevuld met informatie over de microschaal topografie en ruwheid van de cuticulair oppervlakken. Om de verknoping mogelijkheden van ontparaffineerde nagelriemen van gekweekte wild-type en mutant enkel gen tomaat evalueren, werd MAS 13C NMR gebruikt om de relatieve verhoudingen van zuurstofrijk alifatische (CHO en CH2 O) chemische groepen vergelijken. Limitatieve ontparaffineren door stapsgewijze Soxhlet-extractie met een panel van oplosmiddelen van verschillende polariteit een effectief middel de was groepen op de hydrofobe eigenschappen van de alifatische en aromatische bestanddelen isoleren, terwijl het de chemische structuur van de cutine biopolyester. De mechanische winning van epicuticular wassen en selective verwijdering van intracuticular was bij de controles door complementaire fysieke methoden, biedt een ongekende manier om de cuticula montage onderzoeken: deze benadering onthult de supramoleculaire organisatie en structurele integratie van verschillende soorten van was, de architectuur van de cutine-wax matrix, en de chemische samenstelling van elk bestanddeel. Bovendien solid-state 13 C NMR toont verschillen in de relatieve aantallen CHO en CH2 O chemische groepen voor wild-type en mutant rijp rood tomaat. De NMR technieken bieden bijzondere hulpmiddelen vingerafdruk van de moleculaire structuur van cuticulaire materialen die onoplosbaar, amorf en chemisch heterogene. Als een niet-invasieve oppervlakte-selectieve beeldvormende techniek, AFM levert een effectieve en directe manier om te ontdekken of de structurele organisatie van de cuticulair montage op de nm-micrometer lengteschaal.

Antenne-installaties organen zijn beschermd door de cuticula, een supramoleculaire biopolyester-wax montage. We presenteren protocollen bij selectieve verwijdering van epi-en intracuticular was van tomaat fruit nagelriemen op moleculaire en microniveau door solid-state NMR en atomic force microscopie, respectievelijk te controleren, en om de verknoping capaciteit van gemanipuleerde cuticulair biopolyesters te beoordelen.

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

De cuticula, een hydrofobe beschermlaag op de bovengrondse delen van landplanten, fungeert als een veelzijdige defensieve barrière tegen diverse biotische en ...

In dit experiment worden biofysische technieken gebruikt om de crosslinkingcapaciteit van het polymeer van de tomaat, dat cute en protectief is, te beoordelen en om de selectieve verwijdering van epi- en intracuticulaire wassen uit vruchtcuticula's te monitoren. De isolatie van de cuticula uit de hele vrucht wordt bereikt door enzymatische behandeling van de tomatenschillen en de hechtende celwanden. In een tweede stap wordt extractie gebruikt om de vruchtcuticula volledig te ontwassen, om zo de moleculaire karakterisering van de geïsoleerde cutine te verkrijgen.Bio-polyester wordt geanalyseerd via vaste-stof kernmagnetische resonantie. Spectrale analyse met vaste-stof NMR onthult dat er in cutine uit cuticula's van wild-type en gemanipuleerde tomatenvruchten verschillen zijn in de relatieve proporties van geoxygeneerde allofatische groepen die in staat zijn tot cross-linking. Alternatief wordt de gehele vrucht bestreken en afgepeld met gomarabicum om epicuticulaire wassen te verwijderen, om vervolgens in chloroform te worden gedoopt om intracuticulaire wassen uit de vruchtcuticula te verwijderen.Vervolgens worden de gedeeltelijk ontwasmde cuticula's, geïsoleerd door dezelfde enzymatische behandeling als de tomatenschillen, onderzocht met behulp van vaste-stof NMR en atoomkrachtmicroscopie. Uiteindelijk is de opeenvolgende verwijdering van epi- en intracuticulaire wassen zichtbaar door de waarneming van een progressief afnemende waspiek in de NMR-spectra en veranderingen in het oppervlaksprofiel van de fruitcuticula, waargenomen via gelijktijdige AFM-beeldvorming. Bovengrondse organen van planten worden beschermd door een biopolyester wasassemblage, genaamd de cuticula. We presenteren protocollen om de selectieve verwijdering van interne en externe wassen uit tomatenfruitcuticula's te evalueren met behulp van vaste-stof kernspinresonantie en atoomkrachtmicroscopie.Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om de cross-linking capaciteit van gemodificeerde cuticulaire materialen te evalueren. De procedures worden gedemonstreerd door drie leden van de groep: Dr. Ishish Chatterjee, PhD-kandidaat Shantani Sarkar en voormalig middelbare scholier Julia Tik. Een aanvullende demonstrator is Dr. Olivia Nisau, een postdoc-onderzoeker in het laboratorium van onze collega uit de chemische technologie, Dr. Alexander S. Om te beginnen met de enzymatische isolatie van de tomatenschil, plaats drie commerciële of gekweekte vruchten in een kom, pel de schil in grote stukken en verwijder het binnenste pericarp-weefsel.Was vervolgens de tomatenschillen met gedeïoniseerd water en bewaar ze onder water in een bekerglas, waarbij de gepelde tomatenschil volledig is ondergedompeld in een enzymcocktail die is bereid zoals beschreven in het geschreven protocol. Incubeer gedurende 24 uur bij 31 °C onder voortdurend schudden. Verzamel de tomatenschillen met een trechter of een keukenzeef en was ze met gedeïoniseerd water.Nadat de schillen gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vacuümoven zijn geplaatst, kunnen de gedroogde schillen worden bewaard in een gelabelde fles met dop. Voor daaropvolgende ontwassingsprocedures vult u een gecentreerde glazen of wegwerpbuis ongeveer halfvol met het tomaticuticula-monster; gebruik een pincet om dit voorzichtig aan de basis van de extractiekolom te plaatsen die voor de soli-extractie zal worden gebruikt. Ga verder met het opstellen van het soli-apparaat met methanol als oplosmiddel, zoals beschreven in het geschreven protocol.Houd het proces een uur lang in de gaten en pas de spanning van de variac aan zodat het reservoir ongeveer één druppel per seconde verzamelt en er heveling plaatsvindt binnen de kousen van het apparaat. Wanneer de thimble vol is, na een extractie van 12 uur, laat het apparaat afkoelen, verlaag vervolgens de verwarmingsmantel en verwijder de extractor en het reservoir als één geheel om het oplosmiddel na de extractie weg te gooien. Kantel de kolom om heveling in de kolf eronder mogelijk te maken.Gebruik een pincet om de huls tot net onder de hals van de extractiekolom op te tillen. Laat het overtollige oplosmiddel hiervan aflopen en plaats de huls op een schoon oppervlak. Koppel de kolf los en giet het afval in een gelabelde opvangbak voor oplosmiddelen.Herhaal de extractieprocedure met opeenvolgende oplosmiddelen met een geleidelijk afnemende polariteit, zoals chloroform en hexaan gedurende elk 12 uur. Zodra het monster van de tomatencuticula droog is, wordt de massa gemeten en wordt het monster bij kamertemperatuur bewaard in een pot met schroefdeksel die is afgedicht met Parafilm. Om het monster voor NMR voor te bereiden, worden vier tot zes milligram van de volledig ongewaxte tomatencuticula, genaamd cutine, in een 1,6 millimeter fast MAS zirkonia rotor geplaatst met behulp van het door de leverancier meegeleverde vulinstrument.Schilder na het installeren van de bovenkap de helft van de kap met een zwarte inktmarker om de rotatiesnelheid te kunnen meten. De initiële opstelling van het solid state NMR-experiment is een technisch veeleisend proces en dient te worden uitgevoerd onder begeleiding van ervaren personeel. Begin met het aanpassen van de homogeniteit van het magnetische veld en het optimaliseren van de experimentele parameters met behulp van een modelverbinding, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Plaats de gekoelde en gevulde rotor in de probe en plaats vervolgens de probe in de magneet.Verhoog de spinsnelheid geleidelijk tot 10 kilohertz om te verifiëren dat het monster goed is gepakt en dat de rotor stabiel kan spinnen met een variatie van minder dan 20 hertz. Pas de tuning- en matchingcondensatoren van de probe iteratief aan om een minimale vermogensreflectie te bereiken bij zowel de proton- als de koolstof 13 NMR-frequenties. Stel de experimentele temperatuur in op 25 degrees Celsius.Start het vooraf geoptimaliseerde CPMA-experiment dat overeenkomt met de Hartman Han proton-koolstof matching-conditie die is bepaald bij de spinfrequentie van 10 kilohertz. Na het verwerven van 4.096 transiënten wordt het spectrum geconditioneerd met een exponentiële lijnverbreding van 50 tot 100 hertz, gevolgd door een Fourier-transformatie om een NMR-spectrum te genereren van signaalintensiteit tegenover chemische afscherming in parts per million. Referentieer de koolstof 13 chemische verschuivingen zoals beschreven in de tekst.Verhoog de rotatiefrequentie van de rotor naar 15 kilohertz en herhaal de C-P-M-A-S-meting overeenkomstig de Hartman Han Matching-conditie die is bepaald bij de chemische verschuivingsanalyse van de C-P-M-A-S koolstof bij de ladder-rotatiefrequentie. 13 NMR-spectra identificeerden de belangrijkste aanwezige functionele groepen in de volledig gedestilleerde DW-gewaxte tomatacuticula: langketen PHA's, geoxygeneerde PHA's, meervoudig gebonden verbindingen en aromaten en koolstofopbrengsten. De geoxygeneerde PHA's spelen een cruciale rol bij het tot stand brengen van covalente verbindingen tussen de monomere eenheden van het cutine-biopolymeer, waardoor de moleculaire architectuur van de cutinematrix wordt gevormd.Verschillen in relatieve piekoppervlakken waargenomen in het spectrale gebied tussen 45 en 100 parts per million suggereren dat de gemuteerde cutine een relatief groot aandeel aan CHO-structurele groepen heeft die dwarsverbindingen vormen, vergeleken met het wild-type apine. Om te beginnen met de selectieve isolatie van epicuticulaire en intracuticulaire wassen.Was een tweede batch hele tomaten met gedestilleerd water. Droog ze af met papieren handdoeken en Kimwipes en plaats ze met de steel naar beneden op een stuk aluminiumfolie. Bestrijk de hele tomaten van boven naar beneden met een 120% gum Arabic waterige oplossing.Laat de Arabische gom gedurende één uur op de fruitschil drogen, zodat er een dunne film ontstaat. Verwijder deze film met een pincet, maar voorkom dat de tomatenschil wordt doorboord. Verdere behandeling van de film, zoals beschreven in de tekst, levert de epicuticulaire was op.De tomaten blijven fysiek intact. Dip ze gedurende twee minuten in chloroform. Bij kamertemperatuur kan de intracuticulaire was worden verzameld na verdamping van het oplosmiddel; pel vervolgens de tomaten en behandel ze enzymatisch met cellulase en pectinase en een natriumacetaatbuffer om respectievelijk cellulose en pectine te verwijderen.Vervolgens kan een sali-extractie worden uitgevoerd, zoals eerder beschreven, om de tomaten volledig te ontwassen. De C-P-M-A-S-experimenten kunnen worden herhaald met natuurlijke en gedeeltelijk ontwaste monsters van de fruitcuticula, zoals beschreven in de tekst. De configuratie van de atomaire krachtmicroscoop is een ingewikkeld proces en wordt bij voorkeur uitgevoerd onder initiële begeleiding van ervaren technisch personeel. Een FM begint met het inschakelen van de scanning probe-microscoop, afgekort als SPM, en controleert of de schakelaar voor de microscoopmodus is ingesteld op de contact-atomaire krachtmicroscopie-modus.Til vervolgens de SPM-kop handmatig op door de twee door de gebruiker instelbare voorste knoppen te draaien. Verwijder de aFM-tiphouder uit de SPM-kop door de klembout aan de achterzijde van de kop te draaien. Gebruik een pincet om de bestaande aFM-cantilever uit de houder te verwijderen.Pak vervolgens voorzichtig een nieuwe cantilever met siliciumnitride-punt uit de verpakking en installeer deze in plaats van de oude cantilever. Gebruik een lichtmicroscoop om te verifiëren dat de nieuw geïnstalleerde FM-cantilever niet gebroken is. Bevestig het monster van de tomatocuticula met dubbelzijdige tape aan een monsterhouder.Gebruik een lichtmicroscoop om te controleren of het cuticulamonster vlak en glad blijft. Nadat het monster op de puck is geplaatst, wordt het aan de puck bevestigde tomatocuticulamonster op het magnetische gebied bovenop de SPM-scanner geplaatst. Draai aan de knoppen om de twee voorste handmatige schroeven van de scanner hoog genoeg in te stellen om beschadiging van de AFM-tip te voorkomen.Wanneer de tiphouder in de SPM-kop wordt geplaatst, stelt u de gemotoriseerde achterbout in op ongeveer hetzelfde niveau als de andere twee voorbouten. Plaats de tiphouder opnieuw in de SPM-kop en zet deze vast door de achterste klembout van de kop aan te draaien. Nadat de laser is ingeschakeld, lijnt u de laserstraal uit op een FM-cantilever met behulp van de centrale en rechter laserinstelknoppen bovenop de kop.Monitor de gereflecteerde laserstraal op een stuk papier om de laserspot precies aan het uiteinde van de FM-cantilever te positioneren. Pas de positie van de laserspot aan om een maximaal somsignaal te bereiken. Reguleer de positie van de gereflecteerde laserspot op de fotodetector door de positie van de beweegbare spiegel horizontaal en verticaal aan te passen, om ervoor te zorgen dat het invallende licht gelijkmatig door de vier kwadranten wordt ontvangen.De detector laat een FM-tip zakken door de door de gebruiker bediende voorste schroeven en de gemotoriseerde achterschroef van de SPM-scanner terug te trekken. Controleer visueel met een omgekeerde microscoop de benadering van de A FM-tip naar het sampleoppervlak. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zich op hetzelfde niveau bevinden.Om artefacten door het imagen van een gekanteld monster te voorkomen, brengt u de punt naar het monster toe, maar niet zo dichtbij dat deze het monsteroppervlak raakt of doorbreekt. Het laserlicht dat door de A FM-cantilever wordt gereflecteerd, kaatst via een beweegbare spiegel naar een lichtgevoelige detector voor contact A FM-modus met een siliciumnitride A FM-probe. Stel de uitgangssignaalspanning in op negatief twee volt voor een nulvolt setpoint en het differentiaalsignaal op nul volt door de positie van de spiegel aan te passen.Gebruik de nano scope-software. Klik op het microscoopicoon en selecteer het juiste profiel. Stel via het paneel met scancontrole-instellingen de scansnelheid en de scanmaat in.Laat de AFM-tip contact maken met het sampleoppervlak door op het pictogram voor het activeren van de tip te klikken. Door de gemotoriseerde achterbout van de SPM-basis aan te sturen, zal het programma de tip nu laten zakken tot deze contact maakt met het sampleoppervlak. Het scanproces start automatisch zodra de tip succesvol contact heeft gemaakt.Houd het scanproces nauwgezet in de gaten met behulp van zowel de beeld- als de scope-modus van de software en pas de parameters iteratief aan om beelden met de hoogste resolutie te verkrijgen, zoals beschreven in het geschreven protocol. Begin bijvoorbeeld met scannen met een grote schaalwaarde voor de Z-as. Verlaag vervolgens voorzichtig de Z-schaalwaarde om het beste contrast van de oppervlaktekenmerken op het beeld te verkrijgen.Leg het beeld vast om het databestand op te slaan. Verwerk de gegevens met flattening-functies om beeldartefacten te verwijderen die zijn veroorzaakt door verticale scannerdrift, beeldbuigingen en verticale offset tussen scanlijnen. Bereken ten slotte de gemiddelde ruwheidskoolstof.13C-CP-MAS-NMR-spectra lieten een geleidelijk afnemende waspiek zien bij 31 parts per million, wat wijst op de opeenvolgende verwijdering van epicuticulaire en intracuticulaire wassen uit het cutine- en wascomposiet, terwijl de belangrijkste chemische architectuur van het cutine-biopolymeer behouden bleef. Een FM-beeldanalyse onthulde oppervlakte-onregelmatigheden als gevolg van de stapsgewijze extractie van epicuticulaire en intracuticulaire was uit de vruchtcuticula, wat duidt op veranderingen in de organisatie van de cuticulaire samenstelling. Eenmaal beheerst kan deze techniek voor de opeenvolgende verwijdering van epicuticulaire en intracuticulaire wassen uit de cuticula van tomatenvruchten in twee uur worden voltooid.Bij het uitvoeren van een solventextractie voor de volledige extractie van de fruitcuticula's is het belangrijk om een reeks solventen met verschillende polariteit te gebruiken na het gebruik van de contactnode. Een FM-protocol wordt hier geïllustreerd. Aanvullende FM-experimenten kunnen worden gebruikt om de oppervlakte-elasticiteit van de cuticula te meten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u systematisch componenten uit het cutine-wascomposiet kunt isoleren en hoe u moleculaire karakterisering en snelle oppervlakteonderzoek van cuticulamaterialen kunt uitvoeren met behulp van respectievelijk vaste-stof-NMR en FM. De in deze video geïllustreerde technieken stellen onderzoekers in de plantbiologie in staat om de moleculaire samenstelling en supermoleculaire architectuur van natuurlijke en genetisch gemodificeerde plantenweefsels te bepalen.

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De plant cuticula is een wasachtige buitenste laag met planten die een primaire rol in het waterbeheer heeft, maar is ook een belangrijke barrière tegen het binnendringen van pathogene micro-organismen. In deze video, tonen we de analyse van de plant cuticula mutanten geïdentificeerd door vooruit en reverse genetics benaderingen.

Het gebruik van Arabidopsis mutanten eceriferum naar Plant Nagelriem Biosynthese Explore

De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.

Cuticula disruptie: een methode om hemolymph te verzamelen van Drosophila larven

We bieden een techniek om intact boomfloëem te behouden en het voor te bereiden op observatie. We creëren een apparaat genaamd een floëemsandwich dat het mogelijk maakt om geleedpotigen, microben en andere organismen die in floëemweefsels leven te introduceren en observeren.

Techniek voor het bestuderen van geleedpotigen en microbiële gemeenschappen binnen Tree Tissues

Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Een ideaal model voor het bestuderen van de biologie van volwassen stamcellen is de muis haarfollikel. Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van verschillende populaties van haarfollikelstamcellen en epidermale keratinocyten, met behulp van enzymatische vertering van de dorsale muishuid gevolgd door FACS-analyse.

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Het protocol is gebaseerd op een droge, niet-bufferextractie van trichomen met alleen vloeibare stikstof, droogijs en nylonzeven en is geschikt voor RNA-extractie en transcriptomische analyse.

Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Leer biophysische technieken om de cross-linkingcapaciteit van tomatencuticula te beoordelen en selectieve verwijdering van epi- en intracuticulaire was te monitoren met behulp van solid-state NMR en atoomkrachtmicroscopie.

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

Meer video's verkennen