Name: Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer hoe je alginaat microcapsules gebruikt als 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen tot dopaminerge neuronen. Deze methode verbetert cel-cel interacties en differentiatie-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NHMRC Program Grant # 568969 (PSS) en de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).

Alle van de onderstaande procedures worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken in een klasse II bioveiligheid kabinet. Reagentia en apparatuur zijn vermeld in de onderstaande tabellen. 1. Bereiding van 1,1% alginaat (w / v) <ol><li> Voeg 0,275 g gezuiverd natriumalginaat (hoog gehalte glucuronzuur ≥ 60%, viscositeit&gt; 200 mPa s, en endotoxine ≤ 100 EU / g) in een steriele 50 ml buis en voeg 25 ml steriele 0,1% gelatine oplossing eerder bereid (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H 2 O en opgelost door autoclaveren). </li><li> Vortex de buis gedurende ongeveer 30 seconden om gedeeltelijke ontbinding van de alginaat poeder en plaats de buis op een orbitale mixer bij 10 xg voor overnachting (kamertemperatuur). </li><li> Voeg 2,778 ml van 9% steriele NaCl (4,5 g NaCl/50 ml milli-Q H 2 O) 25 ml alginaat oplossing. Vortex de buis gedurende ongeveer 30 seconden, gevolgd door centrifugatie bij 95 x g gedurende 5 minuten. </li><li> Bewaar de alginaat oplossing bij 4 °; C voor korte-termijn opslag (1-2 maanden) of bij -20 ° C voor opslag op lange termijn (ongeveer een jaar). </li></ol> 2. Voorbereiding van CaCl 2 Neerslag Bad <ol><li> Los 14,7 g CaCl2. 2H 2 O en 2,38 g HEPES in 1 liter milli-Q H 2 O </li><li> Stel de pH-waarde tot 7,4. </li><li> Steriliseren de oplossing met een 0,22 pm filter. </li><li> Neerslag bad kan worden bewaard bij kamertemperatuur (6-12 maanden). </li></ol> 3. Voorbereiding van ontkapselen Solution <ol><li> In 500 ml fosfaat Dulbecco&#39;s gebufferde fysiologische zoutoplossing (D-PBS), voeg 50 ml van 0,5 M EDTA en 5 ml 1M HEPES. </li><li> Steriliseren met een 0,22 pm filter of autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Bewaar de ontkapselen oplossing bij kamertemperatuur (6-12 maanden). </li></ol> 4. Voorbereiding van Serum Vervanging (SR) Medium <ol><li> Voorafgaand aan de inkapseling, voor te bereiden SR medium van te voren als debeschreven in Tabel specifieke reagentia en materialen. </li></ol> 5. Voorbereiding van ROCK Inhibitor (Y-27632) <ol><li> Verdun Y-27632 poeder in 0,1% humaan serumalbumine (HSA) in PBS-D een 5 mM oplossing. </li></ol> 6. Voorbereiding van hESC voor inkapseling <ol><li> Behandel de cellen gekweekt medium aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor (RI) gedurende twee uur bij 37 ° C (bescherming tegen licht). </li><li> Na de RI behandeling cellen tweemaal wassen met PBS-D en los van de cellen van kweekplaten enzymatisch met Accutase gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Voorzichtig schrapen de cellen met de pipet of celschraper en verzamel in een 15 ml buis. Neutraliseer het Accutase met SR medium in 1:1 verhouding. </li><li> Een enkele celsuspensie bereiden filteren geneutraliseerd cellen met een 40 pm filter en op in een verse 50 ml centrifugebuis. </li><li> Bereken de totale aantal cellen in de oplossing met een hemacytometer. </li&gt; <li> Centrifugeer de celsuspensie 95 xg gedurende 5 min en zorgvuldig daarna Verwijder de bovenstaande vloeistof. Was de cellen met voorverwarmde 0,9% NaCl. Centrifugeer 95 xg gedurende 5 minuten en gooi het supernatant. </li></ol> 7. Inkapseling van cellen <ol><li> Bereid een 1 ml spuit aan een zachte kunststof slang van 14G x 2 &quot;IV katheter. Deze wordt gebruikt om de celsuspensie wordt geladen op het spuitpomp zoals getoond in figuur 1 te zuigen. </li><li> De cellen resuspenderen met voorverwarmd alginaatoplossing bij een dichtheid van 1,25 miljoen cellen / ml alginaat. Meng voorzichtig met de spuit en voorkomen dat er bubbels. </li><li> Stel de kraal generator, spuitpomp de luchtstromingsmeter zoals weergegeven in figuur 1. Meer details van deze apparaten in tabel specifieke reagentia en materialen. </li><li> Met de cellen opgezogen in de spuit, verwijder de plastic buis van IV katheter en bevestig de spuit aan de inkapseling machine. Zorg ervoor dat er een 10 cm te zijn gat<html> tween het einde van de inkapseling machine en de verzamelplaats zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Kapselen de cellen door de spuitpomp bij 20 ml / uur luchtstroom 8 L / min en een druk van 100 kPa (de grootte van capsules kan worden gewijzigd door de luchtstroom). </li><li> Verzamelen van de ingekapselde cellen in een petrischaal (100 x 15 mm) gevuld met 20 ml voorverwarmde precipitatie bad 7 min de capsules stabiliseren. </li><li> Breng de ingekapselde cellen door voorzichtig inademing in 50 ml centrifugebuizen gevuld met 20 ml 0,9% NaCl. </li><li> Laat de capsules om zich te vestigen in de bodem van de buis dan voorzichtig Verwijder de bovenstaande vloeistof. Herhaal het wasproces met 0,9% NaCl. </li><li> Resuspenderen de ingekapselde cellen in voorverwarmde kweekmedium aangevuld met RI (10 uM), te brengen in een cultuur kolf en geïncubeerd bij 37 ° C / 5% CO2. </li></ol> 8. Differentiatie van Encapsulated hESC naar DA neuronen ve_content &quot;&gt; De ingekapselde hESC worden behandeld met RI gedurende 3 dagen voorafgaand aan differentiatie. <ol><li> Zaad de muis stromale cellijn PA6 cellen een dichtheid van 1,0 x 10 4 per cm2 0,1% gelatine beklede T75 kolf en de toestand van de PA6 cellen DA neurale differentiatie medium (Tabel Materials) 24 uur voor de differentiatie. </li><li> Breng de capsules in een 50 ml centrifugebuis en laten bezinken tot de bodem van de buis. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de capsules in PA6 cel met airconditioning DA neurale differentiatie medium. </li><li> Cultuur de ingekapselde hESC met de PA6 celmonolaag (9 x 10 6 hESC &#39;s per 7,5 x 10 5 PA6 cellen) gedurende 28 dagen met een media-verandering op dag 4 en om de dag daarna (veranderen slechts de helft van het medium per keer). </li><li> Na 3 weken in cultuur PA6 cellen aanvullen DA neurale differentiatie medium met 100 ng / ml SHH en 100 ng / ml FGF8a de resterende week. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation van ingekapselde hESC <ol><li> Zuig de capsules in een 15 ml centrifugebuis zodat ze op de bodem van de buis. Vervolgens voorzichtig Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Was de capsules met D-PBS twee keer. Laat de capsules op de bodem van de buis vervolgens de supernatant. </li><li> Voeg 5 ml ontkapselen oplossing voor de capsules. Meng de suspensie via streven voor incubatie bij kamertemperatuur gedurende 4-5 minuten. </li><li> Centrifugeer het decapsulated cellen bij 95 xg gedurende 3 minuten en gooi het supernatant. </li><li> Was de celpellet D-PBS gevolgd door centrifugatie bij 95 xg gedurende 3 minuten. Herhaal. </li><li> De decapsulated cellen verder gekweekt als een monolaag of voor downstream analyse. </li></ol> 10. Representatieve resultaten De diameter van alginaat microcapsules is 400-500 pm. Het aantal cellen in de capsule was estimated door berekening van het aantal cellen gedeeld door het totale aantal capsules per run. Daarom werd ongeveer 5,0 x 10 4 cellen per capsule geschat. Hieruit Wij veronderstellen dat het maximum aantal cellen van de capsule kan bevatten ongeveer 1,0 x 10 5. De levensvatbaarheid van ingekapselde hESC&gt; 80% (figuur 2) zoals bepaald met behulp carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidly ester (CFDA) / propidium jodide (PI) assay. We hebben optimale voorwaarden van hESC inkapseling door de geringere alginaat concentratie van 2,2% tot 1,1% en het veranderen van de precipitatiebad van bariumchloride om calciumchloride. Van deze voorwaarden, hebben we laten zien dat alleen de cellen die werden ingekapseld met 1,1% calcium alginaat kunnen overleven, groeien en vormen EBS in vitro 1. Verder optimaliseren van de aandoening, de gevolgen van kweekmedia en RI, werden Y-27632 onderzocht. De gegevens weergegeven in figuur 2 en 3 tonen aan dat RI prevented dissociatie-geïnduceerde apoptose en onderhouden levensvatbaarheid van de cellen en bevorderd clustervorming 1,6. Bovendien is de levensvatbaarheid van ingekapselde hESC gekweekt in HFF-CM + RI was significant hoger dan bij andere groepen zonder RI suppletie, maar dit was niet significant verschillend van ingekapselde hESC gekweekt in SR + RI. Ook celproliferatie met BrdU test gestegen van 25% tot 75% als enkele cellen zich ontwikkeld tot clusters (figuur 3). Apoptosis assay van TUNEL gebleken dat de afzonderlijke cellen in microcapsules gekweekt in medium SR apoptotische waren (gegevens niet getoond) dat de clusters opgehaald uit het HFF-CM waren meestal negatief TUNEL. Tot op zekere hoogte, HFF-CM aangevuld met bFGF ook bevorderd de overleving en groei van ingekapselde hESC &#39;in de afwezigheid van Y-27632. Echter, de behandeling met Y-27632 voor (2 uur) en na inkapseling (tegen 4 dagen) aanzienlijk verbeterde levensvatbaarheid, proliferatie en clustervorming van de ingekapselde hESCbij 1,1% calciumalginaat microcapsules. Eerder toonden we aan dat ingekapselde hESC met succes kan worden gedifferentieerd om definitieve endoderm 1. Hier hebben we gekeken naar de toepassing van de cel inkapseling als een 3D-platform om ingekapselde hESC differentiëren in DA neuronen. hESC, dat embryoid instanties (EB) gevormd in capsules waren direct gedifferentieerde en op decapsulation onder de beschreven omstandigheden toonde een progressieve neuronale morfologie (figuur 4) na 2-3 dagen van cultuur met meer dan 90% levensvatbaarheid. Genexpressie analyse toonde een down-regulatie van pluripotente marker, OCT4 terwijl neuroprogenitor marker, PAX6 en DA neuronale marker, TH waren up-gereguleerd na 7 dagen van differentiatie (figuur 5A). Immunofluorescentie kleuring bleek dat gedifferentieerde hESC waren PAX6-positief (&gt; 80%), maar OCT4-negatief op dag 7. Verder gedifferentieerde hESC heeft TH-positieve (&gt; 90%) neuronen na 21 dagen (figuur 5B). Western blot analyse toondeeen up-regulatie van TH expressie van dag 14 (figuur 5C), terwijl PAX6 uitdrukking was down-gereguleerd na dag 21. In vergelijking de cellen gekweekt onder tweedimensionale (2D) milieu onder dezelfde omstandigheden (bijvoorbeeld RI voorbehandeling 2 uur RI nabehandeling gedurende 3 dagen voor differentiatie) gehandhaafd een hoog percentage PAX6-positieve cellen (&gt; 80 %) gedurende de differentiatie en werden minder efficiënt in onderscheiden TH-positieve cellen (&lt;60%) als in 3D milieu door inkapseling (Figuur 5A en C).

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
<li>Cell encapsulation: promise and progress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Orive, G. 9, 104-107 (2003).</li>
<li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Verschillende studies met behulp van muis embryonale stamcellen en hESC hebben aangetoond dat de voordelen van 3D-cultuur systeem in biomaterialen en tissue engineering 2,3. We calciumalginaat microcapsules gebruikt als geschikt 3D platform hESC vermeerdering en differentiatie te bestuderen in vergelijking met barium alginaat omdat hESC lieten een significant verhoogde levensvatbaarheid als ingekapseld in calciumalginaat dan barium alginaat. Deze cultuur-systeem maakt het ook mogelijk een high-density celkwee...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen </td></tr><tr><td> Alginaat (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> hoge glucuronzuur gehalte ≥ 60%, viscositeit&gt; 200 mPa s, en endotoxine &lt;100 EU / g </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Type J1 kraal generator </td><td> Nisco techniek Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser injectiepomp </td><td> New Era Pump Systems Inc </td><td> Model NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow Medical Flowmeter </td><td> Gascon Systems</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Humaan serum albumine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;IV katheter </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Voor SR medium (basale) </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Voor SR medium (2 mM) </td></tr><tr><td> Knockout Serum Vervanging </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Voor SR medium (20%) </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Voor SR medium (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insuline-transferrine-Selenium (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Voor SR medium (1x) </td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Voor SR medium (0,1 mm) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Voor SR medium (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow Minimum Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Voor DA neurale differentiatie medium (basale) </td></tr><tr><td> Knockout Serum Vervanging </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Voor DA neurale differentiatie medium (10%) </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Voor DA neurale differentiatie medium (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Voor DA nEural differentiatie medium (0,1 mm) </td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Voor DA neurale differentiatie medium (0,1 mm) </td></tr><tr><td> Sonic Hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Voor DA neurale differentiatie (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Fibroblast groeifactor 8 bis (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Voor DA neurale differentiatie (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginaat microcapsule als een 3d-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hesc) tot verschillende geslachten

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) zijn in opkomst als een aantrekkelijk alternatief voor cel-therapie omdat ze kunnen worden uitgebreid in cultuur voor onbepaalde tijd en gedifferentieerd om alle soorten cellen in het lichaam. Verschillende soorten van biomaterialen zijn ook gebruikt stamcellen culturen een micro nabootsen van de stamcel nis 1-3 geven. Dit laatste is belangrijk voor het bevorderen van cel-cel interacties, cel proliferatie en differentiatie in specifieke afstammingslijnen als weefsel organisatie door een driedimensionale (3D) omgeving 4 zoals inkapseling. Het principe van de cel inkapseling omvat beknelling van levende cellen binnen de grenzen van semi-permeabele membranen in 3D culturen 2. Deze membranen voor de uitwisseling van voedingsstoffen en zuurstof stimuli over de membranen, terwijl antilichamen en immuuncellen van de gastheer die groter zijn dan de capsule poriegrootte uitgesloten 5. Hier wordt voorafstuurde een benadering van cultuur en te differentiëren hESC DA neuronen in een 3D micro-omgeving met behulp van alginaat microcapsules. We hebben gewijzigd de kweekomstandigheden 2 tot en met de levensvatbaarheid van ingekapselde hESC te verbeteren. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van p160-Rho-geassocieerde coiled-coil kinase (ROCK) remmer, Y-27632 en menselijke foetale fibroblast-geconditioneerd serum vervanging medium (HFF-CM) om het 3D-platform aanzienlijk verbeterd de leefbaarheid van ingekapselde hESC waarbij de cellen uitgedrukt definitieve endoderm merkergenen 1. We hebben nu gebruik gemaakt van deze 3D-platform voor de verspreiding van hESC en efficiënte differentiatie naar DA neuronen. Eiwit en genexpressie analyses na de laatste fase van de DA neuronale differentiatie toonde een verhoogde expressie van tyrosine hydroxylase (TH), een marker voor DA neuronen,&gt; 100 plooien na 2 weken. Onze hypothese was dat onze 3D-platform met behulp van alginaat microcapsules kan nuttig zijn om de proliferatie te bestuderen en gericht differentiatievan hESC naar verschillende geslachten. Deze 3D Tegelijkertijd kan de scheiding van feeder cellen hESC tijdens het proces van differentiatie en ook mogelijke immuun-isolatie tijdens transplantatie in de toekomst.

We hebben geoptimaliseerd een micro-inkapseling techniek als een effectief 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van embryonale stamcellen endoderm en dopaminerge (DA) neuronen. Het biedt ook een kans voor immuun-isolatie van cellen van de gastheer tijdens de transplantatie. Dit platform kan worden aangepast voor andere celtypen.

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijken een aantrekkelijke alternatieve bron voor celvervangende therapie te zijn, aangezien ze in kweek kunnen worden uitgebreid ...

Dit protocol is geoptimaliseerd voor het inkapselen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen en het differentiëren daarvan tot dopaminerge neuronen in een 3D-systeem. Behandel eerst de kolonies met een ROCK-inhibitor (RI) en dissocieer ze tot enkelcellen; meng deze met natriumalginaat en leid ze door het inkapselingsapparaat. Zet de RI-behandeling drie dagen voort, breng de ingekapselde cellen over naar PA6-cellen en differentieer deze gedurende 28 dagen.Uiteindelijk tonen analyses van gen- en eiwitexpressie een hogere efficiëntie aan bij het genereren van dopaminerge neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze specifieke techniek ten opzichte van het bestaande 2D-differentiatieprotocol is dat we proberen deze cellen te propageren en te differentiëren in een 3D-omgeving, en dat deze 3D-omgeving de mogelijkheid biedt om cellen met een hoge dichtheid te propageren. Daarnaast biedt dit de kans op een betere cel-celinteractie voor differentiatie.En ten derde zorgt het u verderop in het proces voor een betere differentiatie-efficiëntie. Daarnaast zou ik willen toevoegen dat deze specifieke techniek ook kan worden aangepast voor andere typen cellen die we in een 3D-omgeving ku

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video showcases the development and differentiation of human neural stem cells within a three-dimensional scaffold. A laminin coating on the scaffold promotes cell attachment, while a growth factor-free neural medium induces cell differentiation into neural progenitor cells, which extend their processes within a porous architecture in multiple directions, forming a three-dimensional...

Differentiating Human Neuronal Stem Cells into 3D Culture Using a Porous Scaffold

In this video, a stepwise protocol for Human embryonic stem cells into neural organoids is demonstrated. The method involves inducing neuronal rosette formation, followed by controlled maturation and final culturing on a hydrophobic membrane to achieve fully developed neural organoids.

Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells into Neural Organoids

Protocol details worden verstrekt voor het in vitro merken menselijke embryonale stamcellen met tweede harmonischen genereren nanodeeltjes. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters worden ook gepresenteerd.

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

We hebben een methode ontwikkeld om pluripotente stamcellen (PS-cellen) in alginaathydrogeelkapsels te inkapselen met behulp van een coaxiale mondstuk. Dit voorkomt dat cellen zich overmatig bundelen en beperkt de schuifspanning die cellen in suspensiecultuur ervaren. De techniek is toepasbaar op de massaproductie van PS-cellen evenals op onderzoek naar stamcelniches.

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Leer hoe je alginaat microcapsules gebruikt als 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen tot dopaminerge neuronen. Deze methode verbetert cel-cel interacties en differentiatie-efficiëntie.

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten (Video) | JoVE Journal

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Meer video's verkennen