Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

In dit experiment worden biofysische technieken gebruikt om de crosslinkingcapaciteit van het polymeer van de tomaat, dat cute en protectief is, te beoordelen en om de selectieve verwijdering van epi- en intracuticulaire wassen uit vruchtcuticula's te monitoren. De isolatie van de cuticula uit de hele vrucht wordt bereikt door enzymatische behandeling van de tomatenschillen en de hechtende celwanden. In een tweede stap wordt extractie gebruikt om de vruchtcuticula volledig te ontwassen, om zo de moleculaire karakterisering van de geïsoleerde cutine te verkrijgen.

Bio-polyester wordt geanalyseerd via vaste-stof kernmagnetische resonantie. Spectrale analyse met vaste-stof NMR onthult dat er in cutine uit cuticula's van wild-type en gemanipuleerde tomatenvruchten verschillen zijn in de relatieve proporties van geoxygeneerde allofatische groepen die in staat zijn tot cross-linking. Alternatief wordt de gehele vrucht bestreken en afgepeld met gomarabicum om epicuticulaire wassen te verwijderen, om vervolgens in chloroform te worden gedoopt om intracuticulaire wassen uit de vruchtcuticula te verwijderen.

Vervolgens worden de gedeeltelijk ontwasmde cuticula's, geïsoleerd door dezelfde enzymatische behandeling als de tomatenschillen, onderzocht met behulp van vaste-stof NMR en atoomkrachtmicroscopie. Uiteindelijk is de opeenvolgende verwijdering van epi- en intracuticulaire wassen zichtbaar door de waarneming van een progressief afnemende waspiek in de NMR-spectra en veranderingen in het oppervlaksprofiel van de fruitcuticula, waargenomen via gelijktijdige AFM-beeldvorming. Bovengrondse organen van planten worden beschermd door een biopolyester wasassemblage, genaamd de cuticula. We presenteren protocollen om de selectieve verwijdering van interne en externe wassen uit tomatenfruitcuticula's te evalueren met behulp van vaste-stof kernspinresonantie en atoomkrachtmicroscopie.

Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om de cross-linking capaciteit van gemodificeerde cuticulaire materialen te evalueren. De procedures worden gedemonstreerd door drie leden van de groep: Dr. Ishish Chatterjee, PhD-kandidaat Shantani Sarkar en voormalig middelbare scholier Julia Tik. Een aanvullende demonstrator is Dr. Olivia Nisau, een postdoc-onderzoeker in het laboratorium van onze collega uit de chemische technologie, Dr. Alexander S. Om te beginnen met de enzymatische isolatie van de tomatenschil, plaats drie commerciële of gekweekte vruchten in een kom, pel de schil in grote stukken en verwijder het binnenste pericarp-weefsel.

Was vervolgens de tomatenschillen met gedeïoniseerd water en bewaar ze onder water in een bekerglas, waarbij de gepelde tomatenschil volledig is ondergedompeld in een enzymcocktail die is bereid zoals beschreven in het geschreven protocol. Incubeer gedurende 24 uur bij 31 °C onder voortdurend schudden. Verzamel de tomatenschillen met een trechter of een keukenzeef en was ze met gedeïoniseerd water.

Nadat de schillen gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vacuümoven zijn geplaatst, kunnen de gedroogde schillen worden bewaard in een gelabelde fles met dop. Voor daaropvolgende ontwassingsprocedures vult u een gecentreerde glazen of wegwerpbuis ongeveer halfvol met het tomaticuticula-monster; gebruik een pincet om dit voorzichtig aan de basis van de extractiekolom te plaatsen die voor de soli-extractie zal worden gebruikt. Ga verder met het opstellen van het soli-apparaat met methanol als oplosmiddel, zoals beschreven in het geschreven protocol.

Houd het proces een uur lang in de gaten en pas de spanning van de variac aan zodat het reservoir ongeveer één druppel per seconde verzamelt en er heveling plaatsvindt binnen de kousen van het apparaat. Wanneer de thimble vol is, na een extractie van 12 uur, laat het apparaat afkoelen, verlaag vervolgens de verwarmingsmantel en verwijder de extractor en het reservoir als één geheel om het oplosmiddel na de extractie weg te gooien. Kantel de kolom om heveling in de kolf eronder mogelijk te maken.

Gebruik een pincet om de huls tot net onder de hals van de extractiekolom op te tillen. Laat het overtollige oplosmiddel hiervan aflopen en plaats de huls op een schoon oppervlak. Koppel de kolf los en giet het afval in een gelabelde opvangbak voor oplosmiddelen.

Herhaal de extractieprocedure met opeenvolgende oplosmiddelen met een geleidelijk afnemende polariteit, zoals chloroform en hexaan gedurende elk 12 uur. Zodra het monster van de tomatencuticula droog is, wordt de massa gemeten en wordt het monster bij kamertemperatuur bewaard in een pot met schroefdeksel die is afgedicht met Parafilm. Om het monster voor NMR voor te bereiden, worden vier tot zes milligram van de volledig ongewaxte tomatencuticula, genaamd cutine, in een 1,6 millimeter fast MAS zirkonia rotor geplaatst met behulp van het door de leverancier meegeleverde vulinstrument.

Schilder na het installeren van de bovenkap de helft van de kap met een zwarte inktmarker om de rotatiesnelheid te kunnen meten. De initiële opstelling van het solid state NMR-experiment is een technisch veeleisend proces en dient te worden uitgevoerd onder begeleiding van ervaren personeel. Begin met het aanpassen van de homogeniteit van het magnetische veld en het optimaliseren van de experimentele parameters met behulp van een modelverbinding, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Plaats de gekoelde en gevulde rotor in de probe en plaats vervolgens de probe in de magneet.

Verhoog de spinsnelheid geleidelijk tot 10 kilohertz om te verifiëren dat het monster goed is gepakt en dat de rotor stabiel kan spinnen met een variatie van minder dan 20 hertz. Pas de tuning- en matchingcondensatoren van de probe iteratief aan om een minimale vermogensreflectie te bereiken bij zowel de proton- als de koolstof 13 NMR-frequenties. Stel de experimentele temperatuur in op 25 degrees Celsius.

Start het vooraf geoptimaliseerde CPMA-experiment dat overeenkomt met de Hartman Han proton-koolstof matching-conditie die is bepaald bij de spinfrequentie van 10 kilohertz. Na het verwerven van 4.096 transiënten wordt het spectrum geconditioneerd met een exponentiële lijnverbreding van 50 tot 100 hertz, gevolgd door een Fourier-transformatie om een NMR-spectrum te genereren van signaalintensiteit tegenover chemische afscherming in parts per million. Referentieer de koolstof 13 chemische verschuivingen zoals beschreven in de tekst.

Verhoog de rotatiefrequentie van de rotor naar 15 kilohertz en herhaal de C-P-M-A-S-meting overeenkomstig de Hartman Han Matching-conditie die is bepaald bij de chemische verschuivingsanalyse van de C-P-M-A-S koolstof bij de ladder-rotatiefrequentie. 13 NMR-spectra identificeerden de belangrijkste aanwezige functionele groepen in de volledig gedestilleerde DW-gewaxte tomatacuticula: langketen PHA's, geoxygeneerde PHA's, meervoudig gebonden verbindingen en aromaten en koolstofopbrengsten. De geoxygeneerde PHA's spelen een cruciale rol bij het tot stand brengen van covalente verbindingen tussen de monomere eenheden van het cutine-biopolymeer, waardoor de moleculaire architectuur van de cutinematrix wordt gevormd.

Verschillen in relatieve piekoppervlakken waargenomen in het spectrale gebied tussen 45 en 100 parts per million suggereren dat de gemuteerde cutine een relatief groot aandeel aan CHO-structurele groepen heeft die dwarsverbindingen vormen, vergeleken met het wild-type apine. Om te beginnen met de selectieve isolatie van epicuticulaire en intracuticulaire wassen.

Was een tweede batch hele tomaten met gedestilleerd water. Droog ze af met papieren handdoeken en Kimwipes en plaats ze met de steel naar beneden op een stuk aluminiumfolie. Bestrijk de hele tomaten van boven naar beneden met een 120% gum Arabic waterige oplossing.

Laat de Arabische gom gedurende één uur op de fruitschil drogen, zodat er een dunne film ontstaat. Verwijder deze film met een pincet, maar voorkom dat de tomatenschil wordt doorboord. Verdere behandeling van de film, zoals beschreven in de tekst, levert de epicuticulaire was op.

De tomaten blijven fysiek intact. Dip ze gedurende twee minuten in chloroform. Bij kamertemperatuur kan de intracuticulaire was worden verzameld na verdamping van het oplosmiddel; pel vervolgens de tomaten en behandel ze enzymatisch met cellulase en pectinase en een natriumacetaatbuffer om respectievelijk cellulose en pectine te verwijderen.

Vervolgens kan een sali-extractie worden uitgevoerd, zoals eerder beschreven, om de tomaten volledig te ontwassen. De C-P-M-A-S-experimenten kunnen worden herhaald met natuurlijke en gedeeltelijk ontwaste monsters van de fruitcuticula, zoals beschreven in de tekst. De configuratie van de atomaire krachtmicroscoop is een ingewikkeld proces en wordt bij voorkeur uitgevoerd onder initiële begeleiding van ervaren technisch personeel. Een FM begint met het inschakelen van de scanning probe-microscoop, afgekort als SPM, en controleert of de schakelaar voor de microscoopmodus is ingesteld op de contact-atomaire krachtmicroscopie-modus.

Til vervolgens de SPM-kop handmatig op door de twee door de gebruiker instelbare voorste knoppen te draaien. Verwijder de aFM-tiphouder uit de SPM-kop door de klembout aan de achterzijde van de kop te draaien. Gebruik een pincet om de bestaande aFM-cantilever uit de houder te verwijderen.

Pak vervolgens voorzichtig een nieuwe cantilever met siliciumnitride-punt uit de verpakking en installeer deze in plaats van de oude cantilever. Gebruik een lichtmicroscoop om te verifiëren dat de nieuw geïnstalleerde FM-cantilever niet gebroken is. Bevestig het monster van de tomatocuticula met dubbelzijdige tape aan een monsterhouder.

Gebruik een lichtmicroscoop om te controleren of het cuticulamonster vlak en glad blijft. Nadat het monster op de puck is geplaatst, wordt het aan de puck bevestigde tomatocuticulamonster op het magnetische gebied bovenop de SPM-scanner geplaatst. Draai aan de knoppen om de twee voorste handmatige schroeven van de scanner hoog genoeg in te stellen om beschadiging van de AFM-tip te voorkomen.

Wanneer de tiphouder in de SPM-kop wordt geplaatst, stelt u de gemotoriseerde achterbout in op ongeveer hetzelfde niveau als de andere twee voorbouten. Plaats de tiphouder opnieuw in de SPM-kop en zet deze vast door de achterste klembout van de kop aan te draaien. Nadat de laser is ingeschakeld, lijnt u de laserstraal uit op een FM-cantilever met behulp van de centrale en rechter laserinstelknoppen bovenop de kop.

Monitor de gereflecteerde laserstraal op een stuk papier om de laserspot precies aan het uiteinde van de FM-cantilever te positioneren. Pas de positie van de laserspot aan om een maximaal somsignaal te bereiken. Reguleer de positie van de gereflecteerde laserspot op de fotodetector door de positie van de beweegbare spiegel horizontaal en verticaal aan te passen, om ervoor te zorgen dat het invallende licht gelijkmatig door de vier kwadranten wordt ontvangen.

De detector laat een FM-tip zakken door de door de gebruiker bediende voorste schroeven en de gemotoriseerde achterschroef van de SPM-scanner terug te trekken. Controleer visueel met een omgekeerde microscoop de benadering van de A FM-tip naar het sampleoppervlak. Zorg ervoor dat alle drie de schroeven zich op hetzelfde niveau bevinden.

Om artefacten door het imagen van een gekanteld monster te voorkomen, brengt u de punt naar het monster toe, maar niet zo dichtbij dat deze het monsteroppervlak raakt of doorbreekt. Het laserlicht dat door de A FM-cantilever wordt gereflecteerd, kaatst via een beweegbare spiegel naar een lichtgevoelige detector voor contact A FM-modus met een siliciumnitride A FM-probe. Stel de uitgangssignaalspanning in op negatief twee volt voor een nulvolt setpoint en het differentiaalsignaal op nul volt door de positie van de spiegel aan te passen.

Gebruik de nano scope-software. Klik op het microscoopicoon en selecteer het juiste profiel. Stel via het paneel met scancontrole-instellingen de scansnelheid en de scanmaat in.

Laat de AFM-tip contact maken met het sampleoppervlak door op het pictogram voor het activeren van de tip te klikken. Door de gemotoriseerde achterbout van de SPM-basis aan te sturen, zal het programma de tip nu laten zakken tot deze contact maakt met het sampleoppervlak. Het scanproces start automatisch zodra de tip succesvol contact heeft gemaakt.

Houd het scanproces nauwgezet in de gaten met behulp van zowel de beeld- als de scope-modus van de software en pas de parameters iteratief aan om beelden met de hoogste resolutie te verkrijgen, zoals beschreven in het geschreven protocol. Begin bijvoorbeeld met scannen met een grote schaalwaarde voor de Z-as. Verlaag vervolgens voorzichtig de Z-schaalwaarde om het beste contrast van de oppervlaktekenmerken op het beeld te verkrijgen.

Leg het beeld vast om het databestand op te slaan. Verwerk de gegevens met flattening-functies om beeldartefacten te verwijderen die zijn veroorzaakt door verticale scannerdrift, beeldbuigingen en verticale offset tussen scanlijnen. Bereken ten slotte de gemiddelde ruwheidskoolstof.

13C-CP-MAS-NMR-spectra lieten een geleidelijk afnemende waspiek zien bij 31 parts per million, wat wijst op de opeenvolgende verwijdering van epicuticulaire en intracuticulaire wassen uit het cutine- en wascomposiet, terwijl de belangrijkste chemische architectuur van het cutine-biopolymeer behouden bleef. Een FM-beeldanalyse onthulde oppervlakte-onregelmatigheden als gevolg van de stapsgewijze extractie van epicuticulaire en intracuticulaire was uit de vruchtcuticula, wat duidt op veranderingen in de organisatie van de cuticulaire samenstelling. Eenmaal beheerst kan deze techniek voor de opeenvolgende verwijdering van epicuticulaire en intracuticulaire wassen uit de cuticula van tomatenvruchten in twee uur worden voltooid.

Bij het uitvoeren van een solventextractie voor de volledige extractie van de fruitcuticula's is het belangrijk om een reeks solventen met verschillende polariteit te gebruiken na het gebruik van de contactnode. Een FM-protocol wordt hier geïllustreerd. Aanvullende FM-experimenten kunnen worden gebruikt om de oppervlakte-elasticiteit van de cuticula te meten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u systematisch componenten uit het cutine-wascomposiet kunt isoleren en hoe u moleculaire karakterisering en snelle oppervlakteonderzoek van cuticulamaterialen kunt uitvoeren met behulp van respectievelijk vaste-stof-NMR en FM. De in deze video geïllustreerde technieken stellen onderzoekers in de plantbiologie in staat om de moleculaire samenstelling en supermoleculaire architectuur van natuurlijke en genetisch gemodificeerde plantenweefsels te bepalen.