Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Dit protocol is geoptimaliseerd om pluripotente menselijke embryonale stamcellen in te kapselen en ze te differentiëren in dopaminerge neuronen in een 3D-systeem. Eerst worden de kolonies behandeld met rock-remmer of RI en worden ze geassocieerd in enkele cellen met acuate vermengd met natriumalginaat en door het inkapselingsapparaat geleid. Ga door met de RI-behandeling gedurende drie dagen, breng de ingekapselde cellen over naar PA zes cellen en differentiëren gedurende 28 dagen.

Uiteindelijk laten gen- en eiwitexpressieanalyses een hogere efficiëntie zien bij het genereren van dopaminerge neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze specifieke techniek ten opzichte van het bestaande 2D-differentiatieprotocol is dat we proberen deze cellen te propageren en te differentiëren in een 3D-omgeving en dat deze 3D-omgeving de mogelijkheid biedt dat cellen op hoge dichtheid kunnen worden gepropageerd. En het geeft ook de mogelijkheid om een betere cel-op-cel-interactie te hebben voor differentiatie.

En ten derde geeft het je ook een betere efficiëntie van differentiatie verderop. En ook, als ik mag toevoegen, deze specifieke techniek kan ook worden aangepast voor andere soorten cellen, die we in een 3D-omgeving kunnen propageren. Onthoud ook dat deze specifieke techniek is geoptimaliseerd op basis van het gebruik van een specifieke rock-remmer die celapoptose voorkomt en ook voorkomt dat de cel loskomt van de kweekschalen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode in het begin worstelen, omdat deze techniek niet typisch wordt uitgevoerd in weefselkweek. De volgende inkapselingstechniek is geoptimaliseerd op basis van de samenvattende studies van Dr. Dean Dr. Chad over de toepassing van R-remmer type alginaat, alginaatconcentratie en inkapselingsapparatuur instellingen. Jamie en Kim, een promovendus uit ons lab, zullen dit protocol nu demonstreren.

Voeg 25 milliliter steriele 0,1% gelatine-oplossing toe aan 275 milligram gezuiverd natriumalginaat in een steriele 50 milliliter buis vortex om het alginaatpoeder gedeeltelijk op te lossen. Plaats vervolgens de buis op een orbitale mixer bij 10 keer G een nacht lang. Voeg vervolgens 9% steriele natriumchloride toe aan de alginaat-oplossing.

Vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer vervolgens bij 95 keer G gedurende vijf minuten. Bewaar de alginaat-oplossing bij vier graden Celsius. Behandel eerst de menselijke embryonale stamcellen in een donkere omgeving met kweekmedium dat is aangevuld met 10 micromolar rock-remmer.

Incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Was nu de cellen twee keer met DPBS om de cellen enzymatisch los te maken. Voeg accutane toe en incubeer gedurende 10 minuten.

Bij 37 graden Celsius, oogst voorzichtig de cellen met een celschraper en breng ze over naar een 15 milliliter buis. Neutraliseer de Accutane met een gelijk volume SL-medium. Breng vervolgens de geneutraliseerde cellen door een 40 micron filter in een verse 50 milliliter centrifugeerbuis.

Gebruik nu een hemo cytometer om de cellen te tellen. Pellet de cellen door centrifugatie, gooi voorzichtig de supinate weg. Was vervolgens de cellen eenmaal met voorverwarmd.

0,9% natriumchloride. Centrifugeer uw opbrengst en gooi de supinate weg. Om de menselijke embryonale stamcellen in te kapselen, begint u met het Resus-suspenderen van de cellen met voorverwarmde alginaat-oplossing.

Om dit te doen, bevestigt u een 20 milliliter spuit aan zachte kunststof buis en zuigt u alginaat in de spuit. Meng vervolgens voorzichtig de celsuspensie met behulp van de spuit zonder bellen te vormen. Zuig nu de cellen in de spuit.

Gooi de plastic buis weg en bevestig vervolgens de spuit aan de inkapselingsmachine. Ga door met het instrumentenset van de parelgenerator, spuitpomp, luchtstroommeter en calciumchloride precipitatiebad. Controleer een gat van 10 centimeter tussen het einde van de inkapselingsmachine en het punt van verzameling in de petrischaal.

Stel vervolgens de spuitpomp in op 10 milliliter per uur. Luchtstroomsnelheid bij acht liter per minuut en een druk van 100 kilopascal. Verzamel de ingekapselde cellen gedurende zeven minuten in een voorverwarmd precipitatiebad.

Breng ze vervolgens over door middel van zachte aspiratie in een 50 milliliter centrifugeerbuis met 20 milliliter 0,9% natriumchloride. Laat de capsules naar de bodem van de buis zakken, gooi voorzichtig de supinate weg, was vervolgens eenmaal met 0,9% natriumchloride. Ga door met het opnieuw suspenderen van de ingekapselde cellen in voorverwarmd kweekmedium, aangevuld met rock-remmer. Breng over naar een kweekfles en incubeer gedurende drie dagen.

Zaai de muis stromale lijn PA zes cellen in een 0,1% gelatine-gecoate T 75 fles en conditionerend dopaminerge neurale differentiatiemedium gedurende 24 uur. Breng de capsules over naar een 50 milliliter centrifugeerbuis en laat ze naar de bodem van de buis zakken. Gooi de supinate weg en suspendeer de capsules opnieuw in PA zes cel conditionerend dopaminerge neurale differentiatie.

Medium cultuur. De ingekapselde menselijke embryonale stamcellen met de PA zes cellagelaag gedurende 21 dagen. Bij het verversen van het medium.

Slechts de helft van het medium elke keer, blijf de PA zes cellen cultiveren in dopaminerge neurale differentiatie. Medium aangevuld met inducerende factoren gedurende één week. Aspirant eerst de capsules en breng ze over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis.

Wanneer de capsules naar de bodem zijn gezakt, gooi de supinate weg. Was twee keer met DPBS, gooi de supinate weg. Voeg vervolgens vijf milliliter decap-ululatie-oplossing toe en meng de suspensie grondig.

Incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na centrifugeren pellet, decap-cellen en was twee keer met DPBS. Ga door met het gebruik van decap-cellen, hetzij als een monolaagcultuur of voor onmiddellijke downstream-analyse. In een typische bereiding is de diameter van alginate-microcaps tussen 400 en 500 micron.

Hier, C-F-D-A-P-I-assay. De resultaten bepalen de groene levensvatbare ingekapsel