Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test
6 februari 2012
Een nieuwe fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) methode die gelijktijdig onderzoekt zowel numerieke en structurele chromosoom veranderingen, name de specifieke chromosomale translocaties geassocieerd met leukemie en lymfoom, van alle 24 menselijke chromosomen op een enkel apparaat in een hybridisatie wordt beschreven.
De Octa Chrome Fish-assay onderzoekt gelijktijdig alle 24 menselijke chromosomen in een enkele hybridisatie op één slide. Bereid eerst metafase-uitstrijkjes voor op de specifieke achtkante slide. Voer vervolgens een geautomatiseerde scan uit van de monsterslide om de locatie van alle metafasen en toekomstige herbeoordeling van alle celbeelden te vergemakkelijken.
Plaats vervolgens de achtkante slide bovenop het Octa chrome-apparaat en hybridiseer de sondes. De verkregen resultaten kunnen drie verschillende geverfde volledige chromosomen in elk vierkant laten zien op basis van de rangschikking van chromosoomcombinaties op het RO-apparaat. Ik had het idee voor deze RO FISH-methode voor het eerst toen ik fish ging toepassen in menselijke populatiestudies in de vroege jaren 1990.
Vervolgens introduceerde ik mijn idee van triple kleurverf, achtkante slide om de cel in te stellen op de jaarlijkse A A CR-conferentie in 1994. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals klassieke chromosoombuiging en moderne spectrale prototypie is dat het gemakkelijk alle 24 menselijke chromosomen in een groter aantal cellen kan analyseren. Begin met een voorbereiding van metafase cellen gefixeerd in suspensie als controle, pipetteer druppels cellen op een slide en controleer de juiste dichtheid.
Dompel nu in achtkante OC chrome, slide in zuivere ethanol gedurende twee minuten. Verdeel in een opeenvolging van afwisselende vierkanten vijf microliters celsuspensie op de sjabloonslide om te voorkomen dat de celuitstrijkjes elkaar beïnvloeden. Laat de monsters drogen voordat je grenzende paren spot.
Breng 20 microliters van 0,2 microgram per milliliter DAPI-kleurstof aan op het centrum van elke helft van de slide en plaats een dekglas. Voer nu een geautomatiseerde scan uit van de monsterslide om de metafase cellen te lokaliseren. Gebruik metaverse-software om de locatie van alle metafasen en toekomstige herbeoordeling van alle celbeelden te vergemakkelijken.
Bekijk de scanresultaten handmatig en verwijder niet-metafase artefacten. Verwijder eerst de DPI-kleurstof in twee XSSC-buffer en dehydrateer vervolgens de monsters door een reeks ethanol-washings. Laat de slide drogen en plaats hem vervolgens op een 37 graden Celsius hopplate gedurende vijf minuten.
Breng nu de chroma sonde, multi sonde hybridisatiekamer en de hybridisatiebuffer in evenwicht in een 37 graden Celsius waterbad met de labelzijde naar beneden. Plaats het OC chrome-apparaat op een 37 graden Celsius hot plate. Voeg twee microliters voorverwarmde hybridisatieoplossing toe aan elk van de acht gebieden.
Keer voorzichtig om en oriënteer de sjabloon. Schuif over het OC chrome-apparaat. Controleer of de sjabloonslide is uitgelijnd met het Octa Chrome-apparaat.
Laat vervolgens de slide voorzichtig zakken op de druppels hybridisatieoplossing en breng een zachte gelijkmatige druk aan om de hybridisatieoplossing naar de randen van elk van de verhoogde gebieden op het OC chrome-apparaat te verspreiden. Til aan het matglaseinde van de slide op en draai hem om zodat de slide zich onder het OC chrome-apparaat bevindt. Plaats hem op een 37 graden Celsius hot plate gedurende 10 minuten.
Breng hem vervolgens over naar een 75 graden Celsius hot plate gedurende vijf minuten. Om de monsters te denatureren voor de hybridisatie-stap, breng ze over naar een chroma sonde, multi sonde hybridisatiekamer. Plaats het deksel weer op en laat de kamer 's nachts in het 37 graden Celsius waterbad drijven.
Verwijder de slide voorzichtig uit het apparaat en was in 0,4 overtollig SC bij 72 graden Celsius gedurende twee minuten. Voer de tweede was uit bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Ga verder met het toevoegen van 20 microliters DPI in het midden van elke helft van de slide en plaats een dekglas.
Incubeer de monsters in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat ze onder fluorescencmicroscopie worden bekeken. De Octa chrome fish-assay vergemakkelijkt gelijktijdige onderzoeking van alle 24 menselijke chromosomen met behulp van een enkele hybridisatie op een enkele slide. Elk vierkant draagt drie verschillende volledige chromosoomverf sondes rechtstreeks gelabeld met verschillende gekleurde fluoro.
Vier onderzoekingen van een normale metafasecel in vierkant twee van het Octa CHRO-systeem tonen aan dat chromosomen 8 21 en 12 rood, groen en blauw zijn geverfd. Ze kunnen afzonderlijk worden gevisualiseerd met behulp van respectieve filters of gelijktijdig worden gevisualiseerd door middel van een DAPI Fitzy, Texas Red drievoudige filter. Deze chromosoombenadering is nuttig bij de detectie van abnormale cellen met leukemiespecifieke chromosoomtranslocatie en aneuploïdie.
Bijvoorbeeld, T 8 21 is een veelvoorkomende chromosoomtranslocatie bij acute myeloïde leukemie. Trisomie 21 3 kopieën van chromosoom 21 is een veelvoorkomende aneuploïdie bij leukemie Na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg geëffend voor wetenschappers op het gebied van moleculaire cytogenetica en moleculaire epidemiologie om de meest voorkomende chromosoomherschikkingen te onderzoeken die worden gedetecteerd in leukemie en lymfoom, en om selectieve ploïdie onder alle menselijke chromosomen te onderzoeken bij klinische patiënten of populaties die zijn blootgesteld aan toxische chemicaliën.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig kunt onderzoeken in een enkele hybridisatie op één slide door de Octo Chrome Fish-assay. En we definiëren dit als chromosomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe fluorescering in situ hybridisatie (FISH) methode, bekend als de Octa Chrome Fish assay. Het maakt de gelijktijdige onderzoeking van alle 24 menselijke chromosomen mogelijk in een enkele hybridisatie op één slide, met focus op chromosomale veranderingen geassocieerd met leukemie en lymfoom.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescering in situ hybridisatie (FISH)
- Chromosomale analyse
- Oncologie
Achtergrond
- FISH is een techniek die gebruikt wordt om de aan- of afwezigheid van specifieke DNA sequenties op chromosomen te detecteren en lokaliseren.
- Chromosomale translocaties zijn belangrijk in de studie van leukemie en lymfoom.
- De methode maakt een uitgebreide analyse van chromosomale veranderingen mogelijk.
- Vorige methoden vereisten meerdere hybridisaties, waardoor deze aanpak efficiënter is.
Doel van Studie
- Om een methode te ontwikkelen die de detectie van chromosomale afwijkingen vereenvoudigt.
- Om de efficiëntie van chromosomale analyse in klinische omgevingen te verbeteren.
- Om een tool te bieden voor een beter begrip van de genetische basis van hematologische maligniteiten.
Gebruikte Methoden
- Preparatie van metafase verspreidingen op een gespecialiseerde acht vierkante slide.
- Automatisch scannen van de slide om metafases voor analyse te lokaliseren.
- Hybridisatie van probes met behulp van het Octa Chrome apparaat.
- Visualisatie van resultaten die verschillende geverfde volledige chromosomen laten zien op basis van arrangementen.
Belangrijkste Resultaten
- De assay visualiseert succesvol alle 24 chromosomen in een enkele hybridisatie.
- Resultaten kunnen drie verschillende geverfde chromosomen in elk vierkant van de slide tonen.
- Maakt herbeoordeling van celbeelden voor een uitgebreide analyse mogelijk.
- Toont potentieel voor toepassing in menselijke populatiestudies.
Conclusies
- De Octa Chrome Fish assay vertegenwoordigt een significante vooruitgang in FISH methodologie.
- Deze methode kan de detectie van chromosomale afwijkingen in hematologische kankers verbeteren.
- Het biedt een efficiëntere aanpak voor onderzoekers en clinici.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
The OctoChrome-FISH assay enables simultaneous detection of numerical and structural chromosomal alterations across all 24 human chromosomes in a single hybridization, addressing a key bottleneck in cytogenetic analysis for hematological malignancies. By consolidating whole-genome screening into one slide-based workflow, it enhances throughput and reproducibility in leukemia and lymphoma research, supporting early target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. This capability improves predictive confidence in identifying translocation-driven oncogenes and aneuploidy patterns relevant to benzene-induced leukemogenesis and other toxicant exposures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing leukemia-specific translocations such as t(9;22), t(15;17), t(8;21), and t(14;18) in their native chromosomal context.
- Operational Value: Reduces need for multiple sequential FISH hybridizations, conserving samples and accelerating target confirmation in discovery biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing concurrent assessment of structural rearrangements and genome-wide aneuploidy, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromosomal systems for downstream screening by establishing baseline karyotypes and detecting background alteration rates in exposed populations.
- Operational Value: Standardizes cytogenetic readouts through consistent probe labeling and slide architecture, enhancing reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Scalability Value: Enables high-content analysis of metaphase spreads via automated scanning, facilitating reevaluation and longitudinal tracking of chromosomal stability in longitudinal toxicology studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing direct comparison of chromosomal alterations in cell models, patient samples, and population cohorts exposed to leukemogens like benzene.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed aneuploidies or translocations are random events or exposure-linked patterns, informing risk assessment in translational biomarker development.
- Continuity Value: Supports seamless transition from in vitro findings to in vivo relevance by maintaining chromosomal resolution across model systems and human specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling chromosomal analysis at early hypothesis testing stages and supporting lead identification through mechanistic de-risking of genomic instability.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of chromosomal mechanisms in leukemogenesis by allowing simultaneous screening for multiple known and novel alterations across the genome.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs (e.g., translocation frequency, aneuploidy rates) that allow comparison of compound or exposure effects across conditions.
- Analytics: Generates multiplexed fluorescence readouts compatible with automated imaging and software-assisted karyotyping, enabling objective comparison of chromosomal states.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human relevance by detecting identical chromosomal patterns in population studies, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable cytogenetic platform applicable across oncology, toxicology, and pharmacogenomics programs requiring chromosomal integrity assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through comprehensive chromosomal coverage.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility via standardized probe sets and slide format, minimizing inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by reducing reagent consumption and hands-on time compared to sequential FISH or SKY approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by providing early evidence of genomic stability or instability in lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cytogenetic preparation for accurate metaphase spread generation and signal interpretation.
- Dependent on access to the OctoChrome device and compatible hybridization chambers for multi-probe simultaneous delivery.
- Necessitates standardization of slide handling, denaturation, and washing protocols to ensure consistent probe penetration and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to non-human model systems may require revalidation of probe specificity and chromosomal painting efficiency.
- Practical limitations include reliance on metaphase-quality samples and potential signal overlap in highly rearranged genomes, requiring careful spectral unmixing.
