Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster

Het algemene doel van deze procedure is om de neuronale activiteit via calcium-imaging te monitoren, gelijktijdig met de observatie van het voedingsgedrag. Dit wordt bereikt door eerst een vlieg in het apparaat voor vliegen te plaatsen. Vervolgens wordt de kop van de vlieg gedissekeerd om de hersenen bloot te leggen.

Het apparaat met de gedissekeerde vlieg wordt vervolgens op de objecttafel van de microscoop geplaatst. De laatste stap van de procedure is de stimulatie van de proboscis met een suikerstrookje. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de activering van een geïdentificeerd neuron tonen via calcium-imaging, gecorreleerd aan de extensie van de proboscis door middel van videoregistratie van het gedrag.

Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik nadacht over de ogen van klopbevers die op het wateroppervlak zwemmen. Wij bevers hebben gespleten ogen en kunnen zowel boven als onder het wateroppervlak zien. Een lastig punt van mijn experiment is dat de hersenen en de SCU's dicht bij elkaar liggen, maar als ze netjes gescheiden zijn zoals de ogen van ons bevers, kunnen we de SCU's droog houden terwijl de hersenen in de satelliet zijn blootgesteld.

Hier heb ik een zeer eenvoudige scheidingswand vlak boven de SCU's gemaakt om de droge zijde te scheiden van de natte plek. Vorm een platform van het deksel van een 35 millimeter falcon-schaal door de zijwand te smelten en deze uit te snijden om een passende hoek en dikte te verkrijgen. Boor een gat in het platform waar de kop van de vlieg in past, zodanig dat de monddelen vrij toegankelijk zijn aan de buitenkant van de kamer. Snijd het uiteinde van een pipetpunt net breed genoeg af om het lichaam van de vlieg op te vangen, en lijm de punt vervolgens aan het platform.

Laat een volwassen vlieg 24 uur vasten bij 25 °C. Anestheseer de vlieg door deze met een pincet in een plastic buisje van 15 ml te plaatsen, die op ijs staat. Plaats de vlieg in de kamer voor vliegen en duw de vlieg voorzichtig naar binnen totdat deze zich niet meer kan bewegen.

Dicht de omliggende delen van de proximale proboscis of rostrum af tegen de binnenrand van het gat door een kleine hoeveelheid lichtuithardende lijm aan de zijkanten en boven het rostrum aan te brengen, waarbij een wimperharnas of een soortgelijk instrument wordt gebruikt om de lijm voorzichtig te verspreiden. Breng de lijm daarnaast vanuit de binnenkant van de vliegen aan in de ruimte tussen het dorsale deel van de kop en de binnenrand van het gat. Hard vervolgens de lijm uit met de zwakste blauwe lichtintensiteit die voldoende is voor uitharding om beschadiging van de vlieg te voorkomen.

Om de kop van de vlieg te stabiliseren en het ventrale deel van de SOG bloot te leggen, wordt een draad bevestigd om het rostrum gedeeltelijk omhoog te houden. Wanneer de vlieg is gepositioneerd, wordt het oppervlak van het platform gevuld met sucrosevrije zoutoplossing. Open de kopcapsule met een wolfraammesje en pincetten met scherpe punten (die wij de scherpe pincetten noemen) om de SOG bloot te leggen.

Scis zips. Dit is een demonstratie van scis zips, waarbij ter vergelijking een vezel uit een Kim wipe wordt geknipt. Dit wordt eerst uitgevoerd met irisscharen in het gezichtsveld, en vervolgens voor een gegradueerde liniaal van één millimeter.

Maak eerst met het wolfraammesje een incisie door de posterieure rand. Snijd vervolgens door de zijrand en de anterieure rand met de aangescherpte pincet. Til het uitgesneden stukje nagelriem met de pincet op en verwijder dit.

Knip de antennes en de antenvenerven door met de pincet. Verwijder vervolgens selectief de luchtzakken tussen de SOG en de cuticula om de hersenen te stabiliseren en bewegingsartefacten te voorkomen. Knip daarna de slokdarm door aan het uiteinde richting de farynx en aan het uiteinde dat de SOG ingaat, om zo de verbinding tussen de farynx en de hersenen te verbreken.

Identificeer en verwijder vervolgens spier 16 en scheid elke trachea die de hersenen met de cuticula verbindt. Plaats de vliegen op de tafel van een spinning disc confocale microscoop en schakel over naar de waterimmersielens voor beeldvorming. Neem vervolgens een enkele optische sectie op vier hertz met een belichtingstijd van 122 milliseconden, gebruikmakend van een excitatielaser van 491 nanometer gericht op het gebied van interesse.

Gebruik een spuitnaald met een klein stukje Japans rijstpapier dat uit de punt steekt om sucrose aan de vlieg aan te bieden. Breng een kleine druppel sucrose-oplossing aan op het papier en zuig deze vervolgens op met een injector die via een flexibele slang aan de naald is verbonden, waarbij een joystick-manipulator wordt gebruikt om de naald vast te houden.

Breng de geweekte watig papierlont kortstondig aan op de punt van de probs. Dit is om verzadiging te voorkomen. Monitor de extensierespons van de PROBUS of het gedrag van de PER met een CCD-camera die is bevestigd aan een dissectiemicroscoop, gelijktijdig met calcium-imaging, en zorg ervoor dat de gegevens binnen één uur na dissectie worden verzameld.

Hier wordt een typische respons van de proboscis-extensie getoond op stimulatie met een WIC die 100 millimolar sucrose bevat. De waterige oplossing is geïmageerd met een 491 nanometer laser voor G CAMP fluorescentie. Simultane calcium-imaging tijdens het gedrag van de proboscis-extensierespons, hier getoond eerst vóór en daarna na stimulatie, maakt de visualisatie mogelijk van sucrose-geïnduceerde GAMP 3.0 responsen in het motorneuron voor de protractor-rostrumspier.

In de kwantificering van de toestandsgrafiek laat de sucrose-geïnduceerde GAMP 3.0-respons zien dat de motorneuronen reageren op een sucrosestimulus met een scherpe toename in fluorescentie, gevolgd door een herstelfase van enkele seconden terug naar de basislijn. Het platform voor vliegen maakt andere methoden mogelijk, zoals elektrofysiologie, optogenetica, psychogenetica of chemische activatie van neuronen, of TimeLapse-labimaging van GFP-gelabelde structuren, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de correlatie tussen synaptische plasticiteit en geheugen.