Name: Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer mechanotransductie in foetale longcellen bestuderen met een in vitro-systeem voor mechanische stimulatie. Deze methode isoleert type II epitheelcellen en fibroblasten om longontwikkeling en longletsel te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NIH-subsidie ​​HD052670.

1. Coating van platen met ECM eiwitten <ol><li> Onder steriele omstandigheden, meng 120 ug van laminine met 12 ml koud steriel 1X PBS per plaat. </li><li> Neem Bioflex onbehandelde platen en voeg 2 ml van de oplossing in elk putje (eindconcentratie laminine is 2 ug / cm 2). Ook kunnen andere ECM eiwitten worden gebruikt, zoals collageen-1 [10 ug / cm 2], fibronectine [5 ug / cm 2], vitronectine [0,5 ug / cm 2] elastine [10 ug / cm 2]. De coating techniek is vergelijkbaar met wat beschreven wordt voor laminine-coating. Zorg ervoor dat de putten zijn volledig gedekt door de oplossing. </li><li> Wikkelen van de platen met kunststof en zet bij 4 ° C op een vlakke ondergrond nachts de laminin laten adsorberen op de bodem van de putten. In deze omstandigheden kan platen wordt ten minste een week met behoud goede ECM functie. </li><li> De volgende dag, onder steriele omstandigheden, was de putten 3 keer met 1X PBS. </li><li&gt; toevoegen 1 ml 1% BSA in PBS 1X aan elk putje en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur niet-specifieke plaatsen op de membranen te blokkeren. </li><li> Spoel de platen 3 keer met 1X PBS om unadsorbed eiwitten te verwijderen. </li><li> Houd de platen bij 37 ° C in DMEM tot cellen geïsoleerd uit stap 2.14. </li></ol> 2. Isolatie van foetale knaagdieren long type II epitheelcellen De dag voor isolatie hebben het scherm kopjes met verschillende grootte nylon mazen geautoclaveerd en klaar. <ol><li> Zorg voor foetale longen uit timed-drachtige muis / rat op E17-19 van de dracht. Breng het weefsel in een 50 ml conische buis met DMEM-medium en plaats het op het ijs. </li><li> Merk digestie buffer in een 50 ml conische buis (10 ml). Voor dit volume, wordt het longweefsel van ongeveer 20 foetussen van muizen / ratten gebruikt. 8,5 ml DMEM 0,5 ml 500mm HEPES pH 7,4 5 mg Collagenase een 5 mg Collagenase 1A 1 ml Kip serum, warmte geïnactiveerd </li><li>Meng goed totdat alle componenten zijn opgelost en filtreer door een 0,2 micron spuit filter in de steriele kap. Plaats de conische buis met de spijsvertering buffer in een waterbad bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de DMEM medium uit de conische buis uit stap 2.1 en overdragen het weefsel in een steriele Petri schaal. </li><li> Gehakt de longen en met steriele scharen en scheermes om weefselstukken minder dan 1 mm en het weefsel te zetten in de conische buis met de voorverwarmde digestie buffer bij stap 2.3. </li><li> Verteren van het weefsel door en neer te pipetteren: 100 maal met 10 ml pipet 100 maal met 5 ml pipet 100 keer met Pasteur pipet </li><li> Centrifugeer de homogenaat op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant van aspiratie en resuspendeer de pellet die de cellen in 15 ml DMEM plus 20% FBS. </li><li> Haal het scherm cups met 100 -, 30 - en 15-micron nylon mazen en plaats eem op steriele 150 ml bekers. </li><li> Voeg cel homogenaat vanaf stap 2.8 en opeenvolgend filteren door middel van 100 -, 30 - en 15-micron gaas cups. </li><li> Verzamelen samengeklonterd ongefilterde cellen van de 30 - en 15-micron mazen na verschillende wasbehandelingen met DMEM plus 10% FBS voor het filtreren van niet-epitheelcellen vergemakkelijken. </li><li> Verwijder het filtraat van de 15 micron mesh die meestal bevat fibroblasten. </li><li> Zuiver ander type II cellen door incubatie cellen stap 2,11 in 75 cm2 flessen gedurende 30 min (approximatelly10 ml celsuspensie per fles). </li><li> De bovenstaande en centrifugeer op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur pellet de cellen. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant van aspiratie en resuspendeer de pellet die de cellen in serum-vrij DMEM. Het volume van resuspensie afhankelijk van de hoeveelheid weefsel verwerkt. Ongeveer we plaat het equivalent van cellen van een foetus in elk putje (2 ml) om Achiavond tussen 60-70% confluentie de volgende dag. </li><li> Het bord van de celsuspensie op Bioflex zes-well platen vooraf bekleed met laminine of met fibronectine. </li></ol> 3. Isolatie van foetale knaagdier longfibroblasten <ol><li> Volg dezelfde stappen hierboven beschreven voor type II-cellen geïsoleerd tot 2.11. </li><li> Neem het filtraat van de 15 micron mesh (zonder voorafgaande wassen, ongeveer volume 10-15 ml) en plaat op 75 cm2 bij 37 ° C gedurende 30-60 min om fibroblasten te houden. </li><li> Zuig het supernantant en &#39;s nachts te vervangen door serum-vrij DMEM en incubeer. </li><li> De volgende dag oogsten cellen met 0,25% (gew / vol) trypsine in 0,4 mM EDTA en plaat ze op Bioflex platen vooraf bekleed met fibronectine. </li></ol> 4. Experimentele systeem mechanische stimulatie aan longcellen <ol><li> Zaad van de cellen (ongeveer 50% samenvloeiing) op Bioflex kweekplaten in serum-vrij DMEM (2 ml / putje) en laat ze hechten en SPREadvertentie voor minstens 6 uur voor de experimenten. In het algemeen ons laboratorium houdt cellen in cultuur voor ongeveer 24 uur voor het toepassen van mechanische belasting. Indien een bepaald aantal cellen voor de experimenten, na isolatie, zijn Type II cellen gehandhaafd serumvrij DMEM 75 cm2 flessen en de volgende dag cellen getrypsiniseerd, geteld en gezaaid. </li><li> De volgende dag media worden vervangen door vers serumvrij DMEM (2 ml / putje) en Bioflex platen zijn gemonteerd in een Flexcell FX-5000 Strain eenheid. Monolayers niet hoger dan 80% confluent zijn voor de initiatie van de experimenten. </li><li> Equibiaxial stam wordt toegepast op de membranen. Het regime van belasting is afhankelijk van simulatie van mechanische krachten in vivo (zie bespreking). </li><li> Cellen gekweekt op niet-gestrekte membranen gekweekt in parallel worden gebruikt als controles. </li><li> Aan het einde van de experimenten kan worden verwerkt monolayers wijzigingen op genexpressie (bijvoorbeeld oppervlakteactieve eiwit C) analyserendoor real-time-PCR, eiwit overvloed door Western blot, enz. Ook kan monolagen worden vastgesteld voor immunocytochemie experimenten. Voor deze techniek na fixatie worden silastic membranen gesneden uit de platen gemonteerd op glasplaatjes met 10-20 il water als montagemiddel voor permeabilisatie en incubatie met antilichamen. Supernatant kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van groeifactoren, cytokines, etc. onderzoeken </li></ol> 5. Representatieve resultaten Figuur 1 en Figuur 2 tonen representatief fase contrast&#39;s van muizen E18 foetale type II-cellen geïsoleerd volgens de techniek beschreven in dit manuscript. Figuur 3 toont dat de mechanische spanning induceert van foetale type II epitheelcellen met oppervlakte eiwit C als marker. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" /> Figuur 1. Reprepresentatieve fase-contrast-foto genomen vlak na isolatie met de samengeklonterd verschijning van foetale type II cellen. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" /> Figuur 2. E18 foetale type II epitheliale cellen werden geïsoleerd zoals hier en uitgeplaat beschreven Bioflex bekleed met laminine. Foto werd de volgende dag na niet-gestrekte cellen werden in paraformaldehyde. De zuiverheid van de cellen werd bepaald op 90 ± 5% van het microscopische analyse van epitheliale cel morfologie en immunokleuring voor SP-C. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" /> Figuur 3. Foetale type II epitheliale cellen werden blootgesteld aan 5% cyclische belasting van 40 cycli / minuut voor 16 uur. A) Northern blot oppervlakteactieve eiwit C (SP-C) mRNA expressie blijkt dat spanning induceert type II celdifferentiatie met verschillende substraten ECM . + / - Tekens vertegenwoordigen belichting of niet srespectievelijk te trainen,. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + / - SEM, n = 3; * P &lt;0,05 B) Fluorescentie immunocytochemie beelden tonen SP-C-eiwit niveau (groen) in foetale type II cellen blootgesteld of niet (controle) om de mechanische belasting.. Kernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). Bar, 10 pm. C) Western blot resultaten van drie experimenten blijkt dat de mechanische rek groter SP-C-eiwit. N = 3; * P &lt;0.05.

<ol><li>Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+forces+on+lung-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression.</a> Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+alveolar+epithelial+type+II+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation.</a> J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+fetal+type+II+cell+differentiation+via+an+epidermal+growth+factor+receptor-extracellular-regulated+protein+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway.</a> Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+is+mediated+via+cAMP-PKA-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%7Bbeta%7D1%2C+%7Balpha%7D6%2C+and+%7Balpha%7D3+contribute+to+mechanical+strain-induced+differentiation+of+fetal+lung+type+II+epithelial+cells+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+via+shedding+of+HB-EGF+and+TGF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha.</a> J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+caveolin-1+in+mechanotransduction+of+fetal+type+II+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).</li>
<li>Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+protects+cultured+fetal+rat+type+II+epithelial+cells+from+injury+induced+by+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).</li>
<li>Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+inflammatory+cytokines+released+by+fetal+mouse+lung+fibroblasts+exposed+to+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch.</a> Pediatric Pulmonology. , (2011).</li>
<li>Kitterman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+fetal+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on fetal lung growth.</a> Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).</li>
<li>Harding, R. Fetal breathing movements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarding%2C+R+%22The+Lung%3A+Scientific+Fountations%22">The Lung: Scientific Fountations</a>. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).</li>
<li>Harding, R., Liggins, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thoracic+dimensions+induced+by+breathing+movements+in+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit manuscript beschrijven we een methode om foetale type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en om ze bloot te stellen aan mechanische stimulatie met behulp van de Flexcell Strain Apparatus. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek om differentiatie van epitheelcellen 1,2 beoordelen en receptor en signaalwegen geactiveerd door stretch 3-9 te bestuderen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om cel responsen veroorzaakt door mechanische schade 10,11 onderzoeken. De p...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Kippenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Zeefbekers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilters</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nylon gaas</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>30 micron gaas</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>15 micron gaas</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collageen-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>Elastine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex-plaat</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>Ongecoat</td></tr><tr><td>Flexcell Strain Unit</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

een experimenteel systeem om mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanische krachten die ontstaan ​​in de baarmoeder door repetitieve ademhaling-achtige bewegingen en door vocht opgezette buik zijn van cruciaal belang voor een normale long ontwikkeling. Een belangrijk onderdeel van de long ontwikkeling is de differentiatie van de alveolaire type II epitheelcellen, de belangrijkste bron van pulmonale surfactant. Deze cellen nemen ook deel aan vocht homeostase in het alveolaire lumen, afweer, en letsel reparatie. Bovendien kan distale longparenchym cellen direct worden blootgesteld aan overdreven rek bij mechanische ventilatie na de geboorte. Echter, de precieze moleculaire en cellulaire mechanismen die longcellen voelen mechanische stimuli om long-ontwikkeling te beïnvloeden en longschade te bevorderen niet helemaal duidelijk. Hier bieden wij een eenvoudige en hoge zuiverheid methode om type II cellen en fibroblasten van knaagdieren foetale longen te isoleren. Vervolgens beschrijven we een in vitro systeem De Flexcell Strain eenheid mechanische stimulatie voor foetale cellen simuleren mechanische krachten infoetale long ontwikkeling of longschade. Deze experimentele systeem biedt een uitstekend hulpmiddel om de moleculaire en cellulaire mechanismen te onderzoeken in foetale long cellen blootgesteld aan te rekken. Met behulp van deze benadering, heeft ons laboratorium geïdentificeerd verschillende receptoren en signalering eiwitten die in mechanotransductie deel te nemen aan foetale long ontwikkeling en longschade.

Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem.

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Mechanische krachten die in utero worden gegenereerd door repetitieve ademhalingsachtige bewegingen en door vloeistofdistensie zijn cruciaal voor een normale longontwikkeling. Een sleutel...

Het doel van deze procedure is om een experimenteel systeem te beschrijven om mechanotransductie in foetale longcellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door kweekplaten te coaten met extracellulaire matrixeiwitten. Vervolgens worden epitheelcellen van type twee uit de foetale muizenlong geïsoleerd, gevolgd door de isolatie van foetale muizenfibroblasten.De laatste stap beschrijft een in vitro-systeem om mechanische stimulatie aan longcellen toe te dienen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een toename van de differentiatie van type 2-cellen aantonen via real-time PCR, western blot en fluorescentie-immunochemische beelden. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de mechanotransductie, zoals de foetale longontwikkeling en longletsel.De procedure wordt gedemonstreerd door Julian gu, een technicus uit mijn laboratorium. Terwijl we werken in een laminaire flow-kast onder steriele omstandigheden, maken we 120 microgram laminine met 12 milliliter koude steriele 1x PBS per plaat. Andere extracellulaire matrixeiwitten kunnen worden gebruikt voor de coating. Raadpleeg het geschreven protocol voor details, neem vervolgens een onbehandelde BioFlex-plaat en voeg twee milliliter van de laminine-oplossing toe aan elke well tot een uiteindelijke concentratie van twee microgram per vierkante centimeter.Zorg ervoor dat de wells volledig bedekt zijn door de oplossing. Dek de plaat volledig af met vershoudfolie en plaats deze overnacht op een vlak oppervlak in een omgeving van 4 °C, zodat het laminaat in de bodem van de wells kan absorberen. Gecoate platen kunnen onder deze omstandigheden ten minste een week worden bewaard, waarbij de ECM-functie de volgende dag behouden blijft.Was de wells onder steriele omstandigheden drie keer met 1x PBS. Voeg vervolgens één milliliter 1% BSA in 1x PBS aan elke well toe. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C om aspecifieke bindingsplaatsen op de membranen te blokkeren.Was de wells vervolgens drie keer met 1 XPBS. Voeg één milliliter DMEM toe aan elke well van de plaat om niet-geabsorbeerde eiwitten te verwijderen. Bewaar de plaat daarna op 37 °C totdat de epitheelcellen type twee uit de foetale long van knaagdieren zijn geïsoleerd en klaar zijn om uit te platen.Stel de dag voordat de celisolatieprocedure wordt gestart de zeefbekers samen met nylon mazen van 130 en 15 micron en steriliseer deze door middel van autoclaveren. Autoclaveer op de dag van de cultuur tevens hetzelfde aantal glazen peak-buisjes van 150 milliliter. Verkrijg foetale longen van een zwangere muis met een zwangerschapsduur van E 17 tot 19.Breng het weefsel over naar een centrifugebuis van 50 milliliter met DMEA-medium en plaats deze op ijs. Maak verse digestiebuffer in een centrifugebuis van 50 milliliter volgens het recept in het geschreven protocol. Steriliseer deze vervolgens via een spuitfilter van 0,2 micron terwijl u werkt in een laminaire flowkast.10 milliliters van deze buffer is voldoende voor het longweefsel van ongeveer 20 muisfoetussen. Plaats de conische buis met de digestiebuffer in een waterbad op 37 °C. Haal het medium uit de conische buis met het foetale longweefsel en breng het weefsel met steriele scharen of een scheermesje over naar een steriele Petrischaal; snipper het weefsel in stukjes kleiner dan 1 millimeter.Breng het weefsel vervolgens over in de conische buis met de voorverwarmde digestiebuffer. Ondersteun daarna de digestie van het weefsel mechanisch door de suspensie van foetale longcellen honderd keer op en neer te pipetteren, waarbij telkens pipetten met een kleinere opening worden gebruikt. Centrifugeer het homogenaat na voltooiing van het digestieproces vijf minuten bij 1.300 RPM bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens zorgvuldig het supernatant via aspiratie en resuspendeer de pellet met de cellen in 15 milliliters DMEM plus 20%FBS. Haal daarna de zeefbekers met nylon mazen van 130 en 15 micron op en plaats deze bovenop de steriele bekerglazen van 150 milliliter. Pipetteer het celhomogenaat op het net van 100 micron.Verzamel het filtraat en pipetteer dit op het 30 micron gaas. Was het 30 micron gaas meerdere keren met vers DMEM plus 10%FBS. De meeste type twee cellen klonteren samen en passeren het gaas niet.Deze wasbeurten verwijderen niet-epitheliale cellen die aan de klonten kunnen zijn gehecht. Breng het filtraat van het 30 micron mesh aan op de 15 micron mesh zeefbeker. Was opnieuw meerdere keren zoals hiervoor beschreven.Deze stap dient om de type twee cellen te selecteren die mogelijk door het 30 micron mesh zijn gepasseerd. Verzamel de geclusterde niet-gefilterde cellen van de 30 en 15 micron meshes voor verdere verrijking van type twee cellen. Bewaar het filtraat van de 15 micron mesh indien er foetale longfibroblasten van knaagdieren gekweekt moeten worden.Werp anders dit filtraat weg. Zuiver vervolgens de epitheelcelpopulatie van type twee door medium toe te voegen en de niet-gefiltreerde cellen uit de 30 en 15 micron mesh cups gedurende 30 minuten te incuberen in een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter. Centrifugeer na deze incubatie het supernatant zoals eerder beschreven, pellet de cellen en resuspendeer de pellet vervolgens in 2 mL serumvrij DMEM. Pipetteer 1 mL van de celsuspensie in elke put van de laminine-gecoate BioFlex six-well plates. Op dit punt verschijnen de cellen in klonten wanneer ze onder de microscoop worden geobserveerd. Incubeer de plaat in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2. Een incubatie van 24 uur is optimaal, waarbij een minimale incubatie van 6 uur vereist is.Voordat u begint met de experimenten naar mechanische rek, neemt u het filtraat van het 15 micron mesh en brengt u dit over naar een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter bij 37 °C gedurende 30 tot 60 minuten om de fibroblasten te laten hechten; aspireer vervolgens en gooi het supernatant weg. Vervang daarna het volume in de fles door serumvrije DMEM en incubeer dit gedurende de nacht. Oogst de volgende dag de cellen met 0,25% trypsine in 0,4 millimol EDTA en zaai ze uit op met fibronectine gecoate BioFlex-platen; incubeer deze in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% koolstofdioxide, bij voorkeur gedurende 24 uur voordat u begint met de experimenten naar mechanische rek.Een incubatie van minimaal zes uur is vereist indien een specifiek aantal cellen nodig is voor de experimenten. Type two-cellen worden na isolatie onderhouden in serumvrije DMEM in kolven van 75 vierkante centimeter; de volgende dag worden de cellen getrypsineerd, geteld en vervolgens gezaaid. De monoclaag mag niet meer dan 80% confluent zijn vóór de aanvang van de experimenten. Op de dag van het mechanische stimulatie-experiment wordt het kweekmedium vervangen door twee milliliters vers serumvrij DMEM per putje, waarna de plaat wordt geplaatst in een Flexcell FX 5.000 strain-unit.Pas vervolgens EQU biaxiale rek toe op de membranen. Het schema van de rek varieert afhankelijk van de simulatie van mechanische krachten in vivo. Zoals besproken in het schriftelijke protocol, werden cellen gekweekt op niet-ST gerekte membranen.Parallel gecultiveerde cellen dienen als controles voor het experiment. Aan het einde van het experiment kunnen de monolagen worden verwerkt om veranderingen in genexpressie te analyseren via real-time PCR of veranderingen in eiwitovervloed via western blot. Daarnaast kunnen de monolagen worden gefixeerd voor immunochemische experimenten met deze techniek.Na fixatie worden de astische membranen uit de platen gesneden en op glazen objectglaasjes gemonteerd met behulp van 10 tot 20 µL water als monteermiddel, voorafgaand aan de permeabilisatie en incubatie met antilichamen. Het supernatant van het experiment kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van vrijgekomen stoffen, zoals groeifactoren of cytokinen, te onderzoeken. Deze afbeelding toont formaline-gefixeerde E 18 foetale type twee epitheelcellen die zijn geïsoleerd volgens dit protocol en zijn uitgeplaat op BioFlex-platen gecoat met laminine.De cellen werden gefixeerd en er werd een foto gemaakt. De dag na de non-ST stretch werden de cellen gezaaid. De zuiverheid van de cellen werd bepaald op 90 ± 5% door microscopische analyse van de epitheelcelmorfologie en immuunkleuring voor surfactantproteïne C. De volgende figuren presenteren gegevens van foetale type 2 epitheelcellen die gedurende 16 uur werden blootgesteld aan een cyclische rek van 5% bij 40 cycli per minuut.Deze northern blot van de expressie van surfactant proteïne C mRNA illustreert dat rek differentiatie van type twee cellen induceert met behulp van verschillende ECM-substraten. De plus- en mintekens staan respectievelijk voor blootstelling aan rek of geen blootstelling aan rek. De expressiegegevens worden in het histogram weergegeven als gemiddelde plus of min SEM, waarbij N gelijk is aan drie, en het sterretje duidt op een P-waarde van minder dan 0,05.Deze fluorescentie-immunochemische beelden tonen de gehaltes van surfactantproteïne C in het groen. In foetale type 2-cellen die niet waren blootgesteld aan mechanische rek (links) en cellen die wel waren blootgesteld aan mechanische rek (rechts) zijn de kernen tegengekleurd met dapi, wat blauw verschijnt. Dit histogram kwantificeert de resultaten van western blots uit drie experimenten, waaruit blijkt dat mechanische rek de gehaltes van surfactantproteïne C verhoogt.In dit experiment is N gelijk aan drie en het asterisk geeft een P-waarde van minder dan 0,05 aan. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe foetale longcellen kunnen worden gekweekt en blootgesteld aan mechanische rek.

an-experimental-system-to-study-mechanotransduction-fetal-lung

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem.

Muis embryonale Lung Cultuur, een systeem om de moleculaire mechanismen van Vertakken Evalueer

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Veel zoogdiercellen migreren bij voorkeur naar een stijvere matrix of substraat via durotaxie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudig in vitro systeem te bieden dat kan worden gebruikt om cel durotaxie gedragingen te bestuderen en te manipuleren door het opnemen van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten van gedefinieerde stijfheid, in combinatie met glazen dekglasjes.

Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo's uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.

Mechanostimulatie van meercellige organismen via een microfluïdisch compressiesysteem met hoge doorvoer

Dit werk presenteert een diermodel van endotheliale-naar-mesenchymale overgangsgeïnduceerde fibrose, zoals te zien is bij aangeboren hartafwijkingen zoals kritieke aortastenose of hypoplastisch linkerhartsyndroom, wat gedetailleerde histologische weefselevaluatie, de identificatie van regulerende signaalroutes en het testen van behandelingsopties mogelijk maakt.

Een neonataal heterotopisch rattenharttransplantatiemodel voor de studie van endotheel-naar-mesenchymale overgang

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Een unieke tissue engineering methode werd ontwikkeld om een ​​groot aantal zenuwvezels in de cultuur langwerpig door indient axon stretch groei, een vorm van het zenuwstelsel waarbij de groei van zenuwen langwerpig in combinatie met een groei van de zich uitbreidende lichaam.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

Leer mechanotransductie in foetale longcellen bestuderen met een in vitro-systeem voor mechanische stimulatie. Deze methode isoleert type II epitheelcellen en fibroblasten om longontwikkeling en longletsel te onderzoeken.

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Meer video's verkennen