Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse
22 februari 2012
In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.
Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige reproduceerbare methode te demonstreren voor het verpletteren van de heupzenuw en de volledige montage-analyse van spierreinnervatie na verplettering van de heupzenuw. Dit wordt bereikt door eerst de heupzenuw bloot te leggen, inclusief de juiste plaatsing van chirurgische retractoren om goede toegang tot de zenuw te garanderen. Vervolgens verplettert u de zenuw met hemostatische pincetten en markeert u de zenuw met houtskool.
Verwijder vervolgens de afzonderlijke spieren die door de heupzenuw worden geïnnerveerd van de achterpoot. De laatste stap is om individuele spieren te dissecteren voor volledige montage-analyse na immunokleuring. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat reproduceerbare verplettering van de heupzenuw eenvoudig kan worden uitgevoerd en dat spiermonturen kunnen worden gebruikt om de daaropvolgende regeneratie te analyseren.
Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het een eenvoudige reproduceerbare techniek biedt om de heupzenuw te verpletteren en vervolgens de axonale regeneratie te scoren. Begin deze procedure door de muis voor de operatie te verdoven met een cocktail van 100 milligram per kilogram ketamine en 10 milligram per kilogram xylazine via intraperitoneale injectie om postoperatieve pijn te minimaliseren. De muis krijgt ook een subcutane injectie van 10 milligram per kilogram meloxicam.
Scheer vervolgens voorzichtig beide achterkanten met een chirurgische haartrimmer. Breng dan harsverwijderingsroom aan voor volledige uitputting. Reinig de huid met een steriele katoenen applicator en Betadine chirurgisch scrub.
Breng daarna oogzalf aan op de ogen met een steriele katoenen applicator. Plaats de muis op een schone roestvrij stalen plaat boven een voorverwarmde homeo themische deken en houd de temperatuur van het dier op 37 graden Celsius. Plak vervolgens alle ledematen vast.
Plaats de achterpoot voorzichtig symmetrisch zodat het kniegewricht een rechte hoek maakt met het lichaam. Bedek vervolgens het operatieveld met een steriele doek onder de microscoop. Maak een halfronde insnijding dwars over de middenlijn.
Schei voorzichtig de huid van de onderliggende musculatuur en vouw deze van tijd tot tijd om. Breng ongeveer 0,1 milliliter steriele zoutoplossing aan om de operatieplaats tijdens de procedure vochtig te houden. Open vervolgens het fasciale vlak tussen de gluteus maximus en de voorste kop van de biceps femoris.
Om de heupzenuw voor een chirurgische controle te onthullen. De contralaterale heupzenuw moet worden blootgelegd en gemobiliseerd, maar intact gelaten. Vervolgens herschikt en hecht u de gluteale musculatuur.
Blootstel de experimentele heupzenuw op dezelfde manier met retractoren. Om de visualisatie te vergemakkelijken. Maak voorzichtig de heupzenuw los van het omringende bindweefsel met behulp van een paar iridectomie-schaar.
Gebruik vervolgens de fijne 5 45 pincetten om de zenuw op de onderkaak van de superfijne hemostatische pincetten te plaatsen, lijn de drie fasciae naast elkaar uit, niet op elkaar. De hemostatische pincetten zijn gegraveerd met een markering op 1,5 millimeter van hun punt. Plaats het buitenste gedeelte van de heupzenuw in lijn met deze markering voordat u verplettert.
Dit zorgt voor een verplettering van uniforme breedte en dat de zenuw niet verder reikt dan de kaken van de hemostatische pincetten wanneer deze platgedrukt is door de verpletterende kracht. Als de zenuw verder reikt dan de pincetuiteinden, wordt de zenuw slechts gedeeltelijk verpletterd. Gebruik een tweede paar hemostatische pincetten dat is vooraf gedoopt en met koolstofpoeder is bepoederd om de verpletteringsplaats te markeren.
Verpletter de zenuw op dezelfde verpletteringsplaats gedurende 15 seconden bij drie klikken. Er mag geen koolstofmarkering verder reiken dan de grens van de initiële verplettering. Dit is vooral belangrijk als nauwkeurige markering van de verpletteringsplaats vereist is om de pincetten vooraf in koolstof te dopen en wijdverspreide koolstof op de operatieplaats te voorkomen.
Open de pincetten in poedervormige koolstof. Sluit ze vervolgens voorzichtig. Gebruik steriele gaas om het koolstof op de buitenkant van de hemostatische pincetten af te vegen.
Controleer de pincetten onder minimaal drievoudige vergroting om te verifiëren dat de verpletterende oppervlakken gelijkmatig zijn bedekt met poedervormige koolstof. Indien nodig worden ze opnieuw gedoopt en afgeveegd, herschikt en hecht u de gluteale musculatuur op dezelfde manier als de contralaterale zijde. Sluit ten slotte de huidsnede met de negen millimeter reflexclips.
Als negen millimeter reflexclips beweging beperken, kunnen kleinere reflexclips of zes aut-naden worden gebruikt. In plaats daarvan, na het opofferen van de muis, verwijdert u vier spieren. De tibias anterior extensor digitorum longus, peroneus longus en soleus in de achterpoot, voorzichtig door hun bindweefsel vast te pinnen op een zwarte sard-gecoate schaal.
Spuit ze vervolgens af in PBS. Fixeer ze vervolgens 30 minuten in 4% Paraform aldehyde. Om elke spier op een zwarte sard-gecoate petrischaal te dissecteren, verwijdert u de pezen ervan met behulp van de iridectomie-schaar.
Verdun vervolgens de spieren door de inwendige spiervezels af te pellen. Bewaar zorgvuldig het buitenoppervlak van de spier, inclusief de eindplaatbanden. Monteer vervolgens de resulterende spieren op plus-dia's met vectorschild en 22 bij 40 millimeter glazen dekglasjes, verzegeld aan twee kanten met heldere nagellak. Wanneer ze correct op de dia zijn gemonteerd, moeten de n-plaatbanden in contact zijn met de dekglasjes.
Hier is een voorbeeld van een verpletteringsplaats in situ aan de linker achterpoot. De verpletteringsplaats wordt aangegeven door zwarte koolstof. Het sterretje markeert een tak van de tibiale zenuw die het dijspierstelsel innerveert en dient als nuttig herkenningspunt.
Tijdens de verpletteringsoperatie is de tibiale verdeling van de heupzenuw in blauw geschetst, de peroneale in groen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit verslag beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het verbrijzelen van de nervus ischiadicus van de muis en het analyseren van de spierreïnnervatie. De techniek maakt gebruik van algemeen verkrijgbare hemostatische klemmen om een volledige zenuwverbrijzeling te bewerkstelligen en omvat de preparatie van volledige spierpreparaten voor regeneratieanalyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Spierfysiologie
Achtergrond
- Letsels aan de nervus ischiadicus kunnen leiden tot aanzienlijke motorische tekorten.
- Inzicht in zenuwregeneratie is cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- Whole mount-analyse biedt inzicht in spierreinnervatie.
- Bestaande methoden kunnen tekortschieten in reproduceerbaarheid en toegankelijkheid.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode voor het pletten van de nervus ischiadicus te demonstreren.
- Om volledige spierpreparaten voor te bereiden voor de daaropvolgende analyse van zenuwregeneratie.
- Om een eenvoudig protocol te bieden dat gemakkelijk door onderzoekers kan worden overgenomen.
Gebruikte methoden
- Leg de nervus ischiadicus vrij met behulp van chirurgische retractoren.
- Plet de zenuw met hemostatische klemmen en markeer deze met houtskool.
- Verwijder individuele spieren die door de nervus ischiadicus worden geïnnerveerd uit het achterpootje.
- Dissekeer de spieren voor whole mount-analyse na immunokleuring.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een consistente en volledige compressie van de nervus ischiadicus mogelijk.
- Whole-mount preparaten van spieren kunnen effectief worden geanalyseerd op regeneratie.
- De resultaten tonen de haalbaarheid van deze aanpak aan voor het bestuderen van zenutherstel.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van processen bij spierreïnnervatie.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbaar instrument voor onderzoekers die zenuwletsel bestuderen.
- Whole mount-analyse is een waardevolle techniek voor het beoordelen van spierreïnnervatie.
- Het protocol kan eenvoudig worden geïmplementeerd in verschillende onderzoekssituaties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode biedt een reproduceerbaar model voor het bestuderen van perifere zenuwregeneratie, waardoor mechanistische risicobeperking van therapeutische doelwitten in preklinische neurowetenschappelijke programma's mogelijk wordt. Door de compressie van de nervus ischiadicus te standaardiseren en reinnervatie te kwantificeren via analyse van volledige spierpreparaten, ondersteunt deze methode de validatie van doelwitten en de ontwikkeling van assays voor neuroprotectieve of neuroregeneratieve kandidaten. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege discovery-fasen door axonale groei te koppelen aan functionele read-outs van reinnervatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over axonale regeneratie en interacties van Schwanncellen te onderzoeken in een genetisch hanteerbaar model.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van breed beschikbare transgene muislijnen om moleculaire mechanismen van zenutherstel met een hoge reproduceerbaarheid te ontleden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, beeldvormingsklaar resultaten (bijv. reïnnervatie van de neuromusculaire overgang) voor high-content screening van verbindingenbibliotheken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de markering van de verbrijzelingsplaats en de spierpreparatie om de consistentie van de assay tussen laboratoria en tijdstippen te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door axonotmesis, een klinisch relevante perifere zenuwbeschadiging, te modelleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang via longitudinale correlatie tussen structuur en functie van de regeneratie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, en biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van biologics of kleine moleculen die gericht zijn op het verbeteren van zenuwherstel.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en functionele doelwitvalidatie door nauwkeurige meting van de kinetiek van axonale regeneratie mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare weefselpreparaten met kwantificeerbare afhankelijke variabelen (bijv. geherinnerveerde eindplaatbanden) voor de beoordeling van het effect van verbindingen.
- Analytics: Genereert statistische outputs uit whole mount imaging waarmee de regeneratie-efficiëntie tussen verschillende experimentele condities kan worden vergeleken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door gebruik te maken van een knaagdiermodel dat voorspellend is voor de respons op perifere zenuwlaesies bij mensen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform voor herhaaldelijk gebruik bij target de-risking en lead-optimalisatiecampagnes.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door directe visualisatie van interacties tussen axonen, Schwanncellen en de basale lamina.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde kneppelkracht, locatiemarkering en een protocol voor whole mount van spierweefsel.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de pijplijn objectieve, op histologie gebaseerde regeneratiemetrieken te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroregeneratieve kandidaten mogelijk op basis van gegevens over functionele reïnnervatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgie, weefseldissectie en immunofluorescentiekleuring.
- Afhankelijk van toegang tot stereomicroscopen, hemostatische pincetten en beeldvormingssystemen voor whole mount-analyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de duur van de verbrijzeling, de markeringstechniek en de timing van de spierfixatie.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het model op verschillende muizenstammen of genetische achtergronden.
- Beperkt door de noodzaak van terminale procedures en vakkundige hantering om de consistentie van de verbrijzeling en de nauwkeurigheid van de markering te waarborgen.
