Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

Om de translocatie van peptiden over vesikelmembranen te kwantificeren. Fluorescent gelabelde lipidovesikels worden gegenereerd met ingekapseld trypsine. Er wordt een trypsine-inhibitor toegevoegd om de activiteit van elk exogeen trypsine te remmen, waardoor actief trypsine in het lumen van de vesikel achterblijft.

Pas wanneer fluorescent gelabelde peptiden aan de vesicles worden toegevoegd, fungeren hun fluorescente labels als FRET-donoren en exciteren zij de fluorescente moleculen op de vesicle. Wanneer eiwitten echter door het membraan migreren, worden ze door trypsine verteerd en gaat het FRET-signaal verloren. Spectrometrische analyse onthult de mate van peptide-translocatie, wat zichtbaar is als een afname van de FRET tussen de vesicles en het peptide na verloop van tijd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, waaronder andere technieken met lipidovesikels en methoden om de peptide-opname in cellen te meten, is dat het informatie verschaft over de kinetiek van de membraanpassage en dat er geen toevoeging van een fluorescent label aan de peptiden vereist is indien ze een tryptofaan bevatten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij het ontwerp en de engineering van membraanactieve peptiden, zoals welke kenmerken noodzakelijk zijn voor een effectieve membraantranslocatie. De eerste stap van deze procedure is het bereiden van grote unilamellaire lipidovesikels of UUV's om te dienen als celmembraanmimics voor de assay.

Begin met het combineren van fosfatidylcholine, fosfatidylglycerol en vijf dimethylaminonaphthalène-1-sulfofosfatidylethanolamine in chloroform. In een verhouding van 50:45:5 is 0,376 milligram aan totaal lipide doorgaans voldoende om genoeg vesicles te maken voor één enkele experimentele of controleproef.

Bereid één vial voor als experimentele monster en één als controle; laat het chloroform verdampen met behulp van een stroom nitrogengas. De gedroogde lipiden die na deze stap overblijven, worden aangeduid als lipid cakes. Droog de lipid cakes gedurende negen tot 14 uur in een vacuümdessicator.

Bereid vervolgens een 10 millimolaire HEI-stamsoplossing, een 0,4 millimolaire porcine trypsine-stamsoplossing en een 4,0 millimolaire Bowman Burke trypsine-remmer stamsoplossing voor; details voor de bereiding zijn te vinden in het bijbehorende document. Voeg een gelijk volume van de 0,4 millimolaire trypsine-stamsoplossing en de 10 millimolaire HEI-buffersoplossing toe aan de gedroogde lipidecakes. Vortex vervolgens het vials om de multilamellaire vesikels of mvs te reconstitueren. Reconstitueer de controle-mvs door een gelijk volume van de 0,4 millimolaire trypsine-stamsoplossing en 4,0 millimolaire trypsine-remmer aan de gedroogde lipidecake toe te voegen en zoals voorheen te vortexen.

Zodra de mvs zijn gereconstitueerd, worden de MLV-oplossingen overgebracht van de glazen vials naar 1,7 milliliter microcentrifugebuisjes. Onderwerp de MLV-oplossingen vervolgens aan vijf vries-dooi-cycli, waarbij wordt afgewisseld tussen vloeibare stikstof en een waterbad van 30 graden Celsius. Bereid daarna een lipidextruder voor door twee filtersteunen te bevochtigen in Heiss-buffer.

Plaats ze vervolgens elk op een bevochtigd Teflon-extrusieonderdeel en plaats een nucleopore track-etched membraan met poriën van 0,1 micron tussen de twee Teflon-extrusieonderdelen. Plaats de extrusieonderdelen nu in een metalen extrusiecanister en plaats een donutvormige spacer over de twee extrusieonderdelen. Draai de metalen bovenkant van de extrusiecanister vast en plaats deze vervolgens in de houder met behulp van een glazen spuit van 250 microliter.

Vul de holte van de extruder met 500 µL van een 10 mM HEPES-buffer om elk verlies van het vesikelmonster te voorkomen. Breng het monster over naar een bekerglas van 10 mL.

Laad vervolgens elke MLV-monster in de extruder en pers het monster minstens 21 keer door het membraan. Om een uniforme grootte van de Ella-vesikels na extrusie te garanderen, worden de grote ELLA-lipidvesikels of L UUV's overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Bewaar de UUV's bij vier graden Celsius en gebruik ze binnen 48 uur.

Om de LUV-concentratie te bepalen, wordt het totale fosforgehalte in de monster bepaald. Het volgende dient te worden klaargemaakt volgens de specificaties in het bijbehorende schriftelijke protocol: 8,9 normaal H₂SO₄, 2,5% w/v ammoniummolybdaat, 10% w/v ascorbinezuur en 0,65 millimolaire fosfaatbuffersolutie.

Bereid zes fosforstandaarden voor zoals hier getoond. Bereid vervolgens een LUV-blank voor met hetzelfde volume 0,2 millimolaire trypsine en 2,0 millimolaire Bowman BIR-remmingsoplossing als gebruikt voor de controles. Dit wordt gedaan om te corrigeren voor eventuele gedroogde fosforzouten in het Bowman B-remmingspoeder.

Pipette vervolgens ongeveer 0,1 micromol, gewoonlijk circa 25 µL UUV's, in drievoud in wegwerpglazen kweekbuisjes. Voeg daarna 450 µL 8,9 N H₂SO₄ toe aan elk van de monster-, standaard- en blanco-buisjes. Plaats vervolgens de monsters, standaarden en blanco's gedurende 25 minuten in een oven op 175 tot 210 °C.

Na 25 minuten alle buisjes uit de oven halen en laten afkoelen. Voeg 150 µL 30% H2O toe aan elk van de buisjes. Verwarm vervolgens de monsters, standaarden en blanco's nogmaals 30 minuten bij 175 tot 210 °C.

Verwijder na 30 minuten de monsterstandaarden en blanco's van de warmtebron. Als enkele van de oplossingen nog niet kleurloos zijn, voeg dan 50 µL H2O toe aan alle buisjes en verhit deze nogmaals 15 minuten bij 175 tot 210 °C. Zodra de oplossingen kleurloos zijn, voeg dan 3,9 mL nanopuur H2O, 0,5 mL ammoniummolybdaatoplossing en 0,5 mL ascorbinezuuroplossing toe aan elk buisje.

Verwarm vervolgens alle buisjes gedurende vijf tot zeven minuten. Meet in een kokend waterbad de absorbentie van elke standaard en elk monster bij 820 nanometer met een Agilent 8 4 5 3 UV-vis spectrophotometer. Experimentele en controle LUV-concentraties moeten afzonderlijk worden gemeten.

De buis die 0,0 millimol fosfor bevat, moet worden gebruikt als blanco voor alle standaarden en experimentele LUV-monsters. De buis die 0,2 millimolaire trypsine en een 2,0 millimolaire bone and bir-inhibitoroplossing bevat, moet worden gebruikt als blanco voor het controle-LUV-monster. De resulterende lineaire standaardcurve van absorbentie versus fosforgehalte moet worden gebruikt om het totale fosforgehalte en de LUV-concentratie van de monsters te berekenen.

Om de peptidoploplossingen voor te bereiden, lost u het peptide op in Oppu H2O; peptiden die in deze assay worden gebruikt, moeten één tryptofaanresidu bevatten. Meet de absorptie van de peptide-oplossing bij 282 nanometers in triplo. Bereken de peptideconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt voor tryptofaan van 5, 700.

Verdun het peptide in Nano Pure water tot een uiteindelijke concentratie van 30 µM; bewaar bij -20 °C. Bereid voor de kwantificering van de translocatie experimentele monsters en controlemonsters voor in 1,7 ml microcentrifugebuisjes. Voeg aan elke oplossing voldoende UUV's toe voor een uiteindelijke concentratie van 250 µM.

Voeg voldoende Bowman BIR-inhibitoroplossing toe zodat de uiteindelijke concentratie van de inhibitor 10 x hoger is dan de trypsineconcentratie. Voeg voldoende 10 millimolaire HEIS-buffer toe om het uiteindelijke volume van de oplossing op 450 µL te brengen. Plaats 50 µL van de peptidesolutie in een stana micro chords fluorimetrie-cuvet en plaats deze in het spectrophotometerprogramma.

Een fluorescentie-spectrofotometer om een 25 minuten durend fluorescentie-kinetiekexperiment uit te voeren, waarbij minimaal één keer per seconde een fluorescentiemeting wordt geregistreerd met een excitatiegolflengte van 280 nanometer en een emissiegolflengte van 525 nanometer bij 25 °C. Stel de PMT-gevoeligheid in op hoog en voeg het experimentele monster of de controle aan de peptideoplossing in de qve toe. Dit moet de uiteindelijke peptideconcentratie op 3 µM brengen; begin onmiddellijk met het fluorescentie-kinetiekexperiment.

Zodra zowel de experimentele als de controlemonsters zijn uitgevoerd, worden de translocatieratio's berekend zoals beschreven in het bijbehorende document. De ratio tussen en peptide is hoog genoeg om te garanderen dat vrijwel alle intacte peptiden dicht genoeg bij een dansel-groep komen om een fret-signaal te geven, zelfs als er geen van hen naar het blaasje is getransloceerd. Dit is consistent met de vergelijkbare fret die in controlecondities werd waargenomen voor peptiden die wel en niet naar blaasjes transloceren.

Translocatie-assays werden uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Deze figuur toont de resultaten van een representatief peptide dat een robuuste translocatie vertoonde. Het signaal in dit experiment, weergegeven door de zwarte lijn, vertoont een duidelijke daling in het FRET-signaal.

Na verloop van tijd zijn hogere translocatieratio's indicatief voor peptiden die efficiënt transloceren. De translocatieratio voor de hier getoonde celpenetrerende peptiden is 1,19; wekelijks vertonen peptiden translocatieratio's die dichter bij één liggen om te controleren voor het potentiële verlies van het FRET-signaal als gevolg van incomplete tripsen en inhibitie of andere factoren die niet gerelateerd zijn aan het translocatievermogen. Het FRET-signaal tussen het peptide en UUV's die zowel trypsine als de Bowman BRK trypsineremmer bevatten, wordt gemeten.

Dit wordt weergegeven als de grijze curve. Het belang van het controle-experiment met UUV's die trypsineremmer bevatten, wordt benadrukt door de hier getoonde gegevens. In dit geval nam het peptidesignaal in een vergelijkbare mate af als in de vorige figuur bij het experimentele monster, dat wordt weergegeven door de zwarte curve.

De controlemonster vertoont echter een snellere afname voor dit peptide, waardoor de netto translocatie lager is. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u lipide vesikels maakt en hoe u de translocatie van tryptofaanbevattende peptiden meet. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u onmiddellijk na het mengen van het peptide en de vesikels moet beginnen met het verzamelen van gegevens.