Name: Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Leer calciumbeeldvorming van neuronen en eetgedrag bij Drosophila melanogaster tegelijkertijd monitoren. Deze methode koppelt neurale activiteit aan de proboscis-extensierespons voor inzicht in voedingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ik dank L Watanabe, M Gorczyca en andere leden van de Yoshihara lab voor nuttige opmerkingen en discussie. Ik dank K. Scott en L. Looger voor het vliegvissen voorraden, S Yokoyama voor het aantonen van experimenten, Shinya Iguchi voor technische hulp, en Nobuko Yoshihara voor materiaal informatie. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Mental Health Grants MH85958, en de Worcester Stichting MY

1. De bouw van de VLIEGEN <ol><li> Vorm een platform van het deksel van 35 mm Falcon schaal door het smelten van de zijwand en snijwerk dat het een juiste hoek en de dikte (Figuur 1a; figuur 2) te vormen. Boor een gat in het platform om de vlieg kop (figuur 1a, b), zodanig dat de mondstukken vrij worden blootgesteld aan de buitenzijde van de kamer (figuur 1a) accepteren. Snij het einde van een Pipetman tip met de grootte overeenkomt met de vlieg te worden genomen. Lijm de tip om het platform, zoals aangegeven in figuur 1a om de vliegen (figuur 2) te voltooien. </li></ol> 2. Voorbereiden van de Fly voor observatie <ol><li> Verhonger volwassen vlieg gedurende 24 uur bij 25 ° C voorafgaand aan het experiment door het in een flesje met slechts een vochtige tissue indien uithongering noodzakelijk. </li><li> Verdoof de vlieg door het in een 15 ml plastic buis staande op ijs. </li><li> Met behulp van een tang, plaatst u een vlieg in de kamer van deVLIEGEN, en duw de vlieg in totdat het niet in staat is om te bewegen. Vervolgens plaatst u een stekker op de vlieg te behouden. (Figuur 1a, b). </li><li> Sluit de aangrenzende delen van het proximale snuit (snuit) aan de binnenrand van de opening, toepassen een kleine hoeveelheid licht uithardende lijm (Tetric EvoFlow) aan de zijkanten en boven het podium van buitenaf (pijlen in figuur 3). Ook de lijm vanuit de binnenkant van de VLIEGEN de ruimte tussen de rug van de kop en de binnenrand van de opening (figuur 1b). Om het rostrum tot aan vrij bewegen, moet erop worden gelet dat de lijm te voorkomen dat het aanraken van het podium met behulp van een wimper (of iets vergelijkbaars) om de lijm te verspreiden. Tot slot, genezen de lijm met de zwakste verlichting van blauw licht voldoende is voor de genezing om te voorkomen dat schade aan de vlieg tegen overmatige hitte. Haal de stekker. </li><li> Een thread op het podium gedeeltelijk heeft opgeheven (pijl in figuur 3) in het bezit kunnen worden gebruikt om de vlieg te stabiliseren &#39;s hoofd door het vermijden van bump van de faryngeale deel aan SOG en het ventrale deel van de SOG bloot te leggen, in het bijzonder voor de beeldvorming presynaptische terminals van Gr5a neuronen 8, die worden gedekt door een deel van de keelholte als de proboscis volledig is ingetrokken. </li><li> Vul het oppervlak van het platform met suikervrije zoutoplossing bevattende (in mM) NaCl, 140, KCl, 2, MgCl2, 4,5, CaCl2 1,5 en HEPES-NaOH, 5 met een pH van 7,1 10. Deze sucrose-vrije zoutoplossing heeft dezelfde tonus met die van veelgebruikte suikerhoudende Salines, zoals HL3.1 11. </li><li> Open het hoofd capsule met een wolfraam mes en een tang met geslepen tips, zoals een schaar, dat is een op maat gemaakt apparaat en oorspronkelijk ontworpen door Dr Kageyuki Yamaoka, Japan, om de cuticula en de luchtpijp clip om de SOG (figuur 4) bloot te leggen. De ventrale van de kop cuticula werd doorgesneden ventrale mogelijk dat de dorsale zijde snede niet zo kritisch. Maak eerst een incisie door deachterste rand van het gebruik van een wolfraam mes. Daarna dwars door de zijkant en de voorste randen met behulp van de geslepen tang. De cut cuticula stuk moet worden opgeheven met de tang en verwijderd. Antennes en antennaal zenuwen moeten worden gesneden door de geslepen tang. </li><li> Om bewegingsartefacten voorkomen tijdens opnames, moet de hersenen worden gestabiliseerd door de verwijdering van bepaalde delen van de vlucht. Ten eerste, selectief verwijderen van luchtzakjes tussen de SOG en de cuticula. Snij de slokdarm op het einde naar de keelholte en aan het einde gaat de SOG de verbinding tussen de keelholte en de hersenen verwijderd. Dan trek Muscle 16 12, en ten slotte, los een luchtpijp het aansluiten van de hersenen en de cuticula. </li><li> Wij hebben onze VLIEGEN ingesteld op het podium van een Olympus BX51WI microscoop aangesloten op een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision in PerkinElmer) (figuur 5). Een onderdompeling in water lens, bijvoorbeeld 40X/0.8 NA, werd ondergedompeld in het bad (Figuur 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + beeldvorming van de hersenen <ol><li> Ca 2 + beeldvorming met GCaMP3.0 1, 9 werd uitgevoerd door de werkwijze die door Marella et al.. 8 (fig. 6). Met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop (Improvision), neem een ​​enkele optische sectie op 4Hz met een belichtingstijd van 122ms gebruik van 491nm laser excitatie, met de nadruk op de regio van belang (een cel lichaam van een motor neuron, of een interneuron, of presynaptische terminals van smaak sensorische neuronen) met Velocity software, Ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. Het stimuleren van de Proboscis <ol><li> Zuig 100 mM waterige oplossing sucrose in een hypodermische naald met kleine kous (gemaakt van Japanse Washi papier zie tabel specifieke reagentia) uitsteekt vanaf het uiteinde (Figuur 7). </li><li> Kwijting een kleine daling van sucrose oplossing op de pit, dan zuig het, onmiddellijk before de toepassing van de geweekte Washi papier lont aan het uiteinde van de slurf. De Washi papier lont mag alleen worden toegepast voor een moment om verzadiging (figuur 8) te voorkomen. Controleer de Proboscis Extension Response (PER) gedrag met behulp van een CCD-camera bevestigd aan een dissectie microscoop (figuur 5) gelijktijdig met Ca 2 + beeldvorming. De gegevens moeten worden genomen binnen een uur na aanvang van de dissectie, omdat de PER reactie niet gehandhaafd blijft meer dan een uur onder deze omstandigheden. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Motor neuronen van het rostrum gradenboog, een paar belangrijke spieren die verantwoordelijk zijn voor het opheffen van het podium voor de proboscis uitbreiding, is gemeld dat deze robuuste reacties op zoete prikkels 13 tonen. Figuur 9 toont Ca 2 +-signalen via GCaMP3.0 1, 9 uitgedrukt in een Gal 4-stuurprogramma, E49 13, uit een cellichaam van het motorneuron. Zoals getoond in de video een Robust PER waargenomen synchroon met een toename van Ca 2 + signaal. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van de Fly hersenen Live-Imaging and Elektrofysiologie Stage (vliegen). A wordt de VLIEGEN vervaardigd dat de hoek van de muur kan het vlieg hoofd rechte komen. Drie segmenten van de vlieg proboscis zijn kleurcode, het podium is magenta. De vlieg wordt in de kamer met een pincet, en een stuk gesneden uit het einde van een Pipetman tip is aangesloten op de achterkant van de kamer naar de vlieg te blokkeren ontsnappen. B, is het gat geboord om te voldoen aan het hoofd van de vlieg. De overige gaten zijn afgedicht met licht-uithardende lijm, zoals aangegeven ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Nadat de lijm is uitgehard, wordt de Pipetman tip als een plug verwijderd. Saline wordt gegoten in de VLIEGEN zodanig dat het oppervlak van de hersenen geheel bedekt. Er moet worden gegarandeerd dat er geen zout lekIng uit op het voorste einde van de vlieg hoofd. Het gearceerde gebied omgeven door de stippellijn in paneel b toont het deel ontleed uit. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figuur 2. Foto van de vliegen. De halvemaanvormige wand van lijm (van een lijmpistool) wordt de stroom van zoutoplossing bij perfusie te controleren en de hoeveelheid zoutoplossing gebruikt verminderen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figuur 3. Vooraanzicht van een vlieg gemonteerd in de vliegen. Dit plaatje laat zien hoe een vlieg is ingesteld in de vliegen, en hoe de licht-uithardende lijm wordt aangebracht rond het hoofd van de vlieg (pijlen) om een zout-proof afdichting te creëren. Als een zoutoplossing lekken tot en met de slurf van de vlieg, dan is het experiment mislukken. De draad (pijlen) bevestigd aan de fase is de snuit in positie, zodat het niet volledig uittrekken<html> Ted. Anders zou het belemmeren van de meer ventrale deel van de SOG en veroorzaken bewegingsartefacten. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figuur 4. Top-view of the Flies met een ontleed vlieg. Dit beeld toont de blootgestelde SOG van een vlieg volgende nagelriemen te verwijderen. De slokdarm, luchtpijp spier 16 en verbonden met de hersenen, en geselecteerde lucht zakken ook zijn verwijderd te verstoort de hersenen, wat kan leiden tot artefacten in de calcium signalen. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figuur 5. De bewakingsinrichting. Deze inrichting is opgebouwd uit een Olympus microscoop BX51WI aan een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision) en een zijkant gemonteerde Nikon SMZ800 microscoop. Deze opzet maakt het mogelijk om live-beeldvorming van de hersenactiviteit tijdens PER gedrag. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6. Foto de zijaanzicht van de vliegen vertonen. De dunne laag zoutoplossing wordt ingeklemd tussen de 40X water ondergedompeld lens en de vlieg. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figuur 7. Schema voor het maken van de Washi papier lont. Gampi-Washi papier is een traditioneel Japans perkament, dat is extreem dun en glad (Haibara, Japan). Het is ook zeer sterk en kan steeds een grote hoeveelheid vloeistof. De Washi papier moet worden gesneden een trapezium met zeer bepaalde afmetingen, 0,3 mm en 0,7 mm breedte en 4-5 mm (a). Deze trapeziumvormige wordt ingebracht vanaf de 0,7 mm kant in het uiteinde van een 23 G injectienaald en kunnen ook gestabiliseerd door toevoeging van een insect pen, die gebogen is een V-vorm (b). C de Washi papier wordt transparant na blootstellingtot een vloeistof, waardoor het ideaal is voor dit experiment. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figuur 8. Stimulatie van de proboscis op de vliegen met de Washi-lont. De Washi papier lont aan het uiteinde van een injectienaald wordt toegepast voor een moment met behulp van een joystick manipulator met een hand. De naald is via een slang naar een injector gemanipuleerd met de andere kant, voor opzuigen en afvoeren sucrose-oplossing. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figuur 9. Representatieve resultaten. a, PER gedrag opgenomen via de CCD-camera geïnstalleerd op de stereomicroscoop. Vooraanzichten van een uitgehongerde vlieg met een uitgebreide slurf (pijlen) voor de stimulatie van de stimulatie en na stimulatie met een koord 100 mM sucrose waterige oplossing (pijlpunt). De verlichting wordt bereikt door een 491 nm laser gebruiktvoor GCaMP fluorescentie. b, sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 respons in de motor neuron voor de gradenboog van het rostrum spier in het uitgehongerde toestand. Het bovenste paneel voor het stimuleren; het bodempaneel, onmiddellijk na de stimulatie. Schaal bar, 10 pm. C, Kwantificering van de sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 reactie. De motor neuron reageert op een sucrose stimulans door een sterke toename van de fluorescentie, gevolgd door een herstel fase van enkele seconden aan de basislijn.

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li>
<li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li>
<li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22Hungry+Fly%22">Hungry Fly</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+Extension+Response+%28PER%29+Assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li>
<li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).</li>
<li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Ik heb niets te onthullen.</p

De VLIEGEN maakt gelijktijdig opnemen van Ca2 +-signalen en PER gedrag. Zelfs met de hersenen blootgesteld aan fysiologische zoutoplossing normale PER gedrag waargenomen. Met behulp van de Gampi-Washi pit in plaats van een Kimwipe lont gebruikt in de originele capillaire method7 maakt een zeer reproduceerbare en stabiele PER gedrag en voorkomt de noodzaak om ervaren te worden in het maken en het kiezen van een goede Kimwipe lont. De experimentele uiteinden bovengenoemde konden we succes verstoringen door beweging van de snuit, waardoor een zeer stabiele opname van Ca2 + signalen met een lage ruis. Af en toe weefsel verwijderen was niet voldoende om cellen bloot te leggen of voldoende te onderdrukken beweging, wat leidt tot slechte resultaten. Wanneer we echter bekwaam waren, meer dan 80% van de voorbereiding goede resultaten opgeleverd. Deze methode is niet alleen voor Ca2 + imaging, maar kan ook worden aangepast aan elke beeldvormende levende inachtneming PER gedrag. Zo kunnen we toegang krijgen tot een van de cellen door middel van deGebruik van een elektrode om rechtstreeks activiteit. In combinatie met twee foton excitatie microscopie, kunnen we tijdsverloop beeldvorming synaptische structuur, die kan worden gerelateerd aan gedragsveranderingen voeren. Daarom is deze methode van beeldvorming van de hersenen met een gedragsobservatie is niet alleen waardevol voor de functionele ontleding van het neuronale netwerk, maar kan worden gebruikt als een krachtig hulpmiddel om synaptische plasticiteit 14 correleren met de mechanismen achter geheugen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de apparatuur / Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Licht-uithardbare lijm </td></tr><tr><td> BX51WI Microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td> Met 40X (NA 0,8) onderdompeling in water objectief </td></tr><tr><td> Spinning disk confocale microscoop systeem </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Met 491 nm laser </td></tr><tr><td> Stereomicroscoop </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Aan een zwenkarm. Stereo uitzicht is nog steeds beschikbaar met video-opname </td></tr><tr><td> Gampi-Washi papier </td><td> Haibara, Japan </td><td></td><td> Een speciaal soort traditioneel Japans papier </td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixels SONY CCD </td></tr><tr><td> Joystick manipulator </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Injector </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

gelijktijdig opnemen van calcium signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de drosophila melanogaster</em

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Om neuronale netwerken te bestuderen in termen van hun functie in het gedrag, moeten we analyseren hoe neuronen werken wanneer elke gedragspatroon wordt gegenereerd. Zo gelijktijdige opnames van neuronale activiteit en gedrag zijn essentieel om hersenactiviteit te correleren met gedrag. Voor dergelijke gedrags-analyses, de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, laat ons toe om genetisch gecodeerd calcium indicatoren zoals GCaMP 1 te nemen, teneinde neuronale activiteit te controleren, en om geavanceerde genetische manipulaties te gebruiken voor optogenetic of thermogenetic technieken om specifiek te activeren geïdentificeerde neuronen 2-5. Het gebruik van een thermogenetic techniek heeft geleid tot kritische neuronen voor eetgedrag (Flood et al.., Wordt herzien) te vinden. Als een belangrijk onderdeel van voedingsgedrag, een Drosophila volwassen breidt zijn snuit voor de voeding van 6 (proboscis uitbreiding reactie; PER), als antwoord op een zoete prikkel van zintuigcellen op zijn snuit of tarsi. Combining het protocol voor PER 7 met een calcium-beeldvormende techniek 8 met behulp van GCaMP3.0 1, 9, ik heb opgericht een experimenteel systeem, waar we de activiteit van neuronen te volgen in het voedingscentrum - de suboesophageal ganglion (SOG), gelijktijdig met gedragsobservatie van de slurf. Intussen heb ik een apparaat (&quot;Fly hersenen Live-Imaging en Elektrofysiologie Stage&quot;: &quot;VLIEGEN&quot;) om een Drosophila volwassen tegemoet te komen, waardoor de slurf zich vrij te bewegen terwijl de hersenen worden blootgesteld aan het bad voor Ca 2 + beeldvorming door middel van een onderdompeling in water lens . De vliegen is ook geschikt voor vele soorten levende experimenten op fly hersenen, zoals elektrofysiologische opname of time lapse beeldvorming van synaptische morfologie. Omdat de resultaten van live-beelden kunnen direct worden gecorreleerd met de gelijktijdige PER gedrag, kan deze methodiek een uitstekend experimenteel systeem om informatie te verwerken van neuronale netwerken te bestuderen, en hoe dit cellular activiteit is gekoppeld met kunststof processen geheugen.

De fruitvlieg,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Haar slurf voor het voeden, het reageren op een stimulus suiker uit zijn slurf of voetwortel. Ik heb samen opmerkingen van de proboscis extensie respons (PER) met een calcium beeldvormende techniek, waardoor we de activiteit van neuronen in de hersenen gelijktijdig te volgen, met gedragsobservatie.

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster</em

Om neuronale netwerken te bestuderen in termen van hun functie bij gedrag, moeten we analyseren hoe neuronen functioneren wanneer elk gedragspatroon wordt gegenereerd. Daarom...

Het algemene doel van deze procedure is om de neuronale activiteit via calcium-imaging te monitoren, gelijktijdig met de observatie van het voedingsgedrag. Dit wordt bereikt door eerst een vlieg in het apparaat voor vliegen te plaatsen. Vervolgens wordt de kop van de vlieg gedissekeerd om de hersenen bloot te leggen.Het apparaat met de gedissekeerde vlieg wordt vervolgens op de objecttafel van de microscoop geplaatst. De laatste stap van de procedure is de stimulatie van de proboscis met een suikerstrookje. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de activering van een geïdentificeerd neuron tonen via calcium-imaging, gecorreleerd aan de extensie van de proboscis door middel van videoregistratie van het gedrag.Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik nadacht over de ogen van klopbevers die op het wateroppervlak zwemmen. Wij bevers hebben gespleten ogen en kunnen zowel boven als onder het wateroppervlak zien. Een lastig punt van mijn experiment is dat de hersenen en de SCU's dicht bij elkaar liggen, maar als ze netjes gescheiden zijn zoals de ogen van ons bevers, kunnen we de SCU's droog houden terwijl de hersenen in de satelliet zijn blootgesteld.Hier heb ik een zeer eenvoudige scheidingswand vlak boven de SCU's gemaakt om de droge zijde te scheiden van de natte plek. Vorm een platform van het deksel van een 35 millimeter falcon-schaal door de zijwand te smelten en deze uit te snijden om een passende hoek en dikte te verkrijgen. Boor een gat in het platform waar de kop van de vlieg in past, zodanig dat de monddelen vrij toegankelijk zijn aan de buitenkant van de kamer. Snijd het uiteinde van een pipetpunt net breed genoeg af om het lichaam van de vlieg op te vangen, en lijm de punt vervolgens aan het platform.Laat een volwassen vlieg 24 uur vasten bij 25 °C. Anestheseer de vlieg door deze met een pincet in een plastic buisje van 15 ml te plaatsen, die op ijs staat. Plaats de vlieg in de kamer voor vliegen en duw de vlieg voorzichtig naar binnen totdat deze zich niet meer kan bewegen.Dicht de omliggende delen van de proximale proboscis of rostrum af tegen de binnenrand van het gat door een kleine hoeveelheid lichtuithardende lijm aan de zijkanten en boven het rostrum aan te brengen, waarbij een wimperharnas of een soortgelijk instrument wordt gebruikt om de lijm voorzichtig te verspreiden. Breng de lijm daarnaast vanuit de binnenkant van de vliegen aan in de ruimte tussen het dorsale deel van de kop en de binnenrand van het gat. Hard vervolgens de lijm uit met de zwakste blauwe lichtintensiteit die voldoende is voor uitharding om beschadiging van de vlieg te voorkomen.Om de kop van de vlieg te stabiliseren en het ventrale deel van de SOG bloot te leggen, wordt een draad bevestigd om het rostrum gedeeltelijk omhoog te houden. Wanneer de vlieg is gepositioneerd, wordt het oppervlak van het platform gevuld met sucrosevrije zoutoplossing. Open de kopcapsule met een wolfraammesje en pincetten met scherpe punten (die wij de scherpe pincetten noemen) om de SOG bloot te leggen.Scis zips. Dit is een demonstratie van scis zips, waarbij ter vergelijking een vezel uit een Kim wipe wordt geknipt. Dit wordt eerst uitgevoerd met irisscharen in het gezichtsveld, en vervolgens voor een gegradueerde liniaal van één millimeter.Maak eerst met het wolfraammesje een incisie door de posterieure rand. Snijd vervolgens door de zijrand en de anterieure rand met de aangescherpte pincet. Til het uitgesneden stukje nagelriem met de pincet op en verwijder dit.Knip de antennes en de antenvenerven door met de pincet. Verwijder vervolgens selectief de luchtzakken tussen de SOG en de cuticula om de hersenen te stabiliseren en bewegingsartefacten te voorkomen. Knip daarna de slokdarm door aan het uiteinde richting de farynx en aan het uiteinde dat de SOG ingaat, om zo de verbinding tussen de farynx en de hersenen te verbreken.Identificeer en verwijder vervolgens spier 16 en scheid elke trachea die de hersenen met de cuticula verbindt. Plaats de vliegen op de tafel van een spinning disc confocale microscoop en schakel over naar de waterimmersielens voor beeldvorming. Neem vervolgens een enkele optische sectie op vier hertz met een belichtingstijd van 122 milliseconden, gebruikmakend van een excitatielaser van 491 nanometer gericht op het gebied van interesse.Gebruik een spuitnaald met een klein stukje Japans rijstpapier dat uit de punt steekt om sucrose aan de vlieg aan te bieden. Breng een kleine druppel sucrose-oplossing aan op het papier en zuig deze vervolgens op met een injector die via een flexibele slang aan de naald is verbonden, waarbij een joystick-manipulator wordt gebruikt om de naald vast te houden.Breng de geweekte watig papierlont kortstondig aan op de punt van de probs. Dit is om verzadiging te voorkomen. Monitor de extensierespons van de PROBUS of het gedrag van de PER met een CCD-camera die is bevestigd aan een dissectiemicroscoop, gelijktijdig met calcium-imaging, en zorg ervoor dat de gegevens binnen één uur na dissectie worden verzameld.Hier wordt een typische respons van de proboscis-extensie getoond op stimulatie met een WIC die 100 millimolar sucrose bevat. De waterige oplossing is geïmageerd met een 491 nanometer laser voor G CAMP fluorescentie. Simultane calcium-imaging tijdens het gedrag van de proboscis-extensierespons, hier getoond eerst vóór en daarna na stimulatie, maakt de visualisatie mogelijk van sucrose-geïnduceerde GAMP 3.0 responsen in het motorneuron voor de protractor-rostrumspier.In de kwantificering van de toestandsgrafiek laat de sucrose-geïnduceerde GAMP 3.0-respons zien dat de motorneuronen reageren op een sucrosestimulus met een scherpe toename in fluorescentie, gevolgd door een herstelfase van enkele seconden terug naar de basislijn. Het platform voor vliegen maakt andere methoden mogelijk, zoals elektrofysiologie, optogenetica, psychogenetica of chemische activatie van neuronen, of TimeLapse-labimaging van GFP-gelabelde structuren, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de correlatie tussen synaptische plasticiteit en geheugen.

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.

Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol voor ex vivo calciumbeeldvorming bij volwassen Drosophila met GCaMP6-expressie om epileptiforme activiteiten te monitoren. Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van ictale gebeurtenissen bij volwassen Drosophila door middel van ex vivo calciumbeeldvorming, waardoor de mogelijke mechanismen van epilepsie op cellulair niveau kunnen worden onderzocht.

Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie

Leer calciumbeeldvorming van neuronen en eetgedrag bij Drosophila melanogaster tegelijkertijd monitoren. Deze methode koppelt neurale activiteit aan de proboscis-extensierespons voor inzicht in voedingsmechanismen.

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen