Name: Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Leer de Octa Chrome FISH-test om alle 24 menselijke chromosomen tegelijk te onderzoeken in één hybridisatie. Deze methode detecteert numerieke en structurele chromosoomafwijkingen bij leukemie en lymfoom efficiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Cliona M. McHale bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health subsidie ​​R01ES017452 naar L Zhang.

1. Voorbeeld prepareren <ul><li> OctoChrome FISH is ontworpen om chromosomale veranderingen in metafase spreads van menselijke cellen, inclusief onderzoeken maar niet beperkt tot gekweekte perifere bloedcellen, stam / progenitorcellen, en cellijnen. De monsters moeten worden bereid volgens de standaard procedure voor het oogsten van metafasen 3,11-13: door het gebruik van Colcemid behandeling om cellen te arresteren in metafase, hypotone behandeling aan cellen zwellen, en Carnoy&#39;s fixeermiddel aan cellen vast te stellen in suspensie bij ongeveer 0,5-1 x 10 6 cellen per ml. </li><li> Reinig de 8-vierkant dia (die in de OctoChrome Kit, Catalogus #: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, Verenigd Koninkrijk, figuur 2) door te dompelen in pure ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Alvorens het monster dia, drop a kleine hoeveelheid cellen op een dia aan het celdichtheid controleren. Als de cel dichtheid te hoog is (te veel overlappende cellen), vul de schorsing met verse fixeermiddel. Als de cel dichtheid te laag is (te weinig cels op dia), spin down van de cellen en opnieuw te schorten in een kleiner volume van verse fixeermiddel. Pipetteer 5-10 pi celsuspensie op elk van 8 gebieden van de template dia in een opeenvolging van afwisselend vierkanten 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Zodra de eerste twee vierkantjes luchtgedroogd, spotten de resterende vierkantjes op dezelfde wijze. Dit voorkomt de cel spreads van elkaar storen. </li><li> De gedroogde dia kan worden opgeslagen bij -20 ° C in stikstofatmosfeer voor groter dan 5 jaar voordat hybridisatie. </li></ul> 2. Lokalisatie van metafasen met behulp van een geautomatiseerd systeem <ul><li> Breng 20 ul van 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (0,2 ug / ml) naar het centrum van elke helft van de dia en bedekken met een dekglaasje. </li><li> Voer een automatische scan van het monster slide te lokaliseren de metafase cellen met behulp van Metafer software (MetaSystems, Altlussheim, Duitsland). Dit vergemakkelijkt de locatie van alle metafasen en toekomstige her-evaluatie van alle mobiele beelden. </li><li> Handmatig Bekijk de scanresultaten en de schrapping van niet-metafase artefacten. </li></ul> 3. Hybridisatie <ol><li> Voorbereiding van het monster glijbaan en OctoChrome apparaat </li><ul><li> Dompel de sample dia in 2x SSC buffer bij kamertemperatuur gedurende 30 min weg te wassen DAPI. </li><li> Dehydrateer het monster dia via een reeks ethanol wasbeurten (2 minuten elk in 70%, 85% en 100% ethanol), laten drogen en op een 37 ° C verwarmingsplaat gedurende 5 minuten plaatsen. </li><li> Plaats de Chromoprobe Multiprobe hybridisatie Kamer (die in de OctoChrome Kit) in een 37 ° C waterbad om de temperatuur tot 37 ° C (+ / - 1 ° C). </li><li> Meng de hybridisatie oplossing (verstrekt in de OctoChrome Kit) door herhaalde pipetteren en pre-warm een ​​25 pi aliquot per OctoChrome apparaat tot 37 ° C. </li><li> Pre-warme elk OctoChrome apparaat (die in de OctoChrome Kit, zie figuur 2) tot 37 ° C door het plaatsen van het apparaat label naar beneden op een kookplaat. Raak thij reliëf oppervlakken van het OctoChrome apparaat als ze bevatten de sondes. </li></ul><li> Positionering van het monster schuif het over het OctoChrome apparaat (figuur 2) </li><ul><li> Voeg 2 pl voorverwarmde hybridisatie oplossing voor elk van de acht gebieden op de voorverwarmde OctoChrome toestel terwijl het blijft bij 37 ° C. </li><li> Voorzichtig keren de sjabloon schuif het over het OctoChrome apparaat zodanig dat het nummer 1, dat nu staat op zijn kop, is gelegen over de top rechterhand gedeelte van de OctoChrome apparaat. Om u te helpen lokaliseren vierkant 1, heeft zijn positie op het apparaat is gemarkeerd in Orange. </li><li> Zorg ervoor dat de sjabloon slide zorgvuldig wordt afgestemd op de bijbehorende gebieden op de OctoChrome apparaat. Doe de schuif het over het OctoChrome apparaat, zodat de druppels van hybridisatie oplossing contact te maken met de dia. Zachte Toepassen zelfs druk te waarborgen dat de hybridisatie oplossing wordt uitbreiden tot de randen van elk van de verhoogde gebieden op de OctoChrome apparaat. </li><li> Tillende dia / OctoChrome voorzichtig houden van de mat uiteinde van de glazen dia en omkeren zodat de schuif is onder de OctoChrome apparaat. Zorg ervoor dat het apparaat geen uitstrijkje in de sjabloon dia als dit kan kruisbesmetting van de sondes. </li><li> Plaats op een 37 ° C (+ / - 1 ° C) kookplaat voor 10 minuten. </li></ul><li> Denaturatie </li><ul><li> Breng het monster dia / OctoChrome apparaat aan op de kookplaat, waarbij met name zorg om het niveau vast te houden. Zorg ervoor dat het monster glijbaan gelijkmatig contact op met de kookplaat. </li><li> Denatureren op de warmhoudplaat bij 75 ° C (+ / - 1 ° C) gedurende 5 minuten. </li></ul><li> Hybridisatie </li><ul><li> Plaats voorbeelddia / OctoChrome apparaat in de Chromoprobe Multiprobe Hybridisatie Kamer. </li><li> Plaats het deksel en drijven de kamer in de 37 ° C (+ / - 1 ° C) water bad (niet - roeren) &#39;s nachts. Let op: het deksel niet af te dichten op de kruising kamer, doe de deksel niet sluiten van het waterbad; NIET hybridiseren in eenincubator. Deze stappen zijn cruciaal voor het regelen van vochtigheid. </li></ul><li> Post-hybridisatie wasbeurten </li><ul><li> Voorbereiding van wasoplossingen Oplossing 1: Maak een Coplin / Hellendahl pot met 0.4x SSC. Equilibreer tot 72 ° C (+ / - 1 ° C) in een waterbad en de pH tot 7,0 passen. Oplossing 2: Maak een Coplin / Hellendahl pot met 2x SSC en 0,05% Tween 20. Laten staan ​​bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de OctoChrome apparaat uit de schuif en plaats de dia in Oplossing 1 voor 2 minuten. </li><li> Plaats de dia in Oplossing 2 gedurende 30 seconden. </li></ul></ol> 4. Montage en visualisatie van de resultaten <ul><li> Breng 20 ul van DAPI naar het centrum van elke helft van de dia en breng een dekglaasje. </li><li> Incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te kunnen bekijken met behulp van fluorescentie microscopie. </li></ul> 5. Representatieve resultaten Figure 3A toont een normale metafase cel in Plein 2. (1) - (3): Chromosomen 8, 21 en 12 werden geschilderd rood, groen en blauw, en worden gevisualiseerd door middel van een Texas Red, FITC en DEAC filter, respectievelijk (4): Visualisatie door middel van een DAPI / FITC / Texas Red triple filter. Over het algemeen, de chromosomen beschilderd met blauw zijn niet duidelijk door de drievoudige filter en moeten worden beschouwd onder de specifieke DEAC filter. Figuur 3B toont vertegenwoordiger abnormale cellen met leukemie-specifieke chromosomale translocatie en aneuploïdie. (1): t (8; 21), een gemeenschappelijke chromosomale translocatie in acute myeloïde leukemie; (2): trisomie 21, drie kopieën van chromosoom 21, een gemeenschappelijke aneuploidie in leukemie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig1.jpg" /> Figuur 1. Plaatsing van chromosoom combinaties op de OctoChrome apparaat en de verwachte chromosomale schilderen resultaten. <img alt="Figuur 2" src= &quot;/ Files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Positionering van het monster schuif het over het OctoChrome apparaat. Figuur 3. Vertegenwoordiger resultatenverkregen uit OctoChrome FISH (Plein 2). <img alt="Figuur 3A" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3A.jpg" /> Figuur 3A. Een normale cel met chromosomen 8, 12, 21 geschilderd in Plein 2. <img alt="Figuur 3B" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3B.jpg" /> Figuur 3B. Vertegenwoordiger van abnormale cellen met leukemie-specifieke chromosomale translocatie en aneuploidie in Plein 2.

<ol><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+chromosomal+aberrations+detected+in+humans+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene.</a> Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrations+in+chromosomes+associated+with+lymphoma+and+therapy-related+leukemia+in+benzene-exposed+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers.</a> Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+increases+aneuploidy+in+the+lymphocytes+of+exposed+workers%3A+a+comparison+of+data+obtained+by+fluorescence+in+situ+hybridization+in+interphase+and+metaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+aneusomy+and+long+arm+deletion+of+chromosomes+5+and+7+in+the+lymphocytes+of+Chinese+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene.</a> Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+translocations+and+aneusomy+in+chromosomes+8+and+21+among+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene.</a> Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+detection+of+chromosomal+aberrations+using+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping.</a> Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+aneuploidy+study+%28CWAS%29+in+workers+exposed+to+an+established+leukemogen%2C+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene.</a> Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).</li>
<li>Rowley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromosome+translocations+in+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The role of chromosome translocations in leukemogenesis.</a> Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+OctoChrome+fluorescence+in+situ+hybridization+to+detect+specific+aneuploidy+among+all+24+chromosomes+in+benzene-exposed+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers.</a> Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).</li>
<li>Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22In+The+ACT+cytogenetics+laboratory%22">In The ACT cytogenetics laboratory</a>. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).</li>
<li>Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+aneuploidy+of+chromosomes+1%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+9%2C+11%2C+12%2C+and+21+induced+by+the+benzene+metabolites+hydroquinone+and+benzenetriol%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol.</a> Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroquinone%2C+a+benzene+metabolite%2C+increases+the+level+of+aneusomy+of+chromosomes+7+and+8+in+human+CD34-positive+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells.</a> Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+benzene+health+effects+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Public.+Health%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding benzene health effects and susceptibility.</a> Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Deze roman OctoChrome-FISH-test maakt het mogelijk om tegelijkertijd alle 24 menselijke chromosomen te onderzoeken in een hybridisatie op een dia. De opstelling van chromosoom combinaties op de 8 pleinen is ontworpen om de identificatie van de non-random chromosoomherschikkingen in de meest voorkomende leukemieën en lymfomen vergemakkelijken. Zo kan de test gelijktijdig detecteren numerieke (aneuploidie) als structureel (translocaties) chromosoom veranderingen. De meest kritische stap in dit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td><tr><tr><td> OctoChrome Kit </td><td> Cytocell Ltd, Cambridge, Verenigd Koninkrijk </td><td> PMP 803 </td><td></td></tr><tr><td> fytohemagglutinine (PHA) </td><td> Invitrogen Corporation </td><td> 10576-015 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Invitrogen Corporation </td><td> 15212-012 </td><td></td></tr><tr><td> Carnoy&#39;s fixatief </td><td></td><td></td><td> Methanol: ijsazijn = 3: 1 </td></tr><tr><td> Fluorescentie microscope </td><td></td><td></td><td> Uitgerust met filters om DAPI, Texas Red, FITC, en cumarine spectra individueel en een DAPI / FITC / Texas Red triple filter te bekijken om tegelijkertijd te bekijken verschillende kleuren </td></tr><tr><td> Metafer software </td><td> MetaSystems, Altlussheim, Duitsland </td><td></td><td> Faciliteren van alle metafasen vinden en opnieuw te evalueren van de afwijkingen </td></tr></tbody></table>

chromosomics: detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman octochrome fish-test

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die het mogelijk maakt specifieke DNA-sequenties kunnen worden opgespoord op metafase of interfase chromosomen in celkernen 1. De techniek maakt gebruik van DNA-probes met unieke sequenties die hybridiseren met hele chromosomen of specifieke chromosomale regio&#39;s, en dient als een krachtige aanvulling op de klassieke cytogenetica. Bijvoorbeeld, veel eerdere studies meldde de frequente detectie van verhoogde chromosoomafwijkingen bij leukemie patiënten die verband houden met blootstelling aan benzeen, benzeen-vergiftiging patiënten en gezonde werknemers die worden blootgesteld aan benzeen, met behulp van klassieke cytogenetische analyse 2. Met behulp van FISH, hebben leukemie-specifieke chromosomale veranderingen waargenomen te worden verhoogd in ogenschijnlijk gezonde werknemers blootgesteld aan benzeen 3-6, met vermelding van de kritische rol van cytogentic veranderingen in benzeen geïnduceerde leukemie. Over het algemeen, een enkele FISH-test onderzoekt slechts een of een paar hele chromosomenof specifieke loci per dia, zodat meerdere kruisingen te worden uitgevoerd op meerdere dia&#39;s om alle menselijke chromosomen te dekken. Spectral karyotypering (SKY) maakt visualisatie van het hele genoom tegelijkertijd, maar de eis van speciale software en apparatuur beperkt de toepassing ervan 7. We beschrijven hier een nieuwe FISH-test, OctoChrome-vis, die kan worden toegepast voor Chromosomics, die we hier definiëren als de gelijktijdige analyse van alle 24 menselijke chromosomen op een dia in humane studies, zoals chromosoom-brede aneuploïdie studie (CWA&#39;s) 8. De basis van de methode, markt gebracht door Cytocell als de Chromoprobe Multiprobe System, is een OctoChrome apparaat dat verdeeld in 8 vierkanten, die elk draagt ​​drie verschillende heel chromosoom painting probes (Figuur 1). Elk van de drie probes rechtstreeks gelabeld met een verschillende gekleurde fluorofoor, groen (FITC), rood (Texas Red) en blauw (Cumarine). De opstelling van chromosoom combinaties op de OctoChrome toestel is ontworpen om de identificatie van de non-random structurele chromosoombeschadiging veranderingen (translocaties) gevonden in de meest voorkomende leukemieën en lymfomen vergemakkelijken, bijvoorbeeld t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Bovendien kan numerieke veranderingen (aneuploïdie) in chromosomen gelijktijdig worden gedetecteerd. De overeenkomstige template objectglaasje wordt ook verdeeld in 8 vierkanten waarop de metafase spreads gebonden zijn (figuur 2), en zich boven de OctoChrome apparaat. De probes en target DNA zijn gedenatureerd bij hoge-temperatuur en gehybridiseerd in een vochtige kamer, en vervolgens alle 24 menselijke chromosomen kunnen gelijktijdig gevisualiseerd. OctoChrome FISH is een veelbelovende techniek voor de klinische diagnose van leukemie en lymfoom en voor de detectie van aneuploïdieën in alle chromosomen. We hebben toegepast deze nieuwe Chromosomic aanpak in een CWA&#39;s studie van benzeen blootgestelde Chinese arbeiders 8,10.

Een nieuwe fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) methode die gelijktijdig onderzoekt zowel numerieke en structurele chromosoom veranderingen, name de specifieke chromosomale translocaties geassocieerd met leukemie en lymfoom, van alle 24 menselijke chromosomen op een enkel apparaat in een hybridisatie wordt beschreven.

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Fluorescence in situ hybridisatie (FISH) is een techniek waarmee specifieke DNA-sequenties kunnen worden gedetecteerd op metafase- of interfasechromosomen in cellen ...

De Octa Chrome Fish-assay onderzoekt gelijktijdig alle 24 menselijke chromosomen in een enkele hybridisatie op één objectglas. Bereid eerst metafase-spreidingen voor op het specifieke objectglas met acht vierkanten. Voer vervolgens een geautomatiseerde scan van het monsterglas uit om de lokalisatie van alle metafases en de toekomstige herevaluatie van alle celbeelden te vergemakkelijken.Plaats vervolgens het objectglas met acht vakken over het Octa chrome-apparaat en hybridiseer de probes. De verkregen resultaten kunnen drie verschillende geschilderde hele chromosomen in elk vak tonen, gebaseerd op de rangschikking van chromosoomcombinaties op het RO-apparaat. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze RO FISH-methode toen ik aan het begin van de jaren 90 FISH begon toe te passen in studies naar humane populaties.Vervolgens introduceerde ik mijn idee van drievoudige kleuringsschildering, acht vierkante coupes om de cel vast te leggen, tijdens de jaarlijkse A A CR-conferentie in 1994. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke chromosoombuiging en moderne spectrale prototyping, is dat het probleemloos alle 24 menselijke chromosomen in een groter aantal cellen kan analyseren. Begin met een preparaat van metafasecellen gefixeerd in suspensie als controle; breng een pipetdruppel cellen aan op een objectglas en controleer of de dichtheid passend is.Dip nu in acht vierkante OC-chroom en schuif dit gedurende twee minuten in zuivere ethanol. Verdeel vijf microliter celisuspensie in een reeks afwisselende vierkanten op de objectglasplaat om te voorkomen dat de celuitstrijkjes elkaar beïnvloeden. Laat de monsters aan de lucht drogen voordat de aangrenzende paren worden aangebracht.Breng 20 µL van 0,2 µg/mL DAPI-kleuring aan in het midden van elk half deel van het preparaat en plaats een dekglas. Voer nu een automatische scan van het monsterpreparaat uit om de metafasecellen te lokaliseren. Gebruik metaverse-software om de lokalisatie van alle metafasen en de toekomstige herbeoordeling van alle celbeelden te vergemakkelijken.Bekijk de scanresultaten handmatig en verwijder artefacten die geen metafasen zijn. Verwijder eerst de DPI-kleuring in twee XSSC-buffer en dehydrateer de monsters vervolgens via een reeks ethanolwasbeurten. Laat de slide aan de lucht drogen en plaats deze daarna vijf minuten op een warmteplaat van 37 °C.Equilibreer nu de chroma-probe, de hybridisatiekamer voor meerdere probes en de hybridisatiebuffer in een waterbad van 37 °C met de labelzijde naar beneden. Plaats het OC-chromato-apparaat op een warmteplaat van 37 °C. Voeg twee µL voorverwarmde hybridisatielosutie toe aan elk van de acht gebieden.Keer het template voorzichtig om en richt het correct uit. Schuif het over het OC chrome-apparaat. Verifieer dat het template-plaatje is uitgelijnd met het Octa Chrome-apparaat.Laat vervolgens het objectglas voorzichtig op de druppels hybridisatie-oplossing zakken en oefen een zachte, gelijkmatige druk uit om de hybridisatie-oplossing tot aan de randen van elk van de verhoogde gebieden op het OC-chroomapparaat te verspreiden. Til het objectglas op bij het gematteerde uiteinde en draai het om, zodat het objectglas zich onder het OC-chroomapparaat bevindt. Plaats dit gedurende 10 minuten op een warmteplaat van 37 degree Celsius.Plaats het vervolgens vijf minuten op een warmteplaat van 75 °C. Om de monsters te denatureren voor de hybridisatiestap, worden deze overgebracht naar een chroma probe multi-probe hybridisatiekamer. Plaats het deksel terug en laat de kamer gedurende de nacht drijven in het waterbad van 37 °C.Verwijder het objectglas voorzichtig uit het apparaat en was dit in 0.4 overmaat SC bij 72 °C gedurende twee minuten. Voer de tweede wasbeurt uit bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens 20 µL DPI toe aan het midden van elk halve deel van het objectglas en plaats een dekglas.Incubeer de monsters 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur voordat ze met fluorescentiemicroscopie worden bekeken. De Octa chrome fish assay maakt gelijktijdige examinatie van alle 24 menselijke chromosomen mogelijk met behulp van één enkele hybridisatie op één enkel objectglas. Elk vierkant bevat drie verschillende whole chromosome painting probes die direct zijn gelabeld met verschillende gekleurde fluoro.Onderzoek van een normale metafasecel in vierkant twee van het Octa CHRO-systeem laat zien dat chromosomen 8, 21 en 12 rood, groen en blauw zijn gekleurd. Ze kunnen individueel worden gevisualiseerd met de respectievelijke filters of gelijktijdig worden gevisualiseerd via een DAPI Fitzy, Texas Red triple filter. Deze chromosomale benadering is nuttig voor de detectie van abnormale cellen met leukemie-specifieke chromosomale translocaties en aneuploïdie.Bijvoorbeeld, T 8 21 is een veelvoorkomende chromosomale translocatie bij acute myeloïde leukemie. Trisomie 21 (3 kopieën van chromosoom 21) is een veelvoorkomende aneuploïdie bij leukemie na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor wetenschappers op het gebied van de moleculaire cytogenetica en moleculaire epidemiologie om de meest voorkomende chromosomale herschikkingen te onderzoeken die worden aangetroffen bij leukemie en lymfoom, en om selectieve ploidie te bestuderen onder alle menselijke chromosomen bij klinische patiënten of populaties die zijn blootgesteld aan toxische chemicaliën.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig in een enkele hybridisatie op één objectglas kunnen worden onderzocht met de Octo Chrome Fish-assay. En we definiëren dit als chromosomen.

chromosomics-detection-numerical-structural-alterations-all-24-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Spectral Karyotypering (SKY) is een geavanceerde cytogenetica techniek om genomische en chromosomale afwijkingen te identificeren. Deze techniek profiteert van chromosoom schilderkunst probes, waarmee indeling van alle chromosomen. SKY kan ook worden aangegeven complexe chromosoomafwijkingen en de segregatie defecten in muizen en mensen met diverse ziekten, waaronder polycystische nierziekte.

Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Er wordt een protocol beschreven voor de bereiding van hoogwaardige mitotische plantenchromosoomuitstrekkingen door een snelle luchtdroog-druppelmethode die geschikt is voor de FISH-detectie van enkele en hoge kopie-DNA-sondes.

Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken...

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Leer de Octa Chrome FISH-test om alle 24 menselijke chromosomen tegelijk te onderzoeken in één hybridisatie. Deze methode detecteert numerieke en structurele chromosoomafwijkingen bij leukemie en lymfoom efficiënt.

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test (Video) | JoVE Journal

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Meer video's verkennen