Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse
22 februari 2012
In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.
Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige reproduceerbare methode te demonstreren voor het verpletteren van de heupzenuw en de volledige montage-analyse van spierreinnervatie na verplettering van de heupzenuw. Dit wordt bereikt door eerst de heupzenuw bloot te leggen, inclusief de juiste plaatsing van chirurgische retractoren om goede toegang tot de zenuw te garanderen. Vervolgens verplettert u de zenuw met hemostatische pincetten en markeert u de zenuw met houtskool.
Verwijder vervolgens de afzonderlijke spieren die door de heupzenuw worden geïnnerveerd van de achterpoot. De laatste stap is om individuele spieren te dissecteren voor volledige montage-analyse na immunokleuring. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat reproduceerbare verplettering van de heupzenuw eenvoudig kan worden uitgevoerd en dat spiermonturen kunnen worden gebruikt om de daaropvolgende regeneratie te analyseren.
Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het een eenvoudige reproduceerbare techniek biedt om de heupzenuw te verpletteren en vervolgens de axonale regeneratie te scoren. Begin deze procedure door de muis voor de operatie te verdoven met een cocktail van 100 milligram per kilogram ketamine en 10 milligram per kilogram xylazine via intraperitoneale injectie om postoperatieve pijn te minimaliseren. De muis krijgt ook een subcutane injectie van 10 milligram per kilogram meloxicam.
Scheer vervolgens voorzichtig beide achterkanten met een chirurgische haartrimmer. Breng dan harsverwijderingsroom aan voor volledige uitputting. Reinig de huid met een steriele katoenen applicator en Betadine chirurgisch scrub.
Breng daarna oogzalf aan op de ogen met een steriele katoenen applicator. Plaats de muis op een schone roestvrij stalen plaat boven een voorverwarmde homeo themische deken en houd de temperatuur van het dier op 37 graden Celsius. Plak vervolgens alle ledematen vast.
Plaats de achterpoot voorzichtig symmetrisch zodat het kniegewricht een rechte hoek maakt met het lichaam. Bedek vervolgens het operatieveld met een steriele doek onder de microscoop. Maak een halfronde insnijding dwars over de middenlijn.
Schei voorzichtig de huid van de onderliggende musculatuur en vouw deze van tijd tot tijd om. Breng ongeveer 0,1 milliliter steriele zoutoplossing aan om de operatieplaats tijdens de procedure vochtig te houden. Open vervolgens het fasciale vlak tussen de gluteus maximus en de voorste kop van de biceps femoris.
Om de heupzenuw voor een chirurgische controle te onthullen. De contralaterale heupzenuw moet worden blootgelegd en gemobiliseerd, maar intact gelaten. Vervolgens herschikt en hecht u de gluteale musculatuur.
Blootstel de experimentele heupzenuw op dezelfde manier met retractoren. Om de visualisatie te vergemakkelijken. Maak voorzichtig de heupzenuw los van het omringende bindweefsel met behulp van een paar iridectomie-schaar.
Gebruik vervolgens de fijne 5 45 pincetten om de zenuw op de onderkaak van de superfijne hemostatische pincetten te plaatsen, lijn de drie fasciae naast elkaar uit, niet op elkaar. De hemostatische pincetten zijn gegraveerd met een markering op 1,5 millimeter van hun punt. Plaats het buitenste gedeelte van de heupzenuw in lijn met deze markering voordat u verplettert.
Dit zorgt voor een verplettering van uniforme breedte en dat de zenuw niet verder reikt dan de kaken van de hemostatische pincetten wanneer deze platgedrukt is door de verpletterende kracht. Als de zenuw verder reikt dan de pincetuiteinden, wordt de zenuw slechts gedeeltelijk verpletterd. Gebruik een tweede paar hemostatische pincetten dat is vooraf gedoopt en met koolstofpoeder is bepoederd om de verpletteringsplaats te markeren.
Verpletter de zenuw op dezelfde verpletteringsplaats gedurende 15 seconden bij drie klikken. Er mag geen koolstofmarkering verder reiken dan de grens van de initiële verplettering. Dit is vooral belangrijk als nauwkeurige markering van de verpletteringsplaats vereist is om de pincetten vooraf in koolstof te dopen en wijdverspreide koolstof op de operatieplaats te voorkomen.
Open de pincetten in poedervormige koolstof. Sluit ze vervolgens voorzichtig. Gebruik steriele gaas om het koolstof op de buitenkant van de hemostatische pincetten af te vegen.
Controleer de pincetten onder minimaal drievoudige vergroting om te verifiëren dat de verpletterende oppervlakken gelijkmatig zijn bedekt met poedervormige koolstof. Indien nodig worden ze opnieuw gedoopt en afgeveegd, herschikt en hecht u de gluteale musculatuur op dezelfde manier als de contralaterale zijde. Sluit ten slotte de huidsnede met de negen millimeter reflexclips.
Als negen millimeter reflexclips beweging beperken, kunnen kleinere reflexclips of zes aut-naden worden gebruikt. In plaats daarvan, na het opofferen van de muis, verwijdert u vier spieren. De tibias anterior extensor digitorum longus, peroneus longus en soleus in de achterpoot, voorzichtig door hun bindweefsel vast te pinnen op een zwarte sard-gecoate schaal.
Spuit ze vervolgens af in PBS. Fixeer ze vervolgens 30 minuten in 4% Paraform aldehyde. Om elke spier op een zwarte sard-gecoate petrischaal te dissecteren, verwijdert u de pezen ervan met behulp van de iridectomie-schaar.
Verdun vervolgens de spieren door de inwendige spiervezels af te pellen. Bewaar zorgvuldig het buitenoppervlak van de spier, inclusief de eindplaatbanden. Monteer vervolgens de resulterende spieren op plus-dia's met vectorschild en 22 bij 40 millimeter glazen dekglasjes, verzegeld aan twee kanten met heldere nagellak. Wanneer ze correct op de dia zijn gemonteerd, moeten de n-plaatbanden in contact zijn met de dekglasjes.
Hier is een voorbeeld van een verpletteringsplaats in situ aan de linker achterpoot. De verpletteringsplaats wordt aangegeven door zwarte koolstof. Het sterretje markeert een tak van de tibiale zenuw die het dijspierstelsel innerveert en dient als nuttig herkenningspunt.
Tijdens de verpletteringsoperatie is de tibiale verdeling van de heupzenuw in blauw geschetst, de peroneale in groen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit rapport beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het pletten van de wetenschappelijke zenuw van een muis en het analyseren van spierre-innervatie. De techniek maakt gebruik van gemakkelijk verkrijgbare hemostatische forceps om een volledige zenuwplettering te bereiken en omvat de voorbereiding van spier hele bereidingen voor regeneratieanalyse.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve geneeskunde
- Spierfysiologie
Achtergrond
- Zenuwverwondingen aan de wetenschappelijke zenuw kunnen leiden tot significante motorische tekorten.
- Begrip van zenuwregeneratie is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
- Hele berganalyse biedt inzichten in spierre-innervatie.
- Bestaande methoden kunnen gebrek hebben aan reproduceerbaarheid en toegankelijkheid.
Doel van het onderzoek
- Om een reproduceerbare methode voor zenuwplettering van de wetenschappelijke zenuw te demonstreren.
- Om spier hele bereidingen voor te bereiden voor daaropvolgende analyse van zenuwregeneratie.
- Om een eenvoudig protocol te bieden dat gemakkelijk kan worden geadopteerd door onderzoekers.
Gebruikte methoden
- De wetenschappelijke zenuw blootleggen met chirurgische retractoren.
- De zenuw pletten met hemostatische forceps en markeren met houtskool.
- Verwijderen van individuele spieren die door de wetenschappelijke zenuw worden geïnnerveerd van de achterpoot.
- Dissecteren van spieren voor hele berganalyse na immunokleuring.
Belangrijkste resultaten
- De methode zorgt voor consistente en volledige zenuwplettering van de wetenschappelijke zenuw.
- Spier hele bereidingen kunnen effectief worden geanalyseerd op regeneratie.
- Resultaten tonen de haalbaarheid van deze benadering voor het bestuderen van zenuwreparatie.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van spierre-innervatieprocessen.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare tool voor onderzoekers die zenuwverwondingen bestuderen.
- Hele berganalyse is een waardevolle techniek voor het beoordelen van spierre-innervatie.
- Het protocol kan eenvoudig worden geïmplementeerd in verschillende onderzoeksomgevingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method provides a reproducible model for studying peripheral nerve regeneration, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical neuroscience programs. By standardizing sciatic nerve crush and quantifying reinnervation via whole mount muscle analysis, it supports target validation and assay development for neuroprotective or neuroregenerative candidates. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking axonal growth to functional reinnervation readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on axonal regeneration and Schwann cell interactions in a genetically tractable model.
- Operational Value: Uses widely available transgenic mouse lines to dissect molecular mechanisms of nerve repair with high reproducibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-ready outputs (e.g., neuromuscular junction reinnervation) for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardizes crush site marking and muscle preparation to ensure assay consistency across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by modeling axonotmesis, a clinically relevant peripheral nerve injury.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through longitudinal, structure-function correlation of regeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a disease-relevant system for evaluating biologics or small molecules aimed at enhancing nerve repair.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by enabling precise measurement of axonal regeneration kinetics.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable dependent variables (e.g., reinnervated endplate bands) for compound effect assessment.
- Analytics: Generates statistical outputs from whole mount imaging that allow comparison of regeneration efficacy across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using a rodent model predictive of human peripheral nerve lesion responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated use in target de-risking and lead optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of axonal-Schwann cell-basal lamina interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized crush force, site marking, and muscle whole mount protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, histology-based regeneration metrics early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on functional reinnervation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, tissue dissection, and immunofluorescence staining.
- Depends on access to stereomicroscopes, hemostatic forceps, and imaging systems for whole mount analysis.
- Necessitates cross-team standardization of crush duration, marking technique, and muscle fixation timing.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the need for terminal procedures and skilled handling to maintain crush consistency and marking fidelity.
