Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis: Ex vivo RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex
18 mei 2012
Om een snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen waarbij Ex vivo Elektroporatie van plasmiden co-expressie remmende RNA (RNAi) en GFP in muizen embryonale cortex. Dit protocol is vatbaar voor de studie van verschillende aspecten van de neurologische ontwikkeling, zoals neurogenese, neuronale migratie en neuronale morfogenese waaronder dendriet en axon uitgroei.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een snelle beoordeling van genfunctie in de ontwikkeling van de hersenschors uit te voeren met behulp van organotypische plakjes. Dit wordt bereikt door plasmiden, coex, die een remmende RNA en een GFP-marker introduceren in de murnale hersenschors. Korte elektrische stoten worden op de hersenen toegepast, waardoor het plasmide-DNA de neuronale voorlopercellen kan transfecteren.
Vervolgens worden de hersenen gedisseceerd, ingebed en gesneden om organotypische plakjes te produceren die ex vivo neuronale morfogenese kunnen ondergaan. De organotypische plakjes kunnen worden doorzocht op corticale neuronsubpopulaties met migratie- of morfologische defecten door direct observatie van de GFP-gelabelde cellen. Hallo, welkom in mijn lab aan de Brown University in de afdeling moleculaire biologie vandaag, Dr.Liza en twee studenten, Kat Zer en Mark Seba zullen de ex vivo elektroporatietechniek en organotypische plakjescultuur demonstreren, wat een zeer nuttige techniek is voor neurodevelopmentale studies.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in verschillende aspecten van neurodevelopment, waaronder neurogenese, neuronale migratie en neuronale morfogenese. Omdat deze analyse in een bijna benadering van de IBU-omgeving wordt gedaan, biedt het een goedkope en snelle alternatief voor het genereren van transgene of knockout-dieren voor genen met onbekende functie. Ten slotte, in vergelijking met in vivo elektro-operatietechnologie, is het succes van deze vivo elektro-operatie-experimenten niet afhankelijk van bekwame chirurgie, vaardigheidsontwikkeling, en kan worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en vaardigheid.
Nadat een zwanger vrouwelijk muis is geëuthanaseerd, worden de embryo's in ijskou, volledige HBSS gedissecteerd, waarbij ze in hun individuele placentazakjes worden gehouden. Vervolgens in de koude HBSS-oplossing, laat een embryo los van de zak en snijdt het hoofd af na de eerste wervel voor een injectie, plaats het hoofd op een stuk paraformpapier bovenop een petrischaal met behulp van een op maat gemaakte Hamilton-spuit. Injecteer zes tot acht microliters van DNA fast green mix door de derde ventrikel.
Van daaruit zal de mix beide laterale ventrikels in de corticale blaasjes vullen. Voor elektroporatie worden BTX tweezer platina elektroden gebruikt. Plaats de positieve elektrode naar de zijkant van de cortex die zal worden geëlektroporeerd.
De elektrode moet bijvoorbeeld bovenop het hoofd zijn voor de dorsale cortex. Voor hoge transfectie-efficiëntie, pas altijd de concentratie van DNA aan tot één microgram per microliter en gebruik DNA geïsoleerd uit een Maxi prep. Gebruik indien nodig een endotoxine-vrij kit om het DNA na de elektroporatie te zuiveren.
Incubeer het hoofd gedurende minimaal vijf minuten voordat het wordt gedissecteerd. Het is erg belangrijk om de juiste hoeveelheid elektrische pulsen en stroom te gebruiken bij het uitvoeren van de elektroporatie om schade aan de jongere embryonale hersenen te voorkomen. Na de elektroporatie wordt het weefsel erg kwetsbaar.
Het is belangrijk om de dissecties heel voorzichtig te doen, omdat de huid en de school aan de meninges van de corticale blaasjes kunnen trekken, en dit kan de corticale blaasjes beschadigen wanneer ze uit de schedel worden verwijderd. Na vijf minuten, dissecteer de hersenen in koud HBSS, begin met het maken van een kleine insnijding aan de zijkant van het hoofd en verwijder de huid van de zijkanten van het hoofd.
Vervolgens, met fijne pincetten, pel voorzichtig de pia van de hersenen. Verwijder de intacte hersenen uit de schedel. Wanneer klaar, houd de hersenen in ijskou HBSS en bereid je voor om het weefsel in te bedden.
Begin de mallen te vullen met 3% laag smeltpunt. Agros. Plaats de mallen op ijs zodat de agros bijna onderaan de mal zal stollen. Zorg ervoor dat de hersenen ondersteund en gecentreerd blijven.
Nu met fijne pincetten, verwijder voorzichtig een hersen van de HBSS, absorbeer overtollig buffer met een kim-wipe of filterpapier, en zet de hersen in de laag smeltpunt. Agros. Gebruik vervolgens een pipettip om de hersen in de mal te draaien om de contact tussen agros en weefsel te maximaliseren. Met alle hersenen overgebracht, plaats elke hersen in ongeveer dezelfde oriëntatie en diepte binnen zijn mal.
De aros zal in ongeveer vijf minuten stollen. Dus werk snel. Laat de aros volledig stollen door nog vijf minuten op ijs te incuberen.
Trim overtollig aros voordat u de blokken monteert. Bevestig vervolgens de agros-blokken aan elkaar met behulp van een snel bindende plastic kleefstof, elke hersen in een stapel moet worden gepositioneerd met zijn reuklobben omhoog. Zodra de blokken zijn bevestigd, trim de aros om ervoor te zorgen dat elke hersen zal worden gesneden door de vibrato.
Dompel ze dan onmiddellijk onder in ijskou HBSS. Om de blokken te snijden, stel de vibratos-snelheid in op een lage snelheid, ongeveer de helft van de maximum, en stel de trillingsfrequentie van de mes op de hoogste instelling. Genereer vervolgens 250 micron dikke coronale plakken, haal plakken op met een gebogen fijne spatel en draag ze over naar weefselputten met een fijne borstel of pincet.
Als het weefsel uit de agros valt, is de weefsel-agros-contact niet voldoende gevormd in een weefselcultuurkap, bereid een zes-puttenplaat voor met 1,8 milliliters van plakjescultuurmedium per put, en plaats organotypische invoegcodes van laminine poli-lysine in elk. We voegen 500 microliters van plakjescultuurmedium toe aan de bovenkant van de organotypische plakjesinvoegcodes. Breng vervolgens maximaal vijf plakken over naar elke invoegcode.
Verwijder vervolgens eventueel overtollig medium van de bovenkant van de plakken Om ervoor te zorgen dat de plakken hun morfologie zoveel mogelijk behouden en minimale celdood hebben. Het is belangrijk dat een gezonde lucht-vloeistof-interface wordt gehandhaafd en dat de plakken niet in het medium drijven. Ten slotte, incubeer de plakken bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator.
Vervang elke andere dag de helft van het volume van het medium onder het me
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het beoordelen van genfunctie in de ontwikkeling van de hersenschors door middel van ex vivo elektroporatie. Door plasmiden te gebruiken die remmend RNA en GFP co-expresseren, kunnen onderzoekers neurodevelopmentele processen zoals neurogenese en neuronale migratie onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neuro-ontwikkeling
- Genetica
Achtergrond
- De hersenschors is cruciaal voor verschillende hersenfuncties.
- Het begrijpen van genfunctie is essentieel voor inzichten in neuro-ontwikkeling.
- Ex vivo technieken staan een gedetailleerde studie van neuronaal gedrag toe.
- Elektroporatie is een methode die wordt gebruikt om DNA in cellen te introduceren.
Doel van het onderzoek
- Om genfunctie snel te beoordelen in de ontwikkeling van de hersenschors.
- Om neurogenese, neuronale migratie en morfogenese te onderzoeken.
- Om organotypische plakjes te gebruiken voor het observeren van neuronale veranderingen.
Gebruikte methoden
- Ex vivo elektroporatie van plasmiden in muis-embryonaal cortex.
- Toepassing van korte elektrische stoten om transfectie te vergemakkelijken.
- Dissectie en inbedding van hersenen om organotypische plakjes te maken.
- Observatie van GFP-gelabelde cellen om neuronale defecten te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van neuronale progenitorcellen met plasmiden.
- Identificatie van corticale neuron subpopulaties met defecten.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van ex vivo technieken in neuro-ontwikkeling.
- Visuele bevestiging van neuronale morfogenese door middel van GFP-labeling.
Conclusies
- De methode biedt een snelle benadering om genfunctie te bestuderen.
- Ex vivo elektroporatie is effectief voor neurodevelopmenteel onderzoek.
- De verkregen inzichten kunnen de begrip van corticale ontwikkeling informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
