Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van cellen kwantitatief te meten in realtime met behulp van video time lapse-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst een zes-putjes kwekerijplaat te coaten met collageen, en vervolgens de cellen van belang dun te zaaien op de gecoate plaat. Als tweede stap wordt er een wond in de plaat gemaakt met een pipettentip, zodat er voldoende ruimte is voor migratie.

Vervolgens wordt de microscoop ingesteld en worden er regelmatig beelden gemaakt met behulp van een temperatuurregelsysteem om continue monitoring van migreren cellen in realtime mogelijk te maken. Uiteindelijk wordt het deeltjesvolgprotocol gebruikt om verschillen in de gemiddelde snelheid en totale verplaatsing van test- en controlecellen te beoordelen. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de vermijdende kamer migratietest, is dat deze niet is gebaseerd op endpoint kwantitatieve migratiemetingen.

In plaats daarvan maakt het het mogelijk om verschillende parameters continu te monitoren en te berekenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de kankerbiologie, zoals hoe bepaalde genen of geneesmiddelen de migratie van tumorcellen beïnvloeden? Twee dagen voor de procedure voeg je 1,5 milliliter collageen verdund in opti media toe aan elke put van een zes-putjes kwekerijplaat, en incubeer je de plaat vervolgens een nacht bij vier graden Celsius een dag voor de procedure.

Resuspendeer de cellen van belang in twee milliliter DMEM plus FBS per put en breng de cellen over naar elke put van de met collageen ENC gecoate plaat, en incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius. Op de dag van de procedure. Gebruik een pipettentip om een wond te maken in de overnacht gekweekte cellen en spoel elke put met PBS om eventueel afval dat is gevormd als gevolg van de wond te verwijderen.

Voeg DMEM plus FBS toe aan de gespoelde putten en controleer vervolgens onder de microscoop om te bevestigen dat er een schone wondruimte is gecreëerd. Nadat de microscoopcamera en de live-cell imagingapparatuur zijn ingeschakeld, plaats je de plaat boven de microscoopstandaard. Bedek de plaat met de nieuwe levenscellen omgevingscontrolekamer en stel de thermostaat in op 37 graden Celsius en het kooldioxide op 5% Nu open je de slide book software in de menubalk.

Selecteer focus control door op de F binnen een cirkel knop te klikken. Gebruik in het objectiefvak het dropdownvenster om het objectief te definiëren. In het filtersetvak selecteert u instellingen om de lichtbaan naar het I-stuk te leiden. Selecteer de juiste filter voor Bright Field verlichting en klik vervolgens op open Bright.

Om de bright field sluiter te openen. Selecteer nu de bright field filter op de toren en bekijk het monster door het oogstuk om de juiste velden te vinden en om het monster scherp te stellen. Beweeg vervolgens de filtertoren om de lichtbaan naar de camera te veranderen. Voor beeldopname in de slide book software, klik op focus control selecteer XY om verschillende posities door het I-stuk te selecteren en klik vervolgens op set point om elke locatie te vergrendelen.

Voor beeldopname, stel de focus van de camerabeeld die op het scherm wordt bekeken handmatig fijn en gebruik vervolgens de gereedschappen in het focus controlevenster om de Z-positie van het platform aan te passen. Voor de beste resultaten, focus op platte cellulaire uitsteeksels nabij het contact met de plaat om te helpen met het focussen. Gebruik de schuifregelaar om de belichtingstijden aan te passen zodat deze binnen een geschikt bereik voor het focussen vallen.

Als er meerdere XY-posities zijn geselecteerd, pas dan de focus aan voor elke individuele positie door focus control te selecteren. Dan xy, bezoek dan punt. In slide book, selecteer de camera afbeelding van de menubalk, selecteer opname type en klik vervolgens op time lapse om de duur van het experiment te selecteren.

Vanuit het dropdownmenu, typ je de gewenste vertraging tussen het begin van een tijdstip en het begin van de volgende. In de intervalvelden wordt het derde veld automatisch berekend op basis van de handmatig ingevoerde waarden. Onder meerdere XY-opnames, selecteer je multi-point lijst voor experimenten met meer dan één XY-positie.

Ten slotte geef je de bestandsnaam op om het bestand op te slaan, ga je naar capture control en selecteer je advanced en vervolgens spool. Neem vervolgens op naar het geheugen en sla op naar spoolbestand Na elke tijdstip. Begin met klikken op afbeelding.

In de slide book menubalk, selecteer importeer vanuit het dropdownmenu en klik vervolgens op slide book spool. Selecteer de gewenste slide book bestanden die zijn gegenereerd uit het migratie experiment voor verschillende velden en tijdstippen. Open het eerste bestand, selecteer vervolgens masker op de menubalk en kies deeltjesvolgprotocol vanuit het dropdownmenu.

Onder het deeltjesvolgmenu, kies je handmatig deeltjesvolgprotocol. Er verschijnt een venster met start- en eindtijdstippen. Om willekeurige migratie te analyseren, selecteer je masker en vervolgens deeltjesvolgprotocol. Om opnieuw de coördinaten voor het centrum van het object te bepalen, selecteer je centrum van gebied.

Klik vervolgens op volgen en ga door. Kies nu de gewenste statistieken voor elke route zoals verplaatsing en gemiddelde snelheid. Klik hier, zoals getoond, op berekenen om de statistieken te bekijken.

Een voorbeeld van een willekeurige migratieanalyse zoals gekwantificeerd in termen van snelheid wordt getoond in deze box. In de Whiskers grafiek, in dit experiment, was er een toename van de gemiddelde snelheid in M-D-A-M-B 2 31 cellen met een uitgeschakeld tumor suppressor gen. Vergeleken met de controle M-D-A-M-B 2 31 cellen hier, werd de willekeurige migratie van de cellen uit de eerste figuur geanalyseerd in termen van celverplaatsing.

Opnieuw had de totale tumor suppressor gen knockdown groep een verhoogde celverplaatsing vergeleken met de controle M-D-A-M-B 2 31. Cellen in deze time lapse video microscopie film controle MDA MB 2 31 cellen werden overnacht op collageen gezet. De beelden werden vervolgens genomen met tussenpozen van een uur gedurende een totaal van 18 uur tijdens willekeurige migratie.

Let op hoe de cellen in de loop van de tijd van hun o