Name: Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer hoe je genexpressie in Ramos B-cellen wijzigt via virale infectie om somatische hypermutatie te meten. Deze methode helpt nieuwe factoren in antilichaamdiversificatie te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De pMSCV-AID-I-Thy1.1 en pKat2 vectoren werden een soort geschenk van DG Schatz en de pVSV-G, pRSV-Rev, en pMDLg / pRRE vectoren werden een soort geschenk van BR Cullen.

1. Voorbereiding van de monsters en cellen <ol><li> Voer een middelgrote schaal bereiding van DNA (midiprep) van de overexpressie of shRNA-bevattende constructen en de retrovirale vector verpakking pKat2 of de lentivirale vectoren verpakking pVSV-G, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev 25. Gebruik 6 pg DNA per bouwen en een 4 ug van pKat2 (voor retrovirale infecties) of 1,5 ug DNA voor elk van de pVSV-g, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev verpakking vectoren (voor lentivirale infecties). </li><li> Bereid BOSC 23 media. Voor transfectie, gebruik maken van zowel ongewijzigde Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en als complete DMEM. Om compleet te maken DMEM, voeg 1% HEPES buffer, 1% penicilline-streptomycine-glutamine (PGS), en 10% pasgeboren kalf serum (NCS) om een ​​fles DMEM. </li><li> Bereid Ramos media. Voor de infectie stap maken compleet RPMI-1640 medium (RPMI) door toevoeging van 1% HEPES, 1% PGS, en 10% foetaal bovine serum (FBS) om een ​​fles RPMI. Voor single cell seeding stap, make &quot;geconditioneerde&quot; media door groeiende Ramos cellen in volledige RPMI voor 2 dagen, te stoppen met draaien de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten en het filteren van de supernatant met een 0,2 um filter in een steriele fles. Net als andere volledige media, is geconditioneerd media die zijn opgeslagen bij 4 ° C totdat het nodig is. </li><li> Split 3 x 10 6 BOSC 23 cellen in een 100-mm plaat in 10 ml DMEM compleet op de dag voor de transfectie, zodat de cellen zullen worden op 50-60% confluentie de dag van de transfectie. Maak een plaat van cellen voor elke vector u van plan bent transfecteren. Het is belangrijk dat de cellen niet zijn in cultuur gehouden te lang; gebruik een lage passage aantal cellen of onlangs ontdooid cellen voor zowel de transfectie en infectie stappen om een ​​goede infectie te verzekeren. </li><li> Onder andere controles voor uw experimenten. Voor transfecties en infecties, een negatieve controle (ongetransfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen) en een positieve controle (virus dat GFP en puromycine-resistentiegen uitdrukt). Voor shRNA knock-down expertiseiments, infecteren van een goed met een roerei of irrelevant shRNA controle. </li></ol> 2. Transfecteren BOSC 23 cellen <ol><li> Warm de flessen van de ongewijzigde DMEM en volledige DMEM bij 37 ° C. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de BOSC 23 cellen en te vervangen door 5 ml DMEM compleet. Breng de cellen om een ​​37 ° C incubator tot gebruik in stap 2.6. </li><li> Warm het flesje van Fugene 6 bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten vervolgens kort vortex (&lt;1 seconde). </li><li> Aliquot 600 pi ongewijzigde DMEM in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Verdun 30 pi Fugene 6 in de 600 uL ongewijzigde DMEM, vortex kort (&lt;1 seconde), en vervolgens incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Wees voorzichtig om direct pipet in de media. Laat niet de Fugene 6 raak de zijkanten van de buis. </li><li> Voeg 6 ug bouwen en ofwel 4 microgram pKat2 (retrovirale infecties) of 1,5 microgram elk van pVSV-G, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev (lentivirale infecties) aan de DMEM / Fugene 6 mix, vortex bri<html> efly (&lt;1 seconde), en vervolgens incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. </li><li> Voeg de DNA / DMEM / Fugene 6 mix om de BOSC 23 cellen en terug te keren naar een 37 ° C incubator voor 24 uur. </li><li> Na 24 uur, voeg 5 ml DMEM compleet aan de getransfecteerde cellen en terug te keren naar een 37 ° C incubator voor een ander 24 uur. </li></ol> 3. Oogsten virale deeltjes <ol><li> Oogst de 10 mL van de media van de getransfecteerde BOSC 23 cellen met een 10 ml spuit. </li><li> Bevestig een 0,45 pm filter aan het einde van de spuit en het filter van de media in een schone 15 ml polypropyleen buis. </li><li> Direct gebruik van de virale media of bevriezen als een mL monsters in 2 ml cryogene flesjes bij -80 ° C. </li><li> Na het oogsten van de virale media, bevestigen dat een efficiënte transfectie heeft plaatsgevonden in de positieve controle cellen door FACS. Dit kan ook gedaan worden voor alle monsters als het construct bevat ofwel een fluorescerend (bijv. GFP) of een celoppervlak marker (bijv. Thy1). </li></ol>TITEL &quot;&gt; 4. Infecting B-cellen <ol><li> Zaad 2 mL van 2 x 10 5 cellen / ml Ramos cellen in volledige RPMI in een 6-wells plaat 24 uur voor infectie. Nogmaals, moet u een lage doorgang aantal cellen of recent ontdooid cellen gebruiken om een ​​goede infectie te verzekeren. </li><li> Bij gebruik van bevroren monsters van het virus, snel ontdooien de virale media bij 37 ° C. </li><li> Meng 1 ml virale media met 3 pl van 10 mg / ml polybreen. De uiteindelijke concentratie van polybreen moet 10 pg / ml in een totaal volume van 3 ml. </li><li> Voeg de virus / polybreen mix naar de cellen en meng goed door pipetteren. Zoals eerder vermeld, een goed gebruikt moet worden als een niet-geïnfecteerde controle; voeg 1 mL compleet RPMI en 3 ui polybreen om dit goed in plaats van 1 ml virus. Zorg ervoor dat u goed infecteren een met een passende negatieve controle. We hebben ook goed infecteren een met een GFP-bevattende vector, om infectie-efficiëntie te bepalen door FACS. </li><li> Centrifugeer de 6-well plaat bij 3000 xg gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zet de plaateen 37 ° C incubator gedurende 48 uur. </li><li> Na 48 uur, spin down van de geïnfecteerde cellen in een 15 ml polypropyleen buis bij 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de media door aspiratie, waarbij u niet te storen de cel pellet. Resuspendeer de cellen in verse RPMI. </li><li> Bevestigen de efficiëntie van infectie in de positieve controle monster door FACS. Net als voorheen, kunt u dit doen voor al uw monsters als het construct bevat ofwel een fluorescerend (bijv. GFP) of een celoppervlak marker (bijv. Thy1). </li><li> Start selectie van cellen (indien van toepassing). Onze shRNA-bevattende constructen bevatten allemaal een puromycine weerstand cassette. Wij selecteren shRNA-geïnfecteerde Ramos cellen met 0,25 ug / ml puromycine. Wij vinden dat derivaten van Ramos cellen soms tonen gevoeligheid veranderd om puromycine en daarom voeren we doden bochten om de concentratie van puromycine te optimaliseren voor elke afgeleide. Ook de behandeling van niet-geïnfecteerde controle cellen met puromycine om te bevestigen dat selectie effectief is. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Enkele cel zaaien Single zaaien kan worden uitgevoerd in een van de twee manieren: door FACS-sortering of handmatig. <ol><li> FACS: Gebruik een FACS sorter met een plaat adapter om zaad een cel / well in een 96-wells plaat voorgevuld met 100 pl van 40% RPMI/40% onder de voorwaarde media/20% FBS. Deze methode geeft een veel meer enkele cel klonen per plaat. </li><li> Handmatig: Tel de cellen. Verdun een hoeveelheid van cellen tot 10 cellen / ml in 40% RPMI/40% onder de voorwaarde media/20% FBS. Gebruik 10 ml verdund cellen voor elk gezaaid plaat. Verschillende klonen zal variabel herstel in dit stadium daarom is het nuttig om verschillende platen met verschillende concentraties (van 3 tot 20 cellen / ml). Gebruik maken van de een dat minder uitwassen te klonen die voortvloeien uit meerdere cellen te voorkomen) produceert. Gebruik een multichannel pipet om zaad 96-wells platen met 100 pi van de verdunde cellen. </li><li> Plaats de plaat in een 37 ° C incubator voor 2 weken. </li><li> Controleer de individuele putten under de microscoop op de aanwezigheid van cellen die een dag na het uitzaaien te bevestigen. Enkele cellen kunnen worden lastig te vinden door de noodzaak om zich te concentreren op de juiste diepte. Focussen op de goed cijfers afgedrukt aan de onderkant van de 96-wells plaat zou moeten helpen. Cellen zijn gemakkelijker te vinden wanneer gezaaid door de FACS sorter omdat de meeste putten hebben een cel. </li><li> Na 2 weken, kan groeiende kolonies nauwelijks te zien met het blote oog door te kijken naar de platen van onderen. Ze zijn veel gemakkelijker te zien onder de microscoop. Kolonies hebben de neiging om te groeien langs de randen van de put en typisch meeste kolonies in een plaat groeien langs dezelfde rand in verschillende putten. Mark Wells robuuste cel-groei en overdracht van de cellen naar 24-well platen in 1 ml RPMI en terug te keren naar een 37 ° C incubator. </li><li> Instandhouding van de lichaamscellen op een x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen / ml. Wijzig de media door het draaien van de cellen op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en het verwijderen van de media als dat nodig is. Te vervangen door 1 ml verse RPMI. </li><li> Na een aantal dAys van groei, overdracht van de cellen om een ​​6-well plaat en blijven groeien in een 37 ° C incubator. </li><li> Na 3 weken, het analyseren van de klonen voor IgM verlies (zoals hieronder beschreven). </li><li> Blijven de cellen groeien voor 2 weken meer en dan weer het analyseren van de klonen op het 5 week tijd punt. </li></ol> 6. Analyse: IgM verlies (3 weken en 5 weken) <ol><li> Aliquot 5 x 10 5 cellen uit elk putje in een 1,5 ml microcentrifugebuis en spin de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik cellen van elk van de controle en shRNA-knock-down putten, maar ook als een monster voor een onbevlekte controle. </li><li> Was de cellen in 1 ml PBS en dan weer draaien op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer in 50 ul van PBS (ongekleurde controle) of PBS + 1:20 verdunning van PE-gelabeld α-mens IgM antilichaam. Incubeer op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Spin de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cells tweemaal met 1 ml PBS en spin voor 400 X g gedurende 4 minuten per keer bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer in 100 pi PBS. Overdracht van de geresuspendeerde gekleurde cellen om een ​​FACS buis. </li><li> Analyseer de cellen met behulp van een FACS apparaat. </li><li> Vergelijk het percentage van IgM - cellen van de controles versus het shRNA aangereden cellen. Zoals eerder opgemerkt, IgM schade als gemeten door FACS is een betrouwbare semi-kwantitatieve meting van de SHM in Ramos cellen. </li></ol> 7. Analyse: Bevestig knock-down door kwantitatieve RT-PCR (5 weken) <ol><li> Aliquot 3 x 10 6 cellen uit elk putje en neer op 400 X g draaien gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid RNA uit de fractie van de cellen. We maken gebruik van TRIzol volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Bereid cDNA van het RNA prep. We maken gebruik van 2 ug RNA en Superscript II volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Voer een kwantitatieve PCR met behulp van de cDNA om bevestigingm knock-down. We maken gebruik van GAPDH als een normalisering controle, en de SYBR FAST qPCR kit in een 10 pi totale reactie volume. </li></ol> 8. Analyse: Genomic sequencing (5 weken) <ol><li> Aliquot 5 x 10 6 cellen uit elk putje en neer op 400 X g draaien gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Genomisch DNA te isoleren uit deze cellen. We maken gebruik van de Wizard SV genomische DNA-zuivering kit volgens aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> PCR versterken de genomische DNA voor de Ig-V-genen 19 (tabel 1) en alle andere genen van belang het gebruik van de KAPA HiFi DNA-polymerase. We gebruiken deze polymerase vanwege de lage fout-tarieven, maar elke high-fidelity PCR polymerase moet aanvaardbaar zijn. </li><li> Gel te zuiveren van de PCR-producten op een 1% agarosegel met behulp van de QIAquick gel extractie kit. </li><li> Sommige polymerasen voegen een deoxyadenosine (A) residu een einde aan de drie &#39;van de PCR-producten, terwijl anderen dat niet doen. Deze drie &#39;A staarten zijn nodig voor de TOPO TAklonen stap. De KAPA HiFi polymerase laat geen 3 &#39;A staarten. A-staart van de PCR-producten door het incuberen van 25 pi gel-gezuiverd PCR product met 3 pi 10x Taq reactie buffer, 1 ui 10 mM dNTPs, en een eenheid Taq-polymerase bij 72 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Kloon van de gel-gezuiverde PCR-producten met behulp van de TOPO TA Cloning kit. Transformeren van de producten uit de TOPO reactie in de bijgeleverde E. coli DH5a-T1 R competente cellen en plaat op LB / agarplaten die 100 ug / ml ampicilline en aangevuld met 1,6 mg van de X-gal volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Stuur individuele kolonies voor het rangschikken. </li><li> Sequentie-analyse uit te voeren om soorten en locaties van mutaties vast te stellen. </li></ol> 9. Representatieve resultaten: Zoals eerder opgemerkt, gebruiken we een positieve controle virale vector die zowel GFP als een puromycine-resistentiegen uitdrukt. We meestal zien 50-75% GFP +-cellen twee dagenna transfectie. In onze infecties, we meestal zien 50-70% cellen GFP + twee dagen na de infectie, maar voor de selectie. Na selectie is voltooid,&gt; 95% van de cellen GFP +. Als vertegenwoordiger experimenten, laten we de effecten van overexpressie AID of neerhalen een reparatie factor in Ramos cellen. Concreet hebben we getransfecteerd een retrovirale overexpressie vector voor AID verbonden via een IRES site Thy1.1, samen met de retrovirale vector verpakking pKat2 in BOSC 23 cellen. Virus-bevattende media werd gefilterd en vervolgens gebruikt om Ramos cellen te infecteren. Zowel wild type (WT) en de AID tot overexpressie (AID hi) cellen werden enkele cel gezaaid en gekweekt gedurende 3 weken, waarna ze werden geanalyseerd op genexpressie door qRT-PCR (figuur 2) en voor IgM verlies door FACS (Figuur 3 ). Voor de FACS kleuring, werden de cellen geïncubeerd met beide 1:20 verdunde PE-gelabeld α-mens IgM antilichaam en 1:400 verdund FITC-gelabelde α-rat CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) antilichaam. In een afzonderlijk experiment werden lentivirussen bevat ofwel een irrelevante shRNA (controle) of een shRNA tegen een high-fidelity DNA-herstel factor zal naar verwachting te beschermen tegen SHM in BOSC 23 cellen, en vervolgens geïnfecteerd in een AID hi kloon van Ramos cellen. Opnieuw werden genexpressie (figuur 4) en IgM verlies (Figuur 5) geanalyseerd in een cel klonen na 3 weken. Sinds de reparatie factor wordt verondersteld om bescherming tegen mutaties gedurende SHM te bieden, dan zien we een toename van de IgM verlies en SHM bij afwezigheid van de factor. Als we knocked-down een factor betrokken is bij het genereren van SHM-geassocieerde mutaties, zouden we hebben gezien een daling van de IgM verlies plaats. Zoals verwacht, onze qRT-PCR resultaten tonen een duidelijke toename van de AID expressie na infectie van cellen met een AID overexpressie vector (figuur 2), terwijl het niveau van het DNA-herstel factor daling van de aanwezigheid van een gerichte shRNA tegen dat factor (figuur 4 ). Omdat individuele clones kunnen variëren, kun je zien wat variatie in genexpressie niveaus. Omdat de genexpressie kan variëren, is het noodzakelijk om bevestiging van de uitdrukking in elke kloon u van plan bent op het analyseren verder. Verschillende shRNAs tegen hetzelfde gen zou kunnen hebben verschillende effecten op genexpressie zo goed, dus je moet een aantal shRNAs het scherm om te bepalen welke heeft de grootste impact. Knockdown kunnen ook worden bevestigd op het eiwit niveau door immunoblotting. Ook kunnen afzonderlijke klonen sterk verschillen in niveaus van IgM verlies. Sommige klonen zou kunnen aantonen dat er een &quot;jackpot&quot;-effect, waarbij een IgM mutatie opgetreden in een van de eerste celdelingen - bijvoorbeeld, zul je&gt; 50% IgM verlies zien alleen maar omdat een van de cellen werden IgM - op de twee-cellig stadium. De invloed van deze klonen wordt geminimaliseerd door het berekenen van de mediaan voor een aantal enkele cel klonen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voor het transontsmetting, infectie en de analyse van IgM verlies. Zie tekst voor details. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" /> Figuur 2. AID overexpressie in Ramos cellen. WT en de AID hi Ramos cellen werden enkele cel gekloond en gegroeid gedurende 3 weken, op welk moment AID uiting in de individuele klonen werd gemeten door qRT-PCR. GAPDH uitdrukking werd gebruikt voor normalisatie. WT was ingesteld op 1. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van &lt;0,01, berekend als een eenzijdige Student&#39;s t-test. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" /> Figuur 3. Verhoogde IgM verlies in AID hi-cellen in vergelijking met WT-cellen. Oppervlak IgM werd gemeten door FACS op het 3 week tijdstip, en het percentage van de IgM verlies werd berekend voor WT en AID hi-cellen. (A) Vertegenwoordiger FACS plot van een WT kloon en een AID hi kloon. De AID overexpressie vEctor heeft AID gekoppeld aan Thy1.1 via een IRES site, dus Thy1.1 uitdrukking wordt gebruikt als een surrogaat voor de AID expressie. (B) Kwantificering van IgM verlies in diverse WT en de AID hi klonen. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van &lt;0,01, berekend als een eenzijdige Student&#39;s t-test. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" /> Figuur 4. Knockdown van een reparatie factor in AID hi cellen. De cellen werden geïnfecteerd met ofwel een irrelevante shRNA controle (controle) of onze shRNA van belang (shRNA), en enkele cel gezaaid. Na 3 weken was genexpressie in individuele klonen gemeten door qRT-PCR. GAPDH uitdrukking werd gebruikt voor normalisatie. WT was ingesteld op 1. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van &lt;0,01, berekend als een eenzijdige Student&#39;s t-test. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" /> Figuur 5. Verhoogd IgM verliesAID in hi cellen met knocked-down niveau van een reparatie factor. Oppervlak IgM in verschillende klonen werd gemeten door FACS op het 3 week tijdstip, en het percentage van de IgM verlies werd berekend in de cellen nog steeds tot overexpressie AID. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van &lt;0,01, berekend als een eenzijdige Student&#39;s t-test. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tabel 1" /> . Tabel 1 Primer sequenties voor de Ig-genen 19: de constante regio Cμ, de zware keten V regio (V H), en de lichte keten V regio (V L).

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Zoals eerder besproken, hebben cellijn modellen voor antilichaam diversificatie uitgegroeid tot een populaire uitvalsbasis om nieuwe eiwitten die verschillende stappen invloed tijdens antilichaam diversificatie te identificeren. We presenteren hier een methode voor het gebruik van virale infectie van beide knock-down of overexpressie eiwitten in de Ramos B-cellijn en vervolgens onderzoekt de impact op de SHM. Voor deze studies maken we gebruik van zowel WT Ramos en AID hi Ramos ce...

Aanbevolen reagentia - de meeste van deze kan worden vervangen door soortgelijke producten van andere leveranciers. <table border="1" ><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th > Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td > 6-well duidelijke TC-behandelde platen </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-well duidelijke TC-behandelde platen </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96-well duidelijke vlakke bodem polystyreen TC-behandeld microplaten </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-behandeld kweekschalen </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc spuit filters, 0,45 pm </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar-agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilline </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml in water </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > of soortgelijke </td></tr><tr><td> BD Falcon ronde bodem polystyreen buizen </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > voor FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 cellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 incubator die in staat van 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (foetaal runderserum) </td><td > Gemini Bio-producten </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antilichaam </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > Fugene 6 transfectiereagens </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES bufferoplossing </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi DNA-polymerase </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB bouillon (lysogeny bouillon - Luria) Poeder </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSIE TRC shRNA bacteriële glycerol voorraad </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA vectoren </td></tr><tr><td > NCS (pasgeboren kalf serum) </td><td > Gemini Bio-producten </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (fosfaat gebufferde oplossing) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > verdund tot 1x in het water </td></tr><tr><td > PE α-humaan IgM antilichaam </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilline-streptomycine-glutamine oplossing) </td><td > Gemini Bio-Producten </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybreen (hexadimethrine bromide) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / ml in water </td></tr><tr><td > PureYield Plasmide Midiprep System </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 pg / ml in water </td></tr><tr><td > QIAquick gelextractiekit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) cellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 medium </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA-polymerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning Kit </td><td > Vitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Wizard SV Genomic DNA-zuiveringssysteem </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-broom-4-chloor-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml in DMSO </td></tr></tbody></table>

het beoordelen van somatische hypermutatie in ramos b-cellen na overexpressie of knockdown van specifieke genen

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

B-cellen beginnen hun leven met een lage affiniteit antilichamen gegenereerd door V (D) J recombinatie. Echter, bij het ​​opsporen van een ziekteverwekker, is de variabele (V) regio van een immunoglobuline (Ig) gen ongeveer 100.000 keer meer dan de rest van het genoom door middel van somatische hypermutatie (SHM) gemuteerd, wat resulteert in een hoge affiniteit antilichamen 1,2. Daarnaast, klasse switch recombinatie (CSR) produceert antilichamen met verschillende effector functies, afhankelijk van de aard van de immuunrespons die nodig is voor een bepaalde ziekteverwekker. CSR en SHM worden geïnitieerd door de activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID), die cytosine residuen in DNA te produceren uracils deaminates. Deze uracils worden verwerkt door foutgevoelige vormen van reparatie wegen, uiteindelijk leidend tot mutaties en recombinatie 1-3. Onze huidige kennis van de moleculaire details van de SHM en MVO komen uit een combinatie van studies in muizen, primaire cellen, cellijnen, en cel-free experimenten. Muismodellen blijft de gouden standaard met genetische knockouts tonen cruciale rol voor vele reparatie factoren (bijvoorbeeld Ung, MSH2, MSH6, Exo1, en ​​polymerase η) 4-10. Echter, niet alle genen zijn vatbaar voor de knock-out studies. Bijvoorbeeld, knockouts van verschillende double-strand break repair eiwitten embryonaal dodelijk of aantasting B-cel ontwikkeling 11-14. Bovendien, soms de specifieke functie van een eiwit in SHM of MVO kan worden gemaskeerd door de meer globale defecten veroorzaakt door de knock-out. Daarnaast kan worden omdat experimenten in muizen langdurig, veranderen van de expressie van individuele genen in cellijnen is uitgegroeid tot een steeds populairder eerste stap naar het identificeren en karakteriseren kandidaat-genen 15-18. Ramos - een Burkitt lymfoom cellijn die constitutief ondergaat SHM - is een populaire cellijn model om SHM 18-24 te bestuderen. Een voordeel van Ramos cellen is dat ze een ingebouwde handige semi hebben-Kwantitatieve meting van SHM. Wild-type cellen brengen IgM en, als ze pick-up mutaties, een aantal van de mutaties knock-out IgM expressie. Daarom is het testen van IgM verlies door fluorescentie-geactiveerde cel scanning (FACS) biedt een snelle uitlezing voor het niveau van de SHM. Een meer kwantitatieve meting van de SHM kan worden verkregen door direct sequencing het antilichaam genen. Omdat Ramos-cellen zijn moeilijk te transfecteren, produceren we stabiele derivaten die zijn verhoogd of verlaagd expressie van een individueel gen door het infecteren van cellen met retrovirale of lentivirale constructen die ofwel een overexpressie cassette of een short hairpin RNA (shRNA), respectievelijk bevatten. Hier beschrijven we hoe we dan Ramos cellen te infecteren en het gebruik van deze cellen om de rol van specifieke genen op de SHM (figuur 1) te onderzoeken.

We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te voeren

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

B-cellen beginnen hun leven met antilichamen met een lage affiniteit, die tot stand komen door V(D)J-recombinatie. Wanneer ze echter een pathogeen detecteren, ondergaat de variabele (V)-regio van een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van een gen te wijzigen en vervolgens de impact hiervan op somatische hypermutatie te meten. Dit wordt bereikt door Bosque 23-cellen te transfecteren om virusdeeltjes te produceren die een construct bevatten voor respectievelijk overexpressie of SHRA. In een tweede stap worden ramo-cellen geïnfecteerd met de virussen, wat resulteert in knockdown of overexpressie van het gen van belang.Vervolgens worden de enkelcelklonen enkele weken lang gekweekt om de cellen de kans te geven mutaties te accumuleren. Ten slotte kan het effect van de veranderde genexpressie worden bepaald op basis van de analyse van IgM-verlies en door sequencing van de IG-genen. Deze methode kan helpen bij het identificeren van nieuwe factoren die betrokken zijn bij de diversificatie van antilichamen.Begin door 600 µL warme DMEM in een 1,5 mL microcentrifugebuis te pipetteren. Pipetteer vervolgens voorzichtig 30 µL FUgene 6 direct in het medium, vortex de oplossing minder dan een seconde en incubeer de buis vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, voor een lentivirale infectie zoals in dit geval, 6 µg shRNA-construct en telkens 1,5 µg pVSVG-pMDLgPRRE en pRSV-rev toe aan het DMEM-FUgene 6-mengsel.Vortex de oplossing kort en incubeer de twee componenten vervolgens opnieuw bij kamertemperatuur, ditmaal gedurende 25 minuten. Transfect tot slot een Bosque 23 celcultuur met een confluentie van 50 tot 60% met het D-N-A-D-M-E-M FU gen zes. Meng en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.Voeg de volgende dag vijf milliliter DMEM toe aan de cellen en plaats deze opnieuw 24 uur in de incubator. Oogst op de derde dag na transfectie 10 milliliter medium van de getransfecteerde box 23-cellen met een spuit van 10 milliliter, en bevestig vervolgens een filter van 0,45 micrometer aan het uiteinde van de spuit. Verzamel het gefilterde medium in een schone polypropyleen buis van 15 milliliter. Zaai 24 uur voor infectie twee milliliter van twee keer 10^5 cellen per milliliter RAMO-cellen in volledig RPMI in een six-well plaat. Voeg de volgende dag drie microliter van een polybrene-oplossing van 10 microgram per milliliter en één milliliter virus toe aan de RAMO-cellen, en meng de celsuspensie goed door te pipetteren.Voeg voor de niet-geïnfecteerde controle één milliliter compleet RPMI en drie microliters poly brain toe aan een van de putjes in plaats van het virus. Infecteer daarnaast één putje met een passende negatieve controle en een ander putje met een GFP-bevattende vector om de infectie-efficiëntie via fax te bepalen. Centrifugeer de zes-puts plaat vervolgens 90 minuten bij 3000 GS op kamertemperatuur en plaats de plaat daarna gedurende 48 uur terug in de incubator.Centrifuge ten slotte de geïnfecteerde cellen in een polypropyleen buis van 15 milliliter bij 400 Gs gedurende vier minuten. Aspireer vervolgens bij kamertemperatuur het medium, waarbij u ervoor zorgt dat het celpalet niet wordt verstoord, en resuspendeer de cellen in vers RPMI. Na het tellen van de cellen wordt een aliquoot van de geïnfecteerde RAMO-cellen verdund tot 10 cellen per milliliter.In een oplossing van RPMI geconditioneerd medium en FBS tot een eindvolume van 10 milliliters per gezaaide plaat. Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om de 96-wells platen te zaaien met 100 microliters van de verdunde cellen per well.Na het incuberen van de platen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide, wordt elke individuele put met een microscoop gecontroleerd. Dit dient om de aanwezigheid van cellen te bevestigen, aangezien de juiste diepte voor het identificeren van enkelvoudige cellen lastig te bepalen kan zijn. Probeer eerst scherp te stellen op de putnummers die op de bodem van de 96-wells plaat zijn gedrukt.Probeer vervolgens na twee weken naar cellen te zoeken. Controleer met een watervaste stift op de aanwezigheid van celkolonies langs de randen van de wells. Markeer de wells met een sterke celgroei en transfer de kolonies vervolgens naar 24-wells platen in één milliliter RPMI voor verdere incubatie.Na enkele dagen groei worden de cellen overgebracht naar een six-wellplaat en worden de culturen verder geïncubeerd. Drie weken na het uitplaten van de celkolonies in de six-wellplaat worden 5 × 10⁵ cellen uit elke well overgebracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuisje. Oogst op dit moment ook de cellen uit elke control-well en hRNA-knockdownwell, evenals één monster voor een ongekleurde controle.Centrifuge nu alle cellen 4 minuten bij 400 Gs bij kamertemperatuur, waarbij de cellen bij de tweede centrifugatie twee keer worden gewassen met één milliliter PBS. Na de tweede wasbeurt suspenderen we het ongekleurde controlepellet in 50 microliters PBS en de overige pellets in PBS plus een 1:20 verdunning van PE-gelabelde anti-humane IGM-antilichamen. Incubeer vervolgens alle celmonsters gedurende één uur op ijs. Was de cellen daarna nog twee keer met PBS zoals eerder beschreven, verwijder het supernatant en resuspendeer alle pellets in 100 microliters PBS.Breng vervolgens de geresuspendeerde gekleurde en ongekleurde controlecellen over naar fax-buisjes en analyseer de cellen vervolgens via flowcytometrie. Vergelijk het percentage IgM-negatieve cellen van de controles met die van de S-H-R-N-A knockdown-cellen. Een retroviraal overexpressievector voor een ID werd getransfecteerd in bosque 23-cellen.De virussen werden vervolgens geoogst en gebruikt om Ramos-cellen te infecteren, zowel wild-type (wt) als cellen die AID overexpresseren (AID.High). De cellen werden als enkelvoudige cellen uitgezaaid en gedurende drie weken gekweekt, waarna ze werden geanalyseerd op genexpressie via qPCR. Zoals verwacht tonen de qPCR-resultaten een duidelijke toename van de AID-expressie na infectie van de cellen met een AID-overexpressievector. Het verlies van IgM in de geïnfecteerde cellen werd eveneens geëvalueerd via FACS. Oppervlakte-IgM werd gemeten via FACS, zoals in de vorige figuur, op het tijdstip van drie weken, waarna het percentage IgM-verlies werd berekend voor wild-type en AID.High-cellen en hier grafisch werd weergegeven. Zoals verwacht vertoonden de AID-overexpressieve cellen een groter verlies van oppervlakte-IgM.In een apart experiment werden in bosque 23-cellen lentivirussen geproduceerd die ofwel een irrelevant S-H-R-N-A als controle bevatten, ofwel een S-H-R-N-A tegen een high-fidelity DNA-reparatiefactor waarvan werd verwacht dat deze bescherming biedt tegen SHM. De lentivirussen werden vervolgens geïnfecteerd in een ID-high kloon van Ramos-cellen. Opnieuw werd de genexpressie geanalyseerd en, zoals verwacht, werd waargenomen dat de niveaus van de DNA-reparatiefactor daalden in de aanwezigheid van een gericht S-H-R-N-A tegen die factor. Tevens werd het IGM-verlies in de enkelcelclonen na drie weken geanalyseerd; aangezien wordt verondersteld dat de reparatiefactor bescherming biedt tegen mutaties tijdens SHM, treedt er in afwezigheid van deze factor een toename op van IGM-verlies en SHM, zoals in deze figuur kan worden waargenomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u virale infecties uitvoert met constructen die OVEREXPRESSIE of S-H-R-N-A bevatten in de ruwe B-cellijn, en hoe u vervolgens somatische hypermutatie in deze cellen meet.

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.

Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Hier wordt een test gepresenteerd om somatische hypermutatie binnen de immunoglobuline zware keten gen locus te kwantificeren met behulp van germinale centrum B cellen van muis Peyer's patches.

Analyse van somatische hypermutatie in de JH4-intron van Germinal Center B-cellen van Mouse Peyer's Patches

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

Leer hoe je genexpressie in Ramos B-cellen wijzigt via virale infectie om somatische hypermutatie te meten. Deze methode helpt nieuwe factoren in antilichaamdiversificatie te identificeren.

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

Meer video's verkennen