Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

Dit MY two H-systeem is een verbetering van het conventionele gist-twee-hybrideprotocol om het aantal fout-positieven aanzienlijk te verminderen. Voer eerst een kleinschalige transformatie van het bait-plasmide in gist uit. Nadat het bait-construct is gevalideerd met behulp van een competitieve inhibitor-screen, wordt de cDNA-bibliotheek op minus vier-platen gescreend.

Vervolgens worden de positieve klonen geverifieerd met XGL- en reactie-assays. Daarna worden de potentiële interagerende eiwitten geïdentificeerd middels DNA-sequencing en bio-informatische analyse. Uiteindelijk verhoogt dit aangepaste gist-twee-hybride systeem de effectiviteit en het succes van het screeningsproces aanzienlijk.

Het conventionele gist-twee-hybride-systeem staat erom bekend dat het veel fout-positieven genereert. In deze video wordt de aangepaste screeningsprocedure getoond die aanzienlijk is verbeterd ten gunste van tweepuntsstaarten. Laten we beginnen.

Inoculeer 50 milliliter YPD met een overnachtcultuur van vijf milliliter MAV 2 0 3. Laat dit twee tot vier uur groeien bij 30 °C. Oogst vervolgens de gist door centrifugatie, resuspendeer de pellets na één wasbeurt in twee milliliter oplossing één en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

Bereid de DNA-mix voor de transformatie voor. Voeg 100 µL gistcellen toe en meng goed. Voeg vervolgens 700 µL van oplossing twee toe en meng goed.

Incubeer eerst 30 minuten bij 30 °C en voer daarna een hitteshock uit. Oogst de cellen nu via centrifugatie en resuspendeer het pellet in 200 µL autoclaaf-gedestilleerd water. Verspreid seriële verdunningen van de suspensie op SD LU-platen en incubeer deze twee tot drie dagen bij 30 °C. Deze stap bevestigt dat het bait-plasmide de transcriptie activeert en dat deze zelfactivatie geneutraliseerd kan worden door inhibitoren zoals 3, een competitieve inhibitor van het HIS3-genproduct.

Transformeer eerst het bait-plasmide in MAV 2 0 3 gist. Verspreid de reactie op SD LU-platen en incubeer bij 30 degrees Celsius. Om kolonies te screenen op 3-AT-geïnduceerde zelfactivatie, worden autoclave-tandenstokers gebruikt om kolonies van elke transformatie over te zetten op SD LU hiss-platen die toenemende concentraties 3-AT bevatten; incubeer de platen bij 30 degrees Celsius.

Elimineer lokaasstammen die groeien op platen met 100 millimolar 3-AT als ongeschikt voor gebruik in de twee-hybride screening voor re. Selecteer voor de resterende lokazen de laagste 3-AT-concentratie die de celgroei remt voor gebruik bij de CD NA-bibliotheekscreening; suspendeer verschillende geïsoleerde kolonies gist die het lokaasplasmid bevatten in 100 µL autoclaaf-gedestilleerd water. Verspreid deze over twee SD LU-platen van 10 centimeter.

Incubeer beide platen bij 30 °C. Schraap de cellen af en suspendeer deze volledig in 10 mL. Autoclaveer gedestilleerd water en inoculeer 500 mL vloeibaar YPD-medium.

Verifieer de celdichtheid via spectra, fotometrie en cultuur bij 30 °C. Ga over tot het oogsten van de cellen door middel van centrifugatie. Was één keer in 100 mL autoclaveerd gedestilleerd water en één keer in 50 mL van oplossing één.

Resuspendeer vervolgens de pellet in 2,5 milliliter oplossing één. Voeg nu gedenatureerd, geschoren zalmsperm-DNA toe, evenals de cDNA-bibliotheek, en meng dit voorzichtig door te pipetteren. Voeg daarna 15 milliliter oplossing twee toe die 40% polyethyleenglycol bevat.

Meng voorzichtig en verdeel aliquots van 700 µL over 25 autoclaveerbare 1,5 mL microcentrifugebuisjes. Incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad van 30 °C, gevolgd door een hitte-shock van 15 minuten in een waterbad van 42 °C.

Oogst de cellen door centrifugatie en resuspendeer elke pellet voorzichtig in 400 µL autoclaaf-gedistilleerd water. Verdeel elk transformatiemengsel over twee selectieplaten en incubeer deze gedurende vijf tot 10 dagen bij 30 °C als controle om de transformatie-efficiëntie van de reactieplaat te schatten. Seriële verdunningen van één reactie.

Bepaal na drie dagen incubatie bij 30 °C het totaal aantal kolonies. Breng de kolonies over naar een YPD-plaat en incubeer deze gedurende één nacht bij 30 °C. Plaats vervolgens een rond nitrocellulosemembraan direct op de YPD-plaat, waarbij wordt gewaarborgd dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Controleer na een minuut of alle koloniën naar de membranen zijn overgebracht. Plaats het membraan met de zijde van de koloniën naar boven in een bootje van aluminiumfolie en leg dit 20 seconden op het oppervlak van vloeibare stikstof. Dompel het membraan vervolgens gedurende enkele minuten onder in de vloeibare stikstof.

Verwijder nu het membraan om het te ontdooien. Bereid ondertussen een Petrischaal voor met een laag verse XCA-oplossing op Whatman-papier. Dompel vervolgens het ontdooide membraan voorzichtig onder en incubeer bij 37 °C.

Totdat er blauwe kolonies verschijnen. De overdracht van prooi, klonen en lokaasconstructen naar gist kan vals-positieve resultaten verder elimineren. Isoleer eerst het plasmid-DNA uit de giststammen die mogelijk interagerende eiwitten bevatten.

Transformeer DNA in e coli DH five alpha en selecteer door groei op LB ampicilline-platen. Screen de transformanten via restrictie-enzymanalyse. Co-transformeer nu de prey- en bait-plasmiden in gist MAV 2 0 3 op SC LU trip-platen en incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 °C.

Kies drie verschillende kolonies om de xal-assay-sequentie uit te voeren, het plasmide-DNA van de positieve klonen en identificeer genen met behulp van bio-informatica. In dit experiment werd de Rine-groeifactor pro Granulin gebruikt als lokaas om een brain CD NA-bibliotheek op 54 positieve klonen te screenen.

Kandidaten werden geïsoleerd uit een groep van 2,5 miljoen. Transformanten werden gescreend met het pro-granuline-aas. Verdere analyses via de ex skull-assay wezen op 23 positieve kloonkandidaten voor het pro-granuline-aas.

Interessant is dat bioinformatische analyses van sequencinggegevens TNF R2 identificeerden. Indeed. Verdere functionele experimenten bevestigden progranuline als een nieuwe ligand van TNF-receptoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze gemodificeerde gist-twee-hybride-screen uitvoert met uw eiwit van interesse.

Vergeet niet met handschoenen te werken, aangezien sommige gebruikte reagentia gevaarlijk zijn. Veel succes met uw experimenten.