Name: Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer de isolatie van conventionele dendritische cellen uit muizenlongweefsel met behulp van collageenasedigestie, magnetische celisolatie en flowcytometrische sortering. Deze methode ondersteunt immunologisch onderzoek naar longimmuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag naar Marilyn Dietrich danken aan het LSU Flow Cytometry Core Faciliteit voor haar hulp met de cel sorteer-en Peter Mottram voor zijn hulp bij de microfoto&#39;s. Dit werk werd gefinancierd door de Flight Attendant Medical Research Institute, het LSU-Competitive Research Program Award, en de NIH / NIAID Subsidies P20 RR020159 en R03AI081171.

1. Longperfusie en enkele celsuspensie <ol><li> Euthanaseren van de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine anesthesiemengsel (in mg / muis ketamine 1,8, xylazine 0,19) en verbloeding via de lies </li><li> Expose de borstholte door het snijden en voorzichtig terug te trekken de buitenste schil van het buikvlies. Ga verder naar het membraan openen door het snijden van de ribbenkast aan zowel het hart en de longen bloot te leggen. </li><li> Perfuseren zachtjes de longen met behulp van een 5 ml injectiespuit gevuld met EDTA-HBSS (1 mM EDTA in calcium / magnesium-vrij HBSS). Sluit een 25 G naald en steek naald in de rechter hartkamer. Om te voorkomen dat lekkage tijdens de injectie, zet de myocardiac weefsel rond de naald met behulp van een tang. Voorzichtig te injecteren oplossing met behoud van een constante druk. Nauwkeurige perfusie zal resulteren in long inflatie en een kleur te veranderen naar roze / wit. </li><li> Verwijder de drainerende lymfeklieren om eventuele besmetting van dit weefsel te verwijderen. </li><li> Verzamelenlongweefsel, over te dragen aan een petrischaaltje op het ijs, en hak het in kleine stukjes met behulp van een scheermesje. </li><li> Overdracht van de grond weefsel in een gentleMACS C buisje met 5 ml / long van collagenase spijsvertering oplossing (collagenase type 1A 0,5 mg / ml plus type IV runderen alvleesklier DNase 20 pg / ml in HBSS dat 5% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). </li><li> Gebruik de gentleMACS dissociator om een ​​enkele cel suspensie te verkrijgen. Kies het programma: m_lung_01. Incubeer monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Schud buis om de 5 minuten naar weefselfragmenten mengen. Ga verder met het programma m_lung_02. </li><li> Transfer monster tot een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C. Na deze stap, houden alle reagentia en centrifugations bij 4 ° C tot vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen te voorkomen. </li><li> Gooi supernatant en lyseren resterende rode bloedcellen door het toevoegen van 2 ml van ACK lyseren buffer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Was de cellen met 13ml koude PBS/0.5% BSA en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant, resuspendeer totaal cellen in 5 ml koud PBS/0.5% BSA en passeren een grondige 100 um nylon mesh. </li><li> Bepaal het totale aantal cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting kleurstof. </li></ol> 2. Magnetische isolatie en CD11c + cellen verrijking <ol><li> Centrifuge enkele celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer celpellet in 400 ul van scheiding buffer (PBS, 0,5% BSA, en 2 mM EDTA) per 10 in totaal 8 cellen. Block Fc-gemedieerde niet-specifieke binding van antilichaam door gebruik te maken anti-CD16/CD32 antilichaam (0.5μg / 10 6 cellen) gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen met 10 ml koude scheiding buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 400 ul van scheiding buffer. </li><li> Voeg 100 ul CD11c microkorrels per 10 8 </sup&gt; in totaal cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast (2-8 ° C). </li><li> Was de cellen met 10 ml koude scheiding buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 200 x g bij 4 ° C en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 3 ml koud scheiding buffer. </li><li> Voer magnetische scheiding met behulp van de autoMACS Pro TM Separator door het selecteren van het programma posseld. Verzamel de positieve fractie (0,5 ml). </li></ol> 3. Conventionele dendritische cel (CDC) isolatie <ol><li> Incubeer verrijkt CD11c positieve celsuspensie met anti-CD11c PE-Cy7 en anti-IA/IE (MHC-II)-FITC antilichamen gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Geoptimaliseerd de concentratie van antilichamen is 0,5 ug / 10 6 van cellen. </li><li> Was de cellen met koude PBS/0.5% BSA en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 335 x g bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 0,5 ml PBS/0.5% BSA en geven ze door een 40 urn nylon mesh. </li><li> Ga verder naarsorteert de cellen met behulp van de FACS Aria celsorteerder in de zuiverheid mode. Voeg 100 ul van PBS/0.5% BSA aan de collectie buizen in om schade van gezuiverde cellen te voorkomen. Houd uw cellen bij een gekoelde temperatuur in de cel sorteerproces. </li></ol> 4. Alternatief protocol voor het verkrijgen van een enkele cel schorsing en CD11c + cellen verrijking <ol><li> Ter vervanging van de gentleMACS dissociator, kan de grond longweefsel van stap 1.5 worden overgedragen aan een 15 ml conische buis met 5 ml van de oplossing per collagenase long en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Vortex cellen elke 15 minuten om weefselfragmenten mengen. Verstoren het weefsel door het passeren van het monster 6-8 keer in en uit door middel van een 3 ml spuit is aangesloten op een 20 G naald. Voorkomen dat bellen tijdens het proces, anders wordt de levensvatbaarheid van de cellen worden aangetast. Zodra enkele celsuspensie wordt verkregen, gaat u verder tot 1,8 stap. </li><li> Ter vervanging van de AutoMACSPro TM scheidingtor, magnetische isolatie voor de verrijking van de CD11c cellen, kunnen ook worden uitgevoerd door het passeren van de celsuspensie handmatig door middel van twee MACS kolommen. De keuze van de juiste kolommen zal variëren afhankelijk van de steekproefomvang. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Lung CDC worden geïdentificeerd als CD11c hi / MHC-II hi celpopulatie. Zoals getoond in Fig. 1, CDC vertegenwoordigen een kleiner percentage van 1,4% in vergelijking met sommige andere weefsels zoals milt (4,8%). Echter, in tegenstelling tot de milt, long CD11c positieve cellen uitdrukkelijke verschillende hoeveelheden van MHC-II, met inbegrip van een celpopulatie anders dan die van de CDC. Na de single-cell voorbereiding, de cel opbrengst van het totaal longcellen was ongeveer 3,0 tot 3,8 x 10 7 cellen / long met een levensvatbaarheid van 60-70%, waaruit een iets meer dan 1% CDC subset vertegenwoordigd. Dit percentage werd verhoogd na de CD11c magnetische isolatie, wanneer de totale long CDC werd opgehoogd ongeveer 10 tIMES (&gt; 16%) van het oorspronkelijke preparaat (Fig. 2A). Echter, CD11c cellen die lage hoeveelheden van MHC-II (CD11c hi / lo MHC-II, macrofagen) vertegenwoordigde een hoge besmetting celpopulatie (&gt; 70%), dat werd vermengd met de longen CDC subset. Zoals getoond in Fig. 2B, waren die cellen geëlimineerd na de celsortering stap wanneer de CDC zuiverheid&gt; 96% bereikt. De gebruikelijke opbrengst van CDC nadat de hele procedure werd 5 x 10 4 cellen / long. Microfoto&#39;s tonen morfologische kenmerken van de CDC als afgeronde cellen met de typische dendrieten (bovenste paneel). Aan de andere kant, CD11c hi / lo MHC-II vertegenwoordigde een morfologisch verschillende subset dat cellulaire uitsteeksels die typisch zijn voor macrofagen (MΦ, onderste paneel) 12 shows. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Figuur 1. Differentiële DC-frequentie in de muis longen en milt. Lung eennd milt weefsel van C57BL / 6 muizen werden verzameld en behandeld met collagenase. Naar aanleiding van collagenase spijsvertering, werden cellen gekleurd met anti-muis CD11c-PE-Cy7 en anti-muis IA / IE-FITC. Vertegenwoordiger van flowcytometrie plots tonen percentages van de CDC (CD11c hi / MHC-II hi) in de longen en milt. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Figuur 2. Isolatie van de CDC van muis longen. Muis long enkele celsuspensie werd gelabeld met anti-CD11c microbolletjes en doorgegeven door middel van een automatische cel afscheider. A) Een vertegenwoordiger plot toont de percentages van de CDC (CD11c hi / MHC-II hi) en macrofagen (MΦ, CD11c hi / lo MHC-II) populaties na CD11c verrijking. Verdere kleuring van de verrijkte fractie gevolgd met behulp van anti-muis CD11c-PE-Cy7 en anti-muis IA / IE-FITC. Dubbele positieve cellen werden gesorteerd en geanalyseerd door flowcytometrie. Naaridentificeren van hun morfologie, cellen werden cytospun en gekleurd met een aangepaste Wright-Giemsa kleuring. B) Representatieve percelen tonen percentages van CDC en MΦ na celsortering. Microfoto&#39;s tonen een representatief beeld van de longen CDC en long MΦ. Schaalbalk = 20 urn.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Isolatie van pulmonale muis DC is een belangrijke techniek voor de studie van een breed scala van respiratoire stimuli. Het proces van het verkrijgen van deze cellen bevat cruciale stappen die het verlies van cellen en levensvatbaarheid van de cellen en zuiverheid te voorkomen. Perfusie van de long voor de collectie zal helpen om een ​​perifere cellen te elimineren als contaminant erytrocyten te verminderen. Het gebruik van de geautomatiseerde dissociatie kan worden advanteogus wanneer een groot aantal van de longen wor...

<table width="200" border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> ACK lyserende buffer </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-muis CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 geconjugeerd </td></tr><tr><td> Anti-muis IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> FITC-geconjugeerd </td></tr><tr><td> Collangenase Type 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Cel filters </td><td> BD Falcon </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) microbolletjes </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Hank&#39;s oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes bufferoplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen 60 mm </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C-buizen </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Gentle MACS dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

isolatie van mouse lung dendritische cellen

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritische cellen (DC) spelen een fundamentele rol in sensing binnendringende ziekteverwekkers 1,2 als in de controle van tolerogene reacties 3 in de luchtwegen. Ten minste drie belangrijke subsets van long dendritische cellen zijn beschreven bij muizen: de conventionele DC (CDC) 4, plasmacytoïde DC (PDC) 5 en de IFN-producerende killer DC (IKDC) 6,7. De CDC subset is de meest prominente DC subset in de longen 8. De gemeenschappelijke marker bekend bij DC subsets te identificeren is CD11c, een type I transmembraan integrine (β2), die ook tot uitdrukking op monocyten, macrofagen, neutrofielen en een aantal B-cellen 9. In sommige weefsels, met behulp van CD11c als een marker voor muis-DC te identificeren geldig is, net als in de milt, waar de meeste CD11c + cellen vertegenwoordigen de CDC-subset die hoge niveaus van de belangrijkste histocompatibiliteitscomplex klasse II (MHC-II) uitdrukt. Echter, de long is een meer heterogeen weefsel waar wordenkant DC subsets, is er een hoog percentage van een afzonderlijke cel bevolking die hoge niveaus van CD11c uitdrukt bout lage niveaus van MHC-II. Op basis van haar karakterisering en meestal op de uitdrukking van F4/80, een milt macrofaag marker, heeft de CD11c hi MHC-II-lo long celpopulatie is geïdentificeerd als pulmonaire macrofagen, 10 en meer recentelijk, als een potentiële voorloper DC 11. In tegenstelling tot de muis PDC, heeft de studie van de specifieke rol van CDC in de pulmonale immuunreactie te wijten aan het ontbreken van een specifieke marker die kan helpen bij de isolatie van deze cellen beperkt. Daarom is in dit werk beschrijven we een procedure om sterk gezuiverd muis long CDC isoleren. De isolatie van pulmonale DC subsets is een zeer nuttig instrument om inzicht in de functie van deze cellen te krijgen in reactie op respiratoire pathogenen alsmede milieu-factoren die de gastheer immuunreactie in de longen kan leiden.

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Dendritische cellen (DC) in de longen spelen een fundamentele rol bij het detecteren van binnendringende pathogenen 1,2, evenals bij de controle van tolerogene responsen 3 in de ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een zeer gezuiverde preparatie van dendritische cellen uit de long van een muis. Dit wordt bereikt door eerst het longweefsel te verzamelen zonder de drainerende lymfeklieren mee te nemen. Vervolgens wordt er een suspensie van enkelvoudige cellen verkregen door middel van collagenasedigestie.De volgende stap is het verrijken van de CD 11 C-positieve cellen met behulp van een magnetisch celisolatiesysteem. Vervolgens wordt de conventionele dendritische celsubset geïsoleerd via flowcytometrische celsortering. Uiteindelijk kunnen de uit muislongweefsel geïsoleerde conventionele dendritische cellen worden geanalyseerd met flowcytometrie en lichtmicroscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunologie, zoals wat de betrokkenheid is van conventionele dendritische cel-subsets bij aangeboren immuniteit en infectieziekten in de luchtwegen? De procedure zal worden gedemonstreerd door Issa Lancelin, een onderzoeker uit mijn laboratorium, en mijzelf. Begin na het eutanasiëren van de muis met het insnijden en vervolgens voorzichtig terugtrekken van de buitenste huid van het peritoneum om de borstholte bloot te leggen.Vervolgens wordt het diafragma geopend door de ribbenkast door te snijden om zowel het hart als de longen bloot te leggen. Zodra het hart en de longen zijn blootgelegd, kan de perfusieprocedure beginnen. Vul een spuit van vijf milliliter met E-D-T-A-H-B-S-S en bevestig een 25 gauge naald aan de spuit.Steek vervolgens de naald in de rechterventrikel om lekkage tijdens de injectie te voorkomen. Gebruik een pincet om het myocardiale weefsel rond de naald te fixeren. Injecteer daarna voorzichtig de oplossing terwijl een constante druk wordt gehandhaafd.Nauwkeurige perfusie zal resulteren in longopblaasing en een kleurverandering naar roze of wit; om mogelijke contaminatie te voorkomen, moeten de drainerende lymfeklieren worden verwijderd en weggegooid. Verzamel vervolgens het longweefsel door het uitgesneden orgaan over te brengen naar een Petrischaal op ijs. Vul een gentle max C-buis met vijf milliliters longcollagenase-digestiesolutie en snijd de long vervolgens in kleine stukjes.Breng het weefsel met een scheermesje over in de buis met behulp van een zachte maximale dissociatie. Kies programma M lung zero one om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Incubeer het monster vervolgens 30 minuten bij 37 °C en schud de buis elke vijf minuten om de weefselfragmenten opnieuw te suspenderen; ga daarna verder met programma M lung zero two.Breng het monster nu over in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 335 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg twee milliliter CK-lysebuffer toe aan het pellet gedurende één minuut bij kamertemperatuur om de resterende rode bloedcellen te lyseren. Was de cellen vervolgens met 13 milliliter koude PBS aangevuld met 0,5% BSA.Nadat het supernatant is weggegooid, wordt dit pellet opnieuw gesuspendeerd in vijf milliliter koud PBS plus BSA, waarna de celoplossing door een nylon gaas van 100 micrometer wordt geleid. Bepaal vervolgens het totaal aantal cellen via trypaanblauw-exclusie. In plaats van een zachte maximale dissociatie te gebruiken, vult men een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter collagenase-oplossing per long.Voeg het gesnipperde longweefsel toe aan de buis en incubeer het longweefsel gedurende één uur bij 37 °C. Vortex de cellen elke 15 minuten om de weefselfragmenten opnieuw te resuspenderen. Disrupt vervolgens het verterende weefsel door het monster zes tot acht keer door een spuit van drie milliliter te halen, verbonden met een naald van 20 gauge.Vermijd het ontstaan van bellen tijdens dit proces. Was eerst de enkelcellususpensie 10 minuten lang bij 200 ×g bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen vervolgens in 400 µL separatiebuffer.Blokkeer de aspecifieke antilichaambinding via FC in de acht totale celblokken met 0,5 micrograms anti CD 1632 antilichaam en laat de zes cellen gedurende 30 minuten incuberen bij vier graden Celsius. Na het wassen van de cellen met 10 milliliters koud scheidingsbuffer, resuspendeer de cellen in 400 more microliters scheidingsbuffer. Voeg vervolgens 100 microliters CD 11 C micro beads toe aan de acht totale cellen, meng dit goed en laat de cel- en beadoplossing 15 minuten incuberen in de koelkast.Verwijder de niet-gebonden kraaltjes met 10 milliliters koude scheidingsbuffer, gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellet in één milliliter koude scheidingsbuffer. Laad tenslotte de monsters in de AutoMax pro-separator en voer het P-O-S-S-E-L-D-programma uit om de CD 11 C-expresserende celfractie te verzamelen.Incubeer de verrijkte CD 11 C-positieve cel-suspensie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met anti-CD 11 C PEI zeven en antilichamen gericht tegen de MHC-klasse II-moleculen die op deze cellen aanwezig zijn. Nadat de cellen gewassen zijn met koud PBS plus BSA, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 0,5 milliliters PBS plus BSA en door een nylon gaasfilter van 40 micrometer geleid. Voeg ten slotte de gezuiverde CD 11 C-positieve cellen toe aan een fax-buis voor latere kwantificering in afzonderlijke blanco buizen.Voeg 100 µL PBS plus BSA toe aan buisjes van vijf milliliter om beschadiging van de gezuiverde cellen te voorkomen en sorteer de gefilterde cel-suspensie; houd de verzamelde cellen gedurende het hele sorteerproces op een gekoelde temperatuur. In deze densiteitsplots zijn er in de milt meer dan drie keer zoveel conventionele dendritische cellen gevonden als in de long. Bovendien bevatten de CD11c-positieve cellen in de long een celpopulatie die geen conventionele dendritische cellen zijn, zoals weergegeven door de groep events met een lage MHC-klasse II-expressie buiten de gate voor conventionele dendritische cellen.Aan de linkerzijde van de figuur, zoals te zien in deze densiteitsplot, verhoogt magnetische scheiding van totale longcellen het aantal conventionele dendritische cellen op basis van CD 11 C van ongeveer 1,5% van de totale cellen naar ongeveer 16,5%. Echter vormen CD 11 C-positieve MHC Klasse II-lage macrofagen nog steeds meer dan 70% van de totale celpopulatie, wat de zuiverheid van de verrijkte subset van conventionele long-dendritische cellen in deze fase van het isolatieproces aanzienlijk beïnvloedt. Sorteren via FACS verhoogt echter de zuiverheid van de conventionele dendritische cellen naar meer dan 96%, zoals te zien is in de microfoto rechtsboven. De CD 11 C-hoge MHC Klasse II-hoge conventionele dendritische cellen zijn ronde cellen met de typische dendrieten, terwijl de CD 11 C-hoge MHC Klasse II-lage cellen in de microfoto rechtsonder cellulaire uitstulpingen vertonen die meer kenmerkend zijn voor de morfologie van macrofagen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het longweefsel en de single-cell preparatie bij de aangegeven temperaturen te behandelen. Dit is van cruciaal belang voor het behoud van de celviabiliteit en de conventionele opbrengst aan dendritische cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u subsets van dendritische cellen uit de long van een muis kunt isoleren.De isolatie van pulmonale dendritische cel-subsets is een zeer nuttig instrument om inzicht te verkrijgen in de functies van deze cellen als reactie op respiratoire pathogenen en omgevingsfactoren die de immuunrespons van de gastheer in de longen kunnen triggeren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

In dit artikel tonen we de isolatie van murine inwoner long mesenchymale stamcellen (MSC long), hun expansie, karakterisering en analyse van immunomodulerende eigenschappen.

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Leer de isolatie van conventionele dendritische cellen uit muizenlongweefsel met behulp van collageenasedigestie, magnetische celisolatie en flowcytometrische sortering. Deze methode ondersteunt immunologisch onderzoek naar longimmuniteit.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Meer video's verkennen