Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:

Het algemene doel van het volgende experiment is om een snelle beoordeling van de genfunctie bij de ontwikkeling van de cerebrale cortex uit te voeren met behulp van organotypische coupes. Dit wordt bereikt door plasmiden, die een inhiberend RNA en een GFP-marker tot expressie brengen, te introduceren in de cerebrale cortex van de muis. Korte elektrische pulsen worden op de hersenen toegepast, waardoor het plasmide-DNA de neuronale progenitorcellen kan transfecteren.

Vervolgens worden de hersenen gedissecteerd, ingebed en gesneden om organotypische coupes te produceren waarin neuronale morfogenese ex vivo kan plaatsvinden. In de organotypische coupes kan worden gezocht naar subpopulaties van corticale neuronen met migratie- of morfologische defecten door de GFP-gelabelde cellen direct te observeren. Hallo, welkom in mijn laboratorium bij de afdeling moleculaire biologie van Brown University; vandaag zullen dr. Liza en twee studenten, Kat Zer en Mark Seba, de ex vivo electroporatietechniek en organotypische coupecultuur demonstreren, een zeer nuttige techniek voor neurodevelopmentele studies.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over verschillende aspecten van de neuro-ontwikkeling, waaronder neurogenese, neuronale migratie en neuronale morfogenese. Omdat deze analyse wordt uitgevoerd in een benadering van de IBU-omgeving, biedt het een goedkoop en snel alternatief voor het genereren van transgene of knockout-dieren voor genen met een onbekende functie. Ten slotte, in vergelijking met in vivo elektroporatie-technologie, is het succes van deze vivo elektroporatie-experimenten niet afhankelijk van deskundige chirurgie of uitgebreide vaardigheidsontwikkeling, en kunnen ze worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en minder specialistische vaardigheden.

Na het euthanaseren van een drachtige vrouwelijke muis, worden de embryo's gedisseceerd in ijskoud, compleet HBSS, waarbij ze in hun individuele vliezen worden bewaard. Laat vervolgens in de koude HBSS-oplossing een embryo uit het vlies ontsnappen en snijd de kop af achter de eerste wervel voor een injectie; plaats de kop op een stuk paraformpapier bovenop een Petri-schaal met behulp van een speciaal gemaakte Hamilton-spuit. Injecteer zes tot acht µL DNA fast green mix via de derde ventrikel.

Vanaf daar zal het mengsel beide zijventrikels in de corticale blaasjes vullen. Voor electroporatie worden BTX-pincetelektroden van platina gebruikt. Plaats de positieve elektrode aan de zijde van de cortex die geëlectroporeerd zal worden.

Voorbeeld: voor de dorsale cortex moet de elektrode boven op het hoofd worden geplaatst. Voor een hoge transfectie-efficiëntie dient de DNA-concentratie altijd te worden aangepast naar 1 µg per µL en moet DNA worden gebruikt dat is geïsoleerd via een Maxi prep. Gebruik indien nodig een endotoxine-vrije kit om het DNA na de electroporatie te zuiveren.

Incubeer de kop ten minste vijf minuten op ijs voordat u deze dissekeert. Het is zeer belangrijk om de juiste hoeveelheid elektrische pulsen en stroom te gebruiken tijdens de elektroporatie om beschadiging van de jongere embryonale hersenen te voorkomen. Na de elektroporatie wordt het weefsel zeer fragiel.

Het is belangrijk om de dissecties zeer zorgvuldig uit te voeren, aangezien de huid en het schedelbot aan de hersenvliezen van de corticale blaasjes kunnen trekken, wat schade aan de corticale blaasjes kan veroorzaken bij het verwijderen uit de schedel. Ontleed na vijf minuten de hersenen in koud HBSS door te beginnen met een kleine incisie aan de zijkant van de kop en de huid van de zijkanten van de kop af te pellen.

Pel vervolgens met een fijne pincet voorzichtig de pia van de hersenen af. Verwijder de intacte hersenen uit de schedel. Bewaar de hersenen na afloop in ijskoud HBSS en bereid de weefselinkapseling voor.

Begin met het vullen van de mallen met 3% laagsmeltende agarose. Plaats de mallen op ijs zodat de agarose onderin de mal stolt. Zorg hierbij eerst dat de hersenen ondersteund blijven en gecentreerd zijn.

Verwijder nu met een fijne pincet voorzichtig een brein uit de HBSS, absorbeer het overtollige buffervloeistof met een Kimwipe of filterpapier en plaats het brein in de laagtesmeltende agarose. Gebruik vervolgens een pipetpunt om het brein in de mal te draaien, zodat het contact tussen de agarose en het weefsel wordt gemaximaliseerd. Zodra alle breinen zijn overgeplaatst, positioneert u elk brein in ongeveer dezelfde oriëntatie en op dezelfde diepte binnen de mal.

De agarose zal in ongeveer vijf minuten stollen. Werk daarom snel. Laat de agarose volledig stollen door deze nog eens vijf minuten op ijs te incuberen.

Trim overschotten van het agar voordat de blokken worden gemonteerd. Bevestig vervolgens de agarblokken aan elkaar met een snelbindende plasticlijm; elk brein in een stapel moet zo worden geplaatst dat de olfactory bulbs naar boven wijzen. Zodra de blokken zijn bevestigd, trimt u de agar om ervoor te zorgen dat elk brein door de vibraatom is gesneden.

Dompel ze vervolgens onmiddellijk onder in ijskoud HBSS. Om de blokken te snijden, stelt u de snelheid van de vibrato in op een lage snelheid, ongeveer de helft van het maximum, en stelt u de vibratiefrequentie van het mes in op de hoogste stand. Maak vervolgens coronale coupes van 250 micron dik, haal de coupes op met een gebogen fijne spatel en breng ze over naar de weefselputjes met een fijn penseel of een pincet.

Als het weefsel uit de agros valt, was het contact tussen het weefsel en de agros in de weefselkweekkap niet voldoende gevormd; bereid in dat geval een zes-wells plaat voor met 1,8 milliliter slice-kweekmedium per well en plaats in elke well organotypische inserts gecoat met laminine en polylysine. Voeg 500 microliter slice-kweekmedium toe aan de bovenkant van de organotypische slice-inserts. Verplaats vervolgens maximaal vijf slices naar elke insert.

Verwijder vervolgens alle overtollige media van de bovenkant van de coupes om ervoor te zorgen dat de coupes hun morfologie zoveel mogelijk behouden en er minimale celdood optreedt. Het is belangrijk dat een gezonde vloeistof-luchtgrensvlak wordt gehandhaafd en dat de coupes niet in de media drijven. Incubeer de coupes tot slot bij 37 °C in een bevochtigde incubator.

Vervang om de dag heen de helft van het mediumvolume onder het membraan. De coupes mogen niet op het medium drijven. Neuronen die de geëlectroporeerde constructen tot expressie brengen, kunnen al vanaf acht uur na electroporatie worden gevisualiseerd. Fixeer na het gewenste aantal culturedagen de coupes in het membraan voor analyse.

Was elk organisch typisch insert vijf minuten met warme PBS. Voer in totaal drie PBS-wassingen uit en fixeer het weefsel vervolgens gedurende één uur bij vier graden celsius met 4%paraform aldehyde. Na fixatie kunnen de weefsels worden geanalyseerd met cellulaire markers of eenvoudig worden gekleurd met hooks-kleuring. Was de coupes na een uur drie keer gedurende 10 minuten met one XPBS.

Maak de coupes vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur permeabel in een 10% geiten-serumoplossing in 1X PBS onder zachte schudding. Kleur de weefsels daarna gedurende één uur bij kamertemperatuur met hooks onder zachte schudding. Verwijder de kleuring door drie keer 10 minuten te wassen in 1X PBS onder zachte schudding terwijl u wacht.

Plaats gematteerde objectglazen in een waterbad dat diep genoeg is om de weefsels te onderdompelen nadat ze op de glazen zijn geplaatst. Om de coupes te monteren: snijd eerst het membraan los met een scalpel.

Ten tweede worden met een fijne pincet tot vijf membraangebonden coupes overgebracht naar elke objectglas dat in water is ondergedompeld. Ten derde wordt eventueel overtollig water van elk objectglas verwijderd. Ten vierde wordt een druppel montagevloeistof op elke breincoupe aangebracht.

Plaats tot slot voorzichtig een dekglas op de plakjes en verwijder eventuele luchtbellen. De plakjes zijn vervolgens klaar voor microscopie, afhankelijk van de hoeveelheid ge-electroporeerd DNA en het embryonale stadium. Er is geconstateerd dat de transfectie-efficiëntie bij electroporatie varieerde.

Acht uur na transfectie met een P-silencer, begonnen de GFP-vectorcellen GFP te tot expressie te brengen. Tijdens een langere kweekperiode doorlopen de cellen een normale opeenvolging van neurogene gebeurtenissen, waaronder proliferatie, migratie en vroege neuronale differentiatie. Deze coupes behielden hun morfologie gedurende vijf dagen, mits de lucht-mediuminterface tijdens deze procedure goed werd onderhouden.

Het is belangrijk om het gehele experiment, vanaf het moment van euthanasie van het dier tot het moment waarop de coupes in de membraaninserts worden geplaatst, binnen twee uur uit te voeren om celsterfte na deze procedure te minimaliseren. Andere stappen, zoals het toevoegen van exogene factoren aan de organotypische lyse, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals: wat is de rol van verschillende groeifactoren of farmacologische agentia in de diverse neurodevelopmentale mechanismen?