Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks
October 22nd, 2011
Spontane activiteit van de ontwikkeling van neuronale netwerken kan worden gemeten met behulp van AM-ester vormen van calcium-gevoelige indicator kleurstoffen. Veranderingen in de intracellulaire calcium, met vermelding van neuronale activatie, worden gedetecteerd als voorbijgaande veranderingen in de indicator fluorescentie met een-of twee-foton beeldvorming. Dit protocol kan worden aangepast voor een bereik van hun ontwikkeling afhankelijk van neuronale netwerken In vitro.
Het algemene doel van deze film is om te laten zien hoe netwerkactiviteit kan worden gemeten van zich ontwikkelende corticale hersenslices met behulp van calciumgevoelige fluorescente indicator. DY-hersenslices worden gemaakt van de zich ontwikkelende enterale cortex van een jonge muis. Zowel neuronen als astrocyten zijn geladen met calciumafhankelijke markers.
Veranderingen in de fluorescentie van calciumafhankelijke kleurstoffen weerspiegelen veranderingen in cellulaire activiteit. Niet-neuronale cellen, inclusief astrocyten, microglia en endotheelcellen, kunnen worden gekleurd met specifieke markerkleurstoffen. Corticale netwerkactiviteit wordt geregistreerd met behulp van time-lapse Multifoton beeldvorming. Cellen worden gedetecteerd binnen het netwerk door een 3D-stack van beelden door het gebied van belang te maken.
Veranderingen in cellulaire fluorescentie over meerdere cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd om de activiteit van het zich ontwikkelende corticale netwerk af te lezen. Een kenmerkend patroon van activiteit in het zich ontwikkelende zenuwstelsel is spontane gesynchroniseerde netwerkactiviteit. Gesynchroniseerde activiteit is waargenomen in veel verschillende zich ontwikkelende neuronale regio's, inclusief intacte ruggenmergcortex en gedissocieerde neuronale cultuurvoorbereidingen tijdens perioden van spontane activiteit. Neuronen worden gedepolariseerd om te vuren, enkele spikes of bursts van actiepotentialen activeren veel ijzerkanalen, inclusief spanningsafhankelijke calciumkanalen die leiden tot calciuminflux.
Hoog gesynchroniseerde activiteit is gemeten van lokale netwerken met behulp van veldelektroden of multi-elektrode arrays. Deze mogelijkheden maken hoge tempoele bemonsteringssnelheden mogelijk, maar geven een lagere ruimtelijke resolutie vanwege de geïntegreerde uitlezing van celactiviteit. Single-cell resolutie van neurale activiteit is mogelijk met behulp van patch clamp elektrofysiologie van enkele neuronen om de vuurfrequentie te meten.
Echter, het vermogen om van een netwerk te meten is beperkt tot het aantal neuronen dat tegelijkertijd wordt gepatcht, en is doorgaans slechts één of twee neuronen. Het gebruik van calciumafhankelijke fluorescente indicatorkleurstoffen heeft de meting van gesynchroniseerde activiteit over een netwerk van cellen mogelijk gemaakt. Deze techniek geeft zowel hoge ruimtelijke resolutie als voldoende temporele bemonstering om spontane activiteit van het zich ontwikkelende netwerk te registreren.
Fluorescente calciumgevoelige indicatoren zoals URA 2:00 AM-ester bevatten carbonzuurgroep die in staat zijn om calciummines te binden. Deze fluorescente kleurstoffen worden geactiveerd door specifieke lichtgollengtes, hetzij met één foton of twee foton microscopie. Het aantal fotonen dat van de kleurstof wordt uitgezonden, wordt tijdelijk veranderd bij binding van calcium.
Deze verandering in het aantal fotonen of fluorescentie wordt gerapporteerd als het delta FF-signaal en komt overeen met een verandering in het calciumniveau binnen het neuron. De meting van veranderingen in calciumgevoelige indicatoren is een nuttige uitlezing van netwerkactiviteitspatronen in zich ontwikkelende cellen. Hallo, ik ben Rianna Morty, En mijn naam is Julie Abbots.
Wij komen van het Department of Interpretive Neurofysiologie en de universiteit in Amsterdam. Wij hebben calciumbeeldvorming gebruikt om functionele activiteit in zich ontwikkelend weefsel in de muizencortex te bestuderen met behulp van calciumgevoelige indicatoren bij multifocale beeldvorming. Het doel van deze korte film is om te laten zien hoe deze methoden kunnen worden gebruikt om zowel spontane als geëvoqueerde activiteitspatronen in zich ontwikkelende netwerken in het zenuwstelsel te meten.
Verwijder het brein Snel uit de schedel van een jonge muis om schade aan de neurale circuiterie te beperken. Dissecteer het brein uit in ijskoude slice-oplossing. De slice-oplossing bevat colinechloride in plaats van het natrium dat gewoonlijk wordt gebruikt in A TSF voor neuronale opnamen.
In deze experimenten maken we hersenslices van de enterale cortex van de zich ontwikkelende muizenhersenen. Plaats een stukje filterpapier bovenop een petro schotel en bevochtig met een paar milliliter A TSF. Breng het brein over op het stukje filterpapier.
Doorsnij de hemispheren met een eenzijdige scheermesjes. Scheid de twee hemispheren. Plaats een terug in de ijskoude slice-oplossing met de overgebleven hemispheren.
Verwijder de cerebellum met de scheermesjes. Draai een hemisphere om op zijn middenlijn en maak een snede van ongeveer een millimeter vanaf het dorsale oppervlak met een lichte hoek van het mes richting het rostrale uiteinde. Draai de hersenen om op.
Het onlangs gesneden oppervlak met behulp van een katoenen vogel en metalen spatel. Breng de hersenen over naar de metalen snijblokken. Duw de hersenen voorzichtig van de spatel met een katoenen vogel op het gelijmde oppervlak.
300 Micrometer hersenslices worden gesneden voor jong weefsel. Snijsnelheden en bladfrekwentie zijn doorgaans langzamer dan die gebruikt voor meer volwassen weefsel. Eenmaal gesneden, worden elke slice overgebracht met behulp van een glazen pipet. Slices worden overgebracht naar de houder, die geoxygeneerde A TSF bevat bij kamertemperatuur. De A CSF bevat een hogere verhouding van magnesium tot calcium dan de A CSF-oplossing.
Gebruikte slices voor opnamen worden gedurende een uur laten herstellen. Om de cellen te laden met een calciumafhankelijke indicator of celspecifieke marker, moeten slices worden overgebracht naar een kamer voor de kleuringsprocedure. Hoewel commerciële kamers beschikbaar zijn, kan er eenvoudig een worden samengesteld van standaard laboratoriumapparatuur voor zeer weinig kosten.
Om een kleuringskamer te maken, heb je de volgende basisapparatuur nodig: twee plastic petrischalen, een 10 milliliter spuit, een sectie van silicabuis, een celcultuur inzet met een semipermeabele membraan superlijm, drie kleine slangverbinders en een fijne draad naald. Neem de grote petrischaal en maak een klein gaatje met een verwarmde staaf door de zijwand. Neem de kleine petrischaal en maak een gaatje van vergelijkbare diameter groot genoeg voor de siliconenbuis om door te gaan.
Breng een sectie van siliconenbuis door het gaatje en vorm een lus in de kleine schaal. Gebruik superlijm om het open uiteinde van de slang te verzegelen. Plak vervolgens de rest van de slang aan de binnen
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het meten van netwerkactiviteit in zich ontwikkelende corticale hersenslices met behulp van calciumgevoelige fluorescente indicatoren. Het protocol maakt het mogelijk om spontane gesynchroniseerde activiteit in neuronale netwerken waar te nemen door middel van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Calciumgevoelige fluorescente indicatoren worden gebruikt om neuronale activiteit te meten.
- Spontane gesynchroniseerde activiteit is een kenmerk van zich ontwikkelende neuronale netwerken.
- Verschillende soorten cellen, waaronder neuronen en astrocyten, kunnen worden gekleurd voor beeldvorming.
- Time-lapse multifoton beeldvorming maakt hoge resolutie waarneming van netwerkactiviteit mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om het gebruik van calcium beeldvorming te demonstreren bij het bestuderen van functionele activiteit in zich ontwikkelend muis cortical weefsel.
- Om methoden te illustreren voor het meten van zowel spontane als opgewekte activiteitspatronen.
- Om een protocol te bieden voor het voorbereiden en beeldvormen van hersenslices.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hersenslices van de zich ontwikkelende muis cortex.
- Beladen van cellen met calciumafhankelijke indicatoren.
- Time-lapse multifoton beeldvorming om netwerkactiviteit op te nemen.
- Analyse van fluorescentie veranderingen om cellulaire activiteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van gesynchroniseerde activiteit in neuronale netwerken.
- Demonstratie van de effectiviteit van calciumgevoelige kleurstoffen bij het vastleggen van dynamische veranderingen in fluorescentie.
- Identificatie van spontane activiteitspatronen in zich ontwikkelende corticale netwerken.
- Hoge ruimtelijke resolutie bereikt door middel van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
Conclusies
- Het gebruik van calcium beeldvorming biedt waardevolle inzichten in de functionele activiteit van zich ontwikkelende neuronale netwerken.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende neuronale culturen en ontwikkelingsstadia.
- Toekomstige studies kunnen deze technieken gebruiken om neuronale netwerkdynamica verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Functional calcium imaging enables high-resolution mapping of spontaneous synchronized activity in developing cortical networks, a key process in early neurodevelopment. This approach supports target validation by linking network dynamics to circuit formation mechanisms relevant to neuropsychiatric disorder models. The technique provides predictive confidence in preclinical models by capturing functional readouts that correlate with synaptic maturation and plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring network-level calcium flux as a proxy for neuronal excitability and synaptic connectivity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantification of synchronized activity patterns that reflect functional circuit maturation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate network synchrony in disease-relevant developing cortical systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with cell-type-specific labeling (neurons and astrocytes) for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatial-resolution, temporally sampled delta F/F signals enabling detection of activity changes across multicellular networks.
- Screening Scalability: Facilitates reliable compound evaluation by capturing network-wide responses rather than single-cell measurements, improving assay physiological relevance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early cortical network dysfunction implicated in neurodevelopmental disorders, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing a functional readout of network activity that can be tracked across developmental stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by measuring compound effects on spontaneous network synchrony, a mechanistic indicator of circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional network activity data that informs target engagement and lead optimization decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurodevelopmental targets by measuring changes in network synchrony as a functional biomarker of circuit formation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible calcium flux readouts with cellular resolution, enabling comparison of drug effects across neuronal and glial populations.
- Analytics: Generates quantitative delta F/F measurements that allow teams to compare conditions and assess compound-induced modulation of network dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling activity patterns known to regulate synaptogenesis and plasticity, processes disrupted in neuropsychiatric conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal study of network development across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of network-level activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined slice preparation, dye loading, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on functional network phenotypes rather than molecular binding alone.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue or modulate pathological network synchrony in developing cortical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, multiphoton microscopy, and calcium imaging probe handling.
- Depends on access to titanium sapphire lasers, multiphoton systems, and environmental control for slice viability.
- Necessitates cross-team standardization between neurobiology and imaging teams for consistent slice preparation and data analysis.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different developmental stages or disease models.
- Limited by photobleaching and dye toxicity during prolonged imaging, requiring optimization of excitation intensity and incubation conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:03
Title
3:00
Step 1 Making horizontal hippocampal/cortical slices from young mouse brain
5:57
Step 2 Preparation of the staining chamber
8:48
Step 3 Staining of slices
10:21
Step 4 Non-neuronal dyes and older tissue
12:02
Step 5 Attaching slice to recording chamber
13:36
Step 6 Imaging
15:58
Conclusion
