Productie van Weefsel Microarrays, Immunohistochemie vlekken en Digitalisering Binnen het menselijke eiwit Atlas

Het algemene doel van deze procedure is om gebruik te maken van een efficiënte methode om gelijktijdig informatie over eiwitexpressie uit meerdere weefsels te verkrijgen voor een high-throughput project, zoals de human protein atlas. Dit wordt bereikt door eerst representatieve gebieden van geformalineerde en in paraffine ingebedde weefsels te selecteren. Vervolgens worden de gemarkeerde gebieden uitgestanst en worden de geselecteerde kernen samengevoegd tot één enkel paraffineblok, een weefselmicroarray.

Vervolgens worden er secties uit de TMA gesneden en wordt immunohistochemie uitgevoerd. Ten slotte wordt het eiwitexpressiepatroon geanalyseerd en worden de gegevens gepubliceerd in de Human Protein Atlas. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de eiwitexpressie in weefsels en cellen aantonen via weefselmicroarrays en immunohistochemie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het uitvoeren van immunohistochemie vanuit enkelvoudige parenchymblokken van weefsel, is dat waardevol biologisch materiaal bespaard kan worden en de experimenten reproducebaarder zijn. Een ander voordeel van deze techniek is dat u kosten voor ENT kunt besparen, evenals de verwerkingstijd in het laboratorium. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Ian call Bay, een laboratoriumtechnicus uit mijn laboratorium, om een gestandaardiseerde lengte van de weefselkernen te verkrijgen.

Markeer de stylet. Het wordt aanbevolen om aan weerszijden van het paraffineblok marges van 2,5 tot 3,0 millimeter over te laten om te voorkomen dat de paraffine scheurt bij het plaatsen van de juiste ponsen. Draai de inbusbouten waarmee de pons is vastgezet los en positioneer de pons zodanig dat de groef in de ponshub stevig tegen de metalen staaf in het plastic V-blok rust.

Draai de schroeven vast en zorg ervoor dat de rand van de metalen clip horizontaal staat. Plaats de ontvangende pons links en de donorpons rechts. Gebruik de XY-instelknoppen en de bijbehorende digitale micrometer-uitlezingen om de ponsen langs de X- en Y-assen te bewegen.

Om de machine te resetten, druk op de zero a BS-knop om te schakelen tussen inches en millimeters, en druk op de inch-millimeter-knop. Bij gebruik van een pons van 1 mm voor een template van 9 bij 8 moet de ruimte tussen de gaten 2 mm zijn, gemeten tussen de middelpunten van de gaten; dit voorkomt dat de ontvangende pons te ver wordt naar beneden gedrukt en beschadigd raakt. Stel de maximale diepte voor het indrukken van de pons in door een lege cassette in de houder te plaatsen en met de dieptestopvijzel in de linkerbovenhoek van de Z-geleider de onderste positie van de ontvangende pons op 1 mm boven de bodem van de cassette in te stellen. Nadat het relevante gebied op een weefselcoupe is geselecteerd en gemarkeerd en een template voor de productie van een tissue microarray is ontworpen, plaatst u het ontvangende blok in de houder en draait u de schroeven vast met de kleinste schroevendraaier.

Voorkom dat de schroeven te strak worden aangedraaid om te voorkomen dat de paraffine loskomt van de cassette. Duw de ontvangende pons ongeveer vijf millimeter naar beneden in het ontvangende blok en gebruik de handgreep van de pons om deze heen en weer te draaien. Laat vervolgens de neerwaartse duwdruk langzaam los, zodat de veren de pons weer omhoog kunnen bewegen.

Gebruik de stylist om de pons te legen en gooi de paraffinekern weg. Verplaats vervolgens de revolver om over te schakelen naar de donorpons. Plaats daarna de donorblokhouder met het donorblok boven de houder van het recipientblok.

Gebruik een bijbehorende met hematoxyline en eosine gekleurde coupes waar het interessegebied is gemarkeerd om het weefsel te lokaliseren dat bemonsterd moet worden. Houd het donorblobje handmatig in positie met de linkerhand en duw de punch met de rechterhand. Duw niet op de stylus. De dieptestop blokkeert de beweging van de punch niet op de juiste positie voor het donorblobje, dus het is belangrijk om te stoppen met duwen zodra de tweede markering op de stylus zichtbaar is.

Draai de hendel van de pons eenmaal langzaam rond. Laat de neerwaartse druk los terwijl u het donordistributieblok op de donorblokbrug houdt. Verwijder de brug en het donordistributieblok.

Zorg ervoor dat de donorpons is uitgelijnd met het gat dat eerder is gemaakt. Pas de positie van de pons aan met behulp van de stelschroeven. Als de donorpons en het gat in het recipiëntenblok niet zijn uitgelijnd, druk dan de pons voorzichtig naar beneden totdat de punt de bovenkant van het gat in het recipiëntenblok bereikt.

Houd deze positie vast en gebruik de stylet om de weefselkern in het gat te legen. Het oppervlak van de kern moet gelijk liggen met het oppervlak van het blok. Beweeg het turret terug naar de ontvangende pons.

Ga met de XY-instelknoppen naar de volgende positie en herhaal het proces door een monster uit het ontvangstblok te ponsen totdat de array voltooid is. Om het ontvangstblok te verwijderen, worden de schroeven in de houder losgedraaid. Leg het blok met de voorkant naar beneden op een glazen objectglas dat op een geschikt rek is geplaatst en bak het blok 40 minuten bij 42 °C.

Haal de objectglasplaat en het blok uit de oven en maak het oppervlak van het blok vlak door voorzichtig over het objectglas te strijken. Plaats het blok met het objectglas gedurende 10 minuten op een koelplaat. Verwijder het objectglas van het blok.

Het blok is nu voltooid en klaar om in coupes te worden gesneden. Na het snijden volgt de kleuring en digitalisering van de tissue microarray met een antilichaam tegen het eiwit van belang. Zoek naar het eiwit in de Human Protein Atlas via de website www.proteinatlas.org.

Voer de naam van een eiwit van belang, het ensemble-id, het UniProt-toegangsnummer of de HGNC-naam in, bijvoorbeeld insuline. Klik op het eiwit van belang en scroll naar beneden naar de samenvatting van normaal weefsel en organen. Het overzicht toont de eiwitexpressie in de pancreas.

Klik op het tabblad 'More tissue data'. De weergave van normale weefsels, gesorteerd per orgaan, verschijnt in beeld.

Klik op de pancreas om de IHC-resultaten voor drie antilichamen gericht tegen hetzelfde eiwit te bekijken. Klik op een afbeelding om een afbeelding van de pancreas met een hoge resolutie te bekijken. In deze figuur worden voorbeelden van de kwaliteit van weefsel-microarrays getoond: een rechte en correct uitgelijnde array met voldoende ruimte tussen de rijen en kolommen en de rand van de paraffine. Hier staan sommige kernen te dicht bij de rand, wat waarschijnlijk leidt tot problemen tijdens het snijden.

Deze weefselmicroarray is te lang gebakken en is ingezakt omdat het juiste template ontbrak. Hier is een correct gesneden sectie met rechte en uitgelijnde kolommen gekleurd met hematoxiline en eosine. Een bot of vuil mesje kan leiden tot splijting, zoals hier getoond, of tot gecomprimeerde secties zoals deze.

Kiemcentrumcellen in lymfeklieren vertonen een optimaal getitreerd antilichaam, wat resulteert in een specifieke cytoplasmatische kleuring zonder achtergrond, zoals hier te zien is. Negatieve of zwakke kleuring wordt gevonden wanneer de concentratie van het primaire antilichaam te laag is of wanneer het doeleiwit niet aanwezig is in de immunogekleurde weefsels. Deze weefselcoupe is overgekleurd door een te hoge concentratie van het primaire antilichaam.

De donkere kleur bemoeilijkt het bepalen van de subcellulaire lokalisatie als gevolg van spill-over, kruisreactiviteit en fout-positieve resultaten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een tissue marker array produceert en hoe u deze gebruikt bij het analyseren van eiwitexpressie via immunohistochemie. Daarnaast zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de Human Protein Atlas kunt raadplegen voor eiwitexpressie in menselijke weefsels en cellen.