Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Het doel van deze procedure is om een experimenteel systeem te beschrijven om mechanotransductie in foetale longcellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door kweekplaten te coaten met extracellulaire matrixeiwitten. Vervolgens worden epitheelcellen van type twee uit de foetale muizenlong geïsoleerd, gevolgd door de isolatie van foetale muizenfibroblasten.

De laatste stap beschrijft een in vitro-systeem om mechanische stimulatie aan longcellen toe te dienen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een toename van de differentiatie van type 2-cellen aantonen via real-time PCR, western blot en fluorescentie-immunochemische beelden. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de mechanotransductie, zoals de foetale longontwikkeling en longletsel.

De procedure wordt gedemonstreerd door Julian gu, een technicus uit mijn laboratorium. Terwijl we werken in een laminaire flow-kast onder steriele omstandigheden, maken we 120 microgram laminine met 12 milliliter koude steriele 1x PBS per plaat. Andere extracellulaire matrixeiwitten kunnen worden gebruikt voor de coating. Raadpleeg het geschreven protocol voor details, neem vervolgens een onbehandelde BioFlex-plaat en voeg twee milliliter van de laminine-oplossing toe aan elke well tot een uiteindelijke concentratie van twee microgram per vierkante centimeter.

Zorg ervoor dat de wells volledig bedekt zijn door de oplossing. Dek de plaat volledig af met vershoudfolie en plaats deze overnacht op een vlak oppervlak in een omgeving van 4 °C, zodat het laminaat in de bodem van de wells kan absorberen. Gecoate platen kunnen onder deze omstandigheden ten minste een week worden bewaard, waarbij de ECM-functie de volgende dag behouden blijft.

Was de wells onder steriele omstandigheden drie keer met 1x PBS. Voeg vervolgens één milliliter 1% BSA in 1x PBS aan elke well toe. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C om aspecifieke bindingsplaatsen op de membranen te blokkeren.

Was de wells vervolgens drie keer met 1 XPBS. Voeg één milliliter DMEM toe aan elke well van de plaat om niet-geabsorbeerde eiwitten te verwijderen. Bewaar de plaat daarna op 37 °C totdat de epitheelcellen type twee uit de foetale long van knaagdieren zijn geïsoleerd en klaar zijn om uit te platen.

Stel de dag voordat de celisolatieprocedure wordt gestart de zeefbekers samen met nylon mazen van 130 en 15 micron en steriliseer deze door middel van autoclaveren. Autoclaveer op de dag van de cultuur tevens hetzelfde aantal glazen peak-buisjes van 150 milliliter. Verkrijg foetale longen van een zwangere muis met een zwangerschapsduur van E 17 tot 19.

Breng het weefsel over naar een centrifugebuis van 50 milliliter met DMEA-medium en plaats deze op ijs. Maak verse digestiebuffer in een centrifugebuis van 50 milliliter volgens het recept in het geschreven protocol. Steriliseer deze vervolgens via een spuitfilter van 0,2 micron terwijl u werkt in een laminaire flowkast.

10 milliliters van deze buffer is voldoende voor het longweefsel van ongeveer 20 muisfoetussen. Plaats de conische buis met de digestiebuffer in een waterbad op 37 °C. Haal het medium uit de conische buis met het foetale longweefsel en breng het weefsel met steriele scharen of een scheermesje over naar een steriele Petrischaal; snipper het weefsel in stukjes kleiner dan 1 millimeter.

Breng het weefsel vervolgens over in de conische buis met de voorverwarmde digestiebuffer. Ondersteun daarna de digestie van het weefsel mechanisch door de suspensie van foetale longcellen honderd keer op en neer te pipetteren, waarbij telkens pipetten met een kleinere opening worden gebruikt. Centrifugeer het homogenaat na voltooiing van het digestieproces vijf minuten bij 1.300 RPM bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens zorgvuldig het supernatant via aspiratie en resuspendeer de pellet met de cellen in 15 milliliters DMEM plus 20%FBS. Haal daarna de zeefbekers met nylon mazen van 130 en 15 micron op en plaats deze bovenop de steriele bekerglazen van 150 milliliter. Pipetteer het celhomogenaat op het net van 100 micron.

Verzamel het filtraat en pipetteer dit op het 30 micron gaas. Was het 30 micron gaas meerdere keren met vers DMEM plus 10%FBS. De meeste type twee cellen klonteren samen en passeren het gaas niet.

Deze wasbeurten verwijderen niet-epitheliale cellen die aan de klonten kunnen zijn gehecht. Breng het filtraat van het 30 micron mesh aan op de 15 micron mesh zeefbeker. Was opnieuw meerdere keren zoals hiervoor beschreven.

Deze stap dient om de type twee cellen te selecteren die mogelijk door het 30 micron mesh zijn gepasseerd. Verzamel de geclusterde niet-gefilterde cellen van de 30 en 15 micron meshes voor verdere verrijking van type twee cellen. Bewaar het filtraat van de 15 micron mesh indien er foetale longfibroblasten van knaagdieren gekweekt moeten worden.

Werp anders dit filtraat weg. Zuiver vervolgens de epitheelcelpopulatie van type twee door medium toe te voegen en de niet-gefiltreerde cellen uit de 30 en 15 micron mesh cups gedurende 30 minuten te incuberen in een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter. Centrifugeer na deze incubatie het supernatant zoals eerder beschreven, pellet de cellen en resuspendeer de pellet vervolgens in 2 mL serumvrij DMEM. Pipetteer 1 mL van de celsuspensie in elke put van de laminine-gecoate BioFlex six-well plates. Op dit punt verschijnen de cellen in klonten wanneer ze onder de microscoop worden geobserveerd. Incubeer de plaat in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2. Een incubatie van 24 uur is optimaal, waarbij een minimale incubatie van 6 uur vereist is.

Voordat u begint met de experimenten naar mechanische rek, neemt u het filtraat van het 15 micron mesh en brengt u dit over naar een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter bij 37 °C gedurende 30 tot 60 minuten om de fibroblasten te laten hechten; aspireer vervolgens en gooi het supernatant weg. Vervang daarna het volume in de fles door serumvrije DMEM en incubeer dit gedurende de nacht. Oogst de volgende dag de cellen met 0,25% trypsine in 0,4 millimol EDTA en zaai ze uit op met fibronectine gecoate BioFlex-platen; incubeer deze in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% koolstofdioxide, bij voorkeur gedurende 24 uur voordat u begint met de experimenten naar mechanische rek.

Een incubatie van minimaal zes uur is vereist indien een specifiek aantal cellen nodig is voor de experimenten. Type two-cellen worden na isolatie onderhouden in serumvrije DMEM in kolven van 75 vierkante centimeter; de volgende dag worden de cellen getrypsineerd, geteld en vervolgens gezaaid. De monoclaag mag niet meer dan 80% confluent zijn vóór de aanvang van de experimenten. Op de dag van het mechanische stimulatie-experiment wordt het kweekmedium vervangen door twee milliliters vers serumvrij DMEM per putje, waarna de plaat wordt geplaatst in een Flexcell FX 5.000 strain-unit.

Pas vervolgens EQU biaxiale rek toe op de membranen. Het schema van de rek varieert afhankelijk van de simulatie van mechanische krachten in vivo. Zoals besproken in het schriftelijke protocol, werden cellen gekweekt op niet-ST gerekte membranen.

Parallel gecultiveerde cellen dienen als controles voor het experiment. Aan het einde van het experiment kunnen de monolagen worden verwerkt om veranderingen in genexpressie te analyseren via real-time PCR of veranderingen in eiwitovervloed via western blot. Daarnaast kunnen de monolagen worden gefixeerd voor immunochemische experimenten met deze techniek.

Na fixatie worden de astische membranen uit de platen gesneden en op glazen objectglaasjes gemonteerd met behulp van 10 tot 20 µL water als monteermiddel, voorafgaand aan de permeabilisatie en incubatie met antilichamen. Het supernatant van het experiment kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van vrijgekomen stoffen, zoals groeifactoren of cytokinen, te onderzoeken. Deze afbeelding toont formaline-gefixeerde E 18 foetale type twee epitheelcellen die zijn geïsoleerd volgens dit protocol en zijn uitgeplaat op BioFlex-platen gecoat met laminine.

De cellen werden gefixeerd en er werd een foto gemaakt. De dag na de non-ST stretch werden de cellen gezaaid. De zuiverheid van de cellen werd bepaald op 90 ± 5% door microscopische analyse van de epitheelcelmorfologie en immuunkleuring voor surfactantproteïne C. De volgende figuren presenteren gegevens van foetale type 2 epitheelcellen die gedurende 16 uur werden blootgesteld aan een cyclische rek van 5% bij 40 cycli per minuut.

Deze northern blot van de expressie van surfactant proteïne C mRNA illustreert dat rek differentiatie van type twee cellen induceert met behulp van verschillende ECM-substraten. De plus- en mintekens staan respectievelijk voor blootstelling aan rek of geen blootstelling aan rek. De expressiegegevens worden in het histogram weergegeven als gemiddelde plus of min SEM, waarbij N gelijk is aan drie, en het sterretje duidt op een P-waarde van minder dan 0,05.

Deze fluorescentie-immunochemische beelden tonen de gehaltes van surfactantproteïne C in het groen. In foetale type 2-cellen die niet waren blootgesteld aan mechanische rek (links) en cellen die wel waren blootgesteld aan mechanische rek (rechts) zijn de kernen tegengekleurd met dapi, wat blauw verschijnt. Dit histogram kwantificeert de resultaten van western blots uit drie experimenten, waaruit blijkt dat mechanische rek de gehaltes van surfactantproteïne C verhoogt.

In dit experiment is N gelijk aan drie en het asterisk geeft een P-waarde van minder dan 0,05 aan. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe foetale longcellen kunnen worden gekweekt en blootgesteld aan mechanische rek.