Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een zeer gezuiverde preparatie van dendritische cellen uit de long van een muis. Dit wordt bereikt door eerst het longweefsel te verzamelen zonder de drainerende lymfeklieren mee te nemen. Vervolgens wordt er een suspensie van enkelvoudige cellen verkregen door middel van collagenasedigestie.

De volgende stap is het verrijken van de CD 11 C-positieve cellen met behulp van een magnetisch celisolatiesysteem. Vervolgens wordt de conventionele dendritische celsubset geïsoleerd via flowcytometrische celsortering. Uiteindelijk kunnen de uit muislongweefsel geïsoleerde conventionele dendritische cellen worden geanalyseerd met flowcytometrie en lichtmicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunologie, zoals wat de betrokkenheid is van conventionele dendritische cel-subsets bij aangeboren immuniteit en infectieziekten in de luchtwegen? De procedure zal worden gedemonstreerd door Issa Lancelin, een onderzoeker uit mijn laboratorium, en mijzelf. Begin na het eutanasiëren van de muis met het insnijden en vervolgens voorzichtig terugtrekken van de buitenste huid van het peritoneum om de borstholte bloot te leggen.

Vervolgens wordt het diafragma geopend door de ribbenkast door te snijden om zowel het hart als de longen bloot te leggen. Zodra het hart en de longen zijn blootgelegd, kan de perfusieprocedure beginnen. Vul een spuit van vijf milliliter met E-D-T-A-H-B-S-S en bevestig een 25 gauge naald aan de spuit.

Steek vervolgens de naald in de rechterventrikel om lekkage tijdens de injectie te voorkomen. Gebruik een pincet om het myocardiale weefsel rond de naald te fixeren. Injecteer daarna voorzichtig de oplossing terwijl een constante druk wordt gehandhaafd.

Nauwkeurige perfusie zal resulteren in longopblaasing en een kleurverandering naar roze of wit; om mogelijke contaminatie te voorkomen, moeten de drainerende lymfeklieren worden verwijderd en weggegooid. Verzamel vervolgens het longweefsel door het uitgesneden orgaan over te brengen naar een Petrischaal op ijs. Vul een gentle max C-buis met vijf milliliters longcollagenase-digestiesolutie en snijd de long vervolgens in kleine stukjes.

Breng het weefsel met een scheermesje over in de buis met behulp van een zachte maximale dissociatie. Kies programma M lung zero one om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Incubeer het monster vervolgens 30 minuten bij 37 °C en schud de buis elke vijf minuten om de weefselfragmenten opnieuw te suspenderen; ga daarna verder met programma M lung zero two.

Breng het monster nu over in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 335 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg twee milliliter CK-lysebuffer toe aan het pellet gedurende één minuut bij kamertemperatuur om de resterende rode bloedcellen te lyseren. Was de cellen vervolgens met 13 milliliter koude PBS aangevuld met 0,5% BSA.

Nadat het supernatant is weggegooid, wordt dit pellet opnieuw gesuspendeerd in vijf milliliter koud PBS plus BSA, waarna de celoplossing door een nylon gaas van 100 micrometer wordt geleid. Bepaal vervolgens het totaal aantal cellen via trypaanblauw-exclusie. In plaats van een zachte maximale dissociatie te gebruiken, vult men een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter collagenase-oplossing per long.

Voeg het gesnipperde longweefsel toe aan de buis en incubeer het longweefsel gedurende één uur bij 37 °C. Vortex de cellen elke 15 minuten om de weefselfragmenten opnieuw te resuspenderen. Disrupt vervolgens het verterende weefsel door het monster zes tot acht keer door een spuit van drie milliliter te halen, verbonden met een naald van 20 gauge.

Vermijd het ontstaan van bellen tijdens dit proces. Was eerst de enkelcellususpensie 10 minuten lang bij 200 ×g bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen vervolgens in 400 µL separatiebuffer.

Blokkeer de aspecifieke antilichaambinding via FC in de acht totale celblokken met 0,5 micrograms anti CD 1632 antilichaam en laat de zes cellen gedurende 30 minuten incuberen bij vier graden Celsius. Na het wassen van de cellen met 10 milliliters koud scheidingsbuffer, resuspendeer de cellen in 400 more microliters scheidingsbuffer. Voeg vervolgens 100 microliters CD 11 C micro beads toe aan de acht totale cellen, meng dit goed en laat de cel- en beadoplossing 15 minuten incuberen in de koelkast.

Verwijder de niet-gebonden kraaltjes met 10 milliliters koude scheidingsbuffer, gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellet in één milliliter koude scheidingsbuffer. Laad tenslotte de monsters in de AutoMax pro-separator en voer het P-O-S-S-E-L-D-programma uit om de CD 11 C-expresserende celfractie te verzamelen.

Incubeer de verrijkte CD 11 C-positieve cel-suspensie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met anti-CD 11 C PEI zeven en antilichamen gericht tegen de MHC-klasse II-moleculen die op deze cellen aanwezig zijn. Nadat de cellen gewassen zijn met koud PBS plus BSA, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 0,5 milliliters PBS plus BSA en door een nylon gaasfilter van 40 micrometer geleid. Voeg ten slotte de gezuiverde CD 11 C-positieve cellen toe aan een fax-buis voor latere kwantificering in afzonderlijke blanco buizen.

Voeg 100 µL PBS plus BSA toe aan buisjes van vijf milliliter om beschadiging van de gezuiverde cellen te voorkomen en sorteer de gefilterde cel-suspensie; houd de verzamelde cellen gedurende het hele sorteerproces op een gekoelde temperatuur. In deze densiteitsplots zijn er in de milt meer dan drie keer zoveel conventionele dendritische cellen gevonden als in de long. Bovendien bevatten de CD11c-positieve cellen in de long een celpopulatie die geen conventionele dendritische cellen zijn, zoals weergegeven door de groep events met een lage MHC-klasse II-expressie buiten de gate voor conventionele dendritische cellen.

Aan de linkerzijde van de figuur, zoals te zien in deze densiteitsplot, verhoogt magnetische scheiding van totale longcellen het aantal conventionele dendritische cellen op basis van CD 11 C van ongeveer 1,5% van de totale cellen naar ongeveer 16,5%. Echter vormen CD 11 C-positieve MHC Klasse II-lage macrofagen nog steeds meer dan 70% van de totale celpopulatie, wat de zuiverheid van de verrijkte subset van conventionele long-dendritische cellen in deze fase van het isolatieproces aanzienlijk beïnvloedt. Sorteren via FACS verhoogt echter de zuiverheid van de conventionele dendritische cellen naar meer dan 96%, zoals te zien is in de microfoto rechtsboven. De CD 11 C-hoge MHC Klasse II-hoge conventionele dendritische cellen zijn ronde cellen met de typische dendrieten, terwijl de CD 11 C-hoge MHC Klasse II-lage cellen in de microfoto rechtsonder cellulaire uitstulpingen vertonen die meer kenmerkend zijn voor de morfologie van macrofagen.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het longweefsel en de single-cell preparatie bij de aangegeven temperaturen te behandelen. Dit is van cruciaal belang voor het behoud van de celviabiliteit en de conventionele opbrengst aan dendritische cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u subsets van dendritische cellen uit de long van een muis kunt isoleren.

De isolatie van pulmonale dendritische cel-subsets is een zeer nuttig instrument om inzicht te verkrijgen in de functies van deze cellen als reactie op respiratoire pathogenen en omgevingsfactoren die de immuunrespons van de gastheer in de longen kunnen triggeren.