Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van een gen te wijzigen en vervolgens de impact hiervan op somatische hypermutatie te meten. Dit wordt bereikt door Bosque 23-cellen te transfecteren om virusdeeltjes te produceren die een construct bevatten voor respectievelijk overexpressie of SHRA. In een tweede stap worden ramo-cellen geïnfecteerd met de virussen, wat resulteert in knockdown of overexpressie van het gen van belang.

Vervolgens worden de enkelcelklonen enkele weken lang gekweekt om de cellen de kans te geven mutaties te accumuleren. Ten slotte kan het effect van de veranderde genexpressie worden bepaald op basis van de analyse van IgM-verlies en door sequencing van de IG-genen. Deze methode kan helpen bij het identificeren van nieuwe factoren die betrokken zijn bij de diversificatie van antilichamen.

Begin door 600 µL warme DMEM in een 1,5 mL microcentrifugebuis te pipetteren. Pipetteer vervolgens voorzichtig 30 µL FUgene 6 direct in het medium, vortex de oplossing minder dan een seconde en incubeer de buis vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, voor een lentivirale infectie zoals in dit geval, 6 µg shRNA-construct en telkens 1,5 µg pVSVG-pMDLgPRRE en pRSV-rev toe aan het DMEM-FUgene 6-mengsel.

Vortex de oplossing kort en incubeer de twee componenten vervolgens opnieuw bij kamertemperatuur, ditmaal gedurende 25 minuten. Transfect tot slot een Bosque 23 celcultuur met een confluentie van 50 tot 60% met het D-N-A-D-M-E-M FU gen zes. Meng en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.

Voeg de volgende dag vijf milliliter DMEM toe aan de cellen en plaats deze opnieuw 24 uur in de incubator. Oogst op de derde dag na transfectie 10 milliliter medium van de getransfecteerde box 23-cellen met een spuit van 10 milliliter, en bevestig vervolgens een filter van 0,45 micrometer aan het uiteinde van de spuit. Verzamel het gefilterde medium in een schone polypropyleen buis van 15 milliliter. Zaai 24 uur voor infectie twee milliliter van twee keer 10^5 cellen per milliliter RAMO-cellen in volledig RPMI in een six-well plaat. Voeg de volgende dag drie microliter van een polybrene-oplossing van 10 microgram per milliliter en één milliliter virus toe aan de RAMO-cellen, en meng de celsuspensie goed door te pipetteren.

Voeg voor de niet-geïnfecteerde controle één milliliter compleet RPMI en drie microliters poly brain toe aan een van de putjes in plaats van het virus. Infecteer daarnaast één putje met een passende negatieve controle en een ander putje met een GFP-bevattende vector om de infectie-efficiëntie via fax te bepalen. Centrifugeer de zes-puts plaat vervolgens 90 minuten bij 3000 GS op kamertemperatuur en plaats de plaat daarna gedurende 48 uur terug in de incubator.

Centrifuge ten slotte de geïnfecteerde cellen in een polypropyleen buis van 15 milliliter bij 400 Gs gedurende vier minuten. Aspireer vervolgens bij kamertemperatuur het medium, waarbij u ervoor zorgt dat het celpalet niet wordt verstoord, en resuspendeer de cellen in vers RPMI. Na het tellen van de cellen wordt een aliquoot van de geïnfecteerde RAMO-cellen verdund tot 10 cellen per milliliter.

In een oplossing van RPMI geconditioneerd medium en FBS tot een eindvolume van 10 milliliters per gezaaide plaat. Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om de 96-wells platen te zaaien met 100 microliters van de verdunde cellen per well.

Na het incuberen van de platen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide, wordt elke individuele put met een microscoop gecontroleerd. Dit dient om de aanwezigheid van cellen te bevestigen, aangezien de juiste diepte voor het identificeren van enkelvoudige cellen lastig te bepalen kan zijn. Probeer eerst scherp te stellen op de putnummers die op de bodem van de 96-wells plaat zijn gedrukt.

Probeer vervolgens na twee weken naar cellen te zoeken. Controleer met een watervaste stift op de aanwezigheid van celkolonies langs de randen van de wells. Markeer de wells met een sterke celgroei en transfer de kolonies vervolgens naar 24-wells platen in één milliliter RPMI voor verdere incubatie.

Na enkele dagen groei worden de cellen overgebracht naar een six-wellplaat en worden de culturen verder geïncubeerd. Drie weken na het uitplaten van de celkolonies in de six-wellplaat worden 5 × 10⁵ cellen uit elke well overgebracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuisje. Oogst op dit moment ook de cellen uit elke control-well en hRNA-knockdownwell, evenals één monster voor een ongekleurde controle.

Centrifuge nu alle cellen 4 minuten bij 400 Gs bij kamertemperatuur, waarbij de cellen bij de tweede centrifugatie twee keer worden gewassen met één milliliter PBS. Na de tweede wasbeurt suspenderen we het ongekleurde controlepellet in 50 microliters PBS en de overige pellets in PBS plus een 1:20 verdunning van PE-gelabelde anti-humane IGM-antilichamen. Incubeer vervolgens alle celmonsters gedurende één uur op ijs. Was de cellen daarna nog twee keer met PBS zoals eerder beschreven, verwijder het supernatant en resuspendeer alle pellets in 100 microliters PBS.

Breng vervolgens de geresuspendeerde gekleurde en ongekleurde controlecellen over naar fax-buisjes en analyseer de cellen vervolgens via flowcytometrie. Vergelijk het percentage IgM-negatieve cellen van de controles met die van de S-H-R-N-A knockdown-cellen. Een retroviraal overexpressievector voor een ID werd getransfecteerd in bosque 23-cellen.

De virussen werden vervolgens geoogst en gebruikt om Ramos-cellen te infecteren, zowel wild-type (wt) als cellen die AID overexpresseren (AID.High). De cellen werden als enkelvoudige cellen uitgezaaid en gedurende drie weken gekweekt, waarna ze werden geanalyseerd op genexpressie via qPCR. Zoals verwacht tonen de qPCR-resultaten een duidelijke toename van de AID-expressie na infectie van de cellen met een AID-overexpressievector. Het verlies van IgM in de geïnfecteerde cellen werd eveneens geëvalueerd via FACS. Oppervlakte-IgM werd gemeten via FACS, zoals in de vorige figuur, op het tijdstip van drie weken, waarna het percentage IgM-verlies werd berekend voor wild-type en AID.High-cellen en hier grafisch werd weergegeven. Zoals verwacht vertoonden de AID-overexpressieve cellen een groter verlies van oppervlakte-IgM.

In een apart experiment werden in bosque 23-cellen lentivirussen geproduceerd die ofwel een irrelevant S-H-R-N-A als controle bevatten, ofwel een S-H-R-N-A tegen een high-fidelity DNA-reparatiefactor waarvan werd verwacht dat deze bescherming biedt tegen SHM. De lentivirussen werden vervolgens geïnfecteerd in een ID-high kloon van Ramos-cellen. Opnieuw werd de genexpressie geanalyseerd en, zoals verwacht, werd waargenomen dat de niveaus van de DNA-reparatiefactor daalden in de aanwezigheid van een gericht S-H-R-N-A tegen die factor. Tevens werd het IGM-verlies in de enkelcelclonen na drie weken geanalyseerd; aangezien wordt verondersteld dat de reparatiefactor bescherming biedt tegen mutaties tijdens SHM, treedt er in afwezigheid van deze factor een toename op van IGM-verlies en SHM, zoals in deze figuur kan worden waargenomen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u virale infecties uitvoert met constructen die OVEREXPRESSIE of S-H-R-N-A bevatten in de ruwe B-cellijn, en hoe u vervolgens somatische hypermutatie in deze cellen meet.