Name: Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Leer een GMP-conforme methode om virus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten te produceren uit navelstrengbloed. Deze techniek genereert CTL die meerdere virale antigenen herkennen voor klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Dan L. Duncan collaboratief onderzoek subsidie ​​(CMB en EJS), het National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), een leukemie en lymfoom Society Clinical Research Scholar Award (CMB), en het National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).

1. Mononucleaire cellen Isolatie (dag 0) <ol><li> Plaats spike van vrouwelijke luer adapter in uitlaatpoort van de 20% fractie van de navelstrengbloed, sluit spuit en verwijder bloed. Overdracht ontdooid bloed 20 ml verwarmd RPMI in 50 ml centrifugebuis. Spoel navelstrengbloed zakje met 5 ml RPMI en transfer naar dezelfde centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g. Aspireren supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 20 ml warm RPMI. Laag cellen op 15 ml Lymphoprep in 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer 40 minuten bij 400 x g. </li><li> Oogst de interface met de mononucleaire cellen en was in 20 ml RPMI. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 450 x g. </li><li> Aspireren supernatant en was in 20 ml RPMI. Tel cellen en draaien gedurende 5 minuten bij 400 x g. </li><li> Aspireren supernatant en resuspendeer cellen bij 5 x 10 6 mononucleaire cellen / ml Cellgenix DC media (serumvrij). Verwijder 1 mL voor EBV-LCL generatie en in 15 ml centrifuge buis. </li></ol> 2. Dendritische Cel Generation (beginnend op dag 0) <ol><li> Plaat 2 ml cellen (reeds bij 5 x 10 6 cellen / ml media DC) per putje in een 6-well plaat. Laat in de broedstoof gedurende 1-2 uur. </li><li> Na 1-2 uur, wassen van de niet-hechtende cellen door wassen 3-4 keer met PBS. Verzamel de niet-hechtende cellen en bevriezen. Voeg 2 ml / putje DC media met 1000 U / ml IL-4 en 800 U / ml GM-CSF. </li><li> 3-4 dagen na aanvang DC, vul de IL-4 en GM-CSF door toevoeging van 100 ul / putje van media met een eindconcentratie van 1000U/mL IL-4 en 800 U / ml GM-CSF. </li><li> Op dag 5-6, oogst de DC door schrapen de put met een transfer pipet. Tel de grote cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Aspiraat media en resuspendeer DC op 2x10 6 cellen / ml DC media. 0,5 ml / putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Transduceren de DC met de Ad5f35pp65 vector bij een MOI van 10 per cel infectieuze eenheden. Voeg vector aan elk putje in een 24-well plaat. Incubeer cellen gedurende 1,5 uur. Na 1,5 uur voeg 1,5 ml / putje DC media bevattende: 1000 U / ml IL-4, 800 U / ml GM-CSF, 10 ng / ml TNF-alfa, 1 ug / ml PGE-1, 100 ng / mL IL-6 en 10 ng / mL IL-1beta. Deze cytokines rijpen de DC&#39;s. </li></ol> 3. Genereren van EBV-LCL (op dag 0) <ol><li> Centrifugeer de buis met het 5 x 10 6 mononucleaire cellen. Voeg 200 ul geconcentreerd EBV B95.8 supernatant en 1,8 ml compleet medium (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutamine) bevattende cyclosporine (1 ug / ml). </li><li> Aliquot 100 ui cellen in 10 putjes van een 96-wells plaat en 200 pl in 5 putjes. Voeg 100 ui compleet medium + cyclosporine de putjes die slechts 100 ul cellen. Vul overige wells met steriel water. </li><li> Voer de LCL wekelijks en uit te breiden van een 96-wells plaat met een 24-well plaat na ~ 2 weken. Na een week, naar een T25 fles en in de daaropvolgende overdracht naar weekeen T75 kolf. In dit stadium is het aanbevolen dat je porties van LCL bevriezen. Het duurt meestal 1 maand tot het genereren van voldoende aantallen LCL. </li></ol> 4. CTL Initiation - 7 dagen na aanvang van DCs <ol><li> Oogst DCs en bestralen bij 30 Gy. Was 4 x en tellen. Resuspendeer DC in T cell media humaan serum (45% RPMI, 45% CLICK&#39;s, 10% menselijk serum, 2 mM L-glutamine) @ 1 x 10 5 DC / mL. </li><li> Ontdooien niet-hechtende cellen van stap 2.2. Was de cellen, en tellen. Resuspendeer bij 2 x 10 6 niet-hechtende cellen / ml in T cel media die humaan serum. Voeg 10 ng / mL IL-7 en IL-12, en 5 ng / mL IL-15. Voeg 1 ml cellen per putje in een 24-well plaat. Voeg 1 ml per well DC. Vul lege putten van 24-well plaat met steriel water. </li><li> 7 dagen na T cel initiatie, voeding en / of splitsing van de cellen met T-cel medium dat menselijk serum. </li><li> 9-12 dagen na T-cel initiatie, bevriezing van de T-cellen tot de LCL klaar zijn. </li><li> ONCE LCL zijn uitgebreid en worden gepasseerd in T75 flessen, transduceren de LCL door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 400 x g. Voeg de vector aan de celpellet bij een MOI van 100 infectieuze eenheden per cel. Incubeer gedurende 1,5 uur. Na 1,5 uur, resuspendeer in compleet medium met 5 x 10 5 LCL / ml en voeg 2 ml per well in een 24-well plaat 12. </li><li> Na 2 dagen, de oogst van het LCL en bestralen bij 40 Gy. Was 4 x en tellen. Resuspendeer de LCL in T cell media humaan serum van 2,5 x 10 5 cellen / ml. Voeg 1 ml LCL per putje van een plaat met 24 putjes. Ook voeg 5 x 10 6 LCL een Grex40 cultuur apparaat en 5 ng / mL IL-15 13. </li><li> Oogst de T-cellen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 xg, zuig de supernatant en resuspendeer in T cell media humaan serum bij 1 x 10 6 T cellen / ml. Voeg 5 ng / ml IL-15 en voeg 1 ml / putje van T-cellen (totaal 1 x 10 6 cellen T) aan de LCL die reeds in de 24-well plaat. In de Grex40, brengde totale media tot 30 ml. </li><li> Op dag 3-4 na stimulatie, wanneer de cellen confluent vervolgens splitsen (in de plaat) 1:1 door vers medium dat 50 U / ml IL-2. Als ze niet confluent dan gewoon zuigen ½ media en vervangen door medium dat 50 U / ml IL-2. In de Grex40, zuigen helft van het medium vervangen met vers medium en voeg 50 U / ml IL-2. </li><li> Op dag 7, herhaalt in stap 4.6, maar met IL-2 op de dag van de stimulatie niet IL-15. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een schema van de GMP-compliant FDA goedgekeurde productie protocol is weergegeven in figuur 1. Het proces duurt ongeveer 50 dagen. Typische methoden voor het opwekken virus-specifieke T-cellen vergroten bestaande geheugen T-cellen, maar navelstrengbloed mist virus-ervaren T-cellen en daarom moeten prime naïeve T-cellen. Hiervoor gebruiken we dendritische cellen en de cytokines IL-7, IL-12 en IL-15,nodig voor het genereren van virale specificiteit. Na 3 stimulaties, moet de opbrengst meer dan 100x10 6 cellen. Als er voldoende cellen zijn niet beschikbaar zijn, kunnen extra stimulaties worden uitgevoerd totdat het gewenste aantal CTL&#39;s zijn beschikbaar. De meerderheid van deze cellen moeten CD3 + met een mengsel van CD4 + en CD8 + T cellen. Er moet minder dan 15% NK cellen (CD3-/CD56 +) en minder dan 1% CD19 + B-cellen (figuur 2). De geëxpandeerde CTL herkent de antigen pp65 van CMV, hexon en penton van adenovirus, evenals talrijke EBV-antigenen die tot expressie komen op EBV-LCL. Wanneer getest in een ELISPOT assay, CTL zouden afscheiden meer IFN-? in antwoord op deze antigenen dan irrelevante antigenen (figuur 3). De CTL ook lyseren virale peptide gepulste doelwitten PHA ontploffing. In een 51Cr-afgifte assay moet CTL lysis LCL, CMVpp65-gepulseerde en Adenovirus-en /of penton-gepulseerde doelen maar niet doelstellingen gepulseerd met irrelevant peptiden (Figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Figuur 1."/> Figuur 1. Generatie multi-virus-specifieke CTL uit navelstrengbloed. Schematische weergave het gehele proces van CTL vervaardiging uit navelstrengbloed. Eerst het navelstrengbloed mononucleaire cellen worden geïsoleerd uit de 20% fractie van de gefractioneerde navelstrengbloed unit. Met uitzondering van 5x10 6 cellen die opgeslagen worden voor LCL generatie, alle cellen vervolgens uitgeplaat in dendritische cel media gedurende 1-2 uur, waarna de niet-hechtende cellen worden geoogst en ingevroren. De DC DC Vervolgens wordt aan media die IL-4 en GM-CSF. Na 5 dagen kweken worden de DC gerijpt en getransduceerd met een adenovirale vector die het immunodominante CMV pp65 antigen. Bij aanvang worden deze DC gecombineerd met de niet-hechtende cellen en de cytokines IL-7, IL-12,en IL-15. Bij daaropvolgende stimuleringen wordt dezelfde adenovirale vector die voor EBV-LCL, die worden gebruikt als antigeen presenterende cellen te transduceren. IL-15 wordt gebruikt bij de tweede stimulatie en daarna IL-2. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Figuur 2."/> Figuur 2. Fenotype van de resulterende T-cellen. Getoond wordt het percentage levende cellen in de lymfocytpoort. CTL zijn CD3 + en CD4 + of CD8 + maar grotendeels CD3-/CD56- en CD19-. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Figuur 3."/> Figuur 3. T-cel functie. T-cel specificiteit werd getest door IFN-γELISPOT. T-cellen werden gepulseerd met overlappende peptiden die de gehele eiwit van hexon, penton, pp65 en irrelevant antigen IE-1. CTL alleen staat voor media die alleen. Autologe LCL werden bestraald en toegevoegd aan 1x10 5 / goed. Afgebeeld is de gemiddelde plek die cel cedrag van drievoudige putjes. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Figuur 4."/> Figuur 4. Cytolytische activiteit van CTL. Het vermogen van de resulterende CTL om doelen expressie virale antigenen lyseren werd getest in een 51Cr assay. 51Cr-gelabelde autologe PHA ontploffing werden gepulseerd met overlappende peptiden die de gehele antigen of 51 Cr-gemerkte autologe LCL werden gekweekt samen met CTL. Na 4 uur werd gamma release geteld op een gammateller.

<ol><li>Kennedy-Nasser, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+outcome+of+alternative+donor+and+matched+sibling+donor+hematopoietic+stem+cell+transplant+for+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+in+first+or+second+remission+using+alemtuzumab+in+a+myeloablative+conditioning+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+clinical+outcomes+using+adoptively+transferred+immune+cells+from+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood.</a> Cytotherapy. 12, 713(2010).</li>
<li>Szabolcs, P., Cairo, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrelated+umbilical+cord+blood+transplantation+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution.</a> Semin. Hematol. 47, 22(2010).</li>
<li>Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+response+of+naive+lymphocytes+from+cord+blood+to+primary+activation+via+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR.</a> J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).</li>
<li>Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).</li>
<li>Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+viral+immunity+in+immunodeficient+humans+by+the+adoptive+transfer+of+T+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones.</a> Science. 257, 238(1992).</li>
<li>O'Reilly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+antigen-specific+T-cells+of+donor+type+for+immunotherapy+of+viral+infections+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants.</a> Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).</li>
<li>Peggs, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapy+for+early+cytomegalovirus+infection+after+allogeneic+stem-cell+transplantation+with+virus-specific+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines.</a> Lancet. 362, 1375-1375 (2003).</li>
<li>Sili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+dendritic+cell-primed+polyclonal+human+cytotoxic+T-lymphocyte+lines+using+lymphoblastoid+cell+lines+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy.</a> J. Immunother. 26, 241(2003).</li>
<li>Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice-grade+cytotoxic+T+lymphocytes+specific+for+latent+membrane+proteins+%28LMP%29-1+and+LMP2+for+patients+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma.</a> Cytotherapy. 13, 518(2011).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+virus-specific+T+cells+that+target+CMV%2C+adenovirus%2C+and+EBV+can+be+expanded+from+naive+T-cell+populations+in+cord+blood+and+will+target+a+range+of+viral+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes.</a> Blood. 114, 1958(1958).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus%2C+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li>
<li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent%2Ftreat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. (51), e2736(2011).</li>
<li>Mori, T., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+infection%2Fdisease+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Int. J. Hematol. 91, 588(2010).</li>
<li>Einsele, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916(2002).</li>
<li>Bao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+cytomegalovirus+pp65+and+IE-1+specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+cytomegalovirus-specific+immunotherapy+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156(2008).</li>
<li>Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cord+blood+transplant+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel cord blood transplant therapies.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex.</a> J. Immunother. 33, 305(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Huidige strategieën gericht op de beheersing virale infecties na CBT kan effectief zijn, maar ze geassocieerd met significante toxiciteit, zijn duur en niet verlenen langdurende bescherming tegen infectie later. In feite kan het gebruik van een aantal antivirale middelen beperkt de groei van virus-specifieke T-cellen die anders beschermende 14. Een andere mogelijkheid is de infusie van donor afgeleide virus-specifieke T cellen. Wij en anderen hebben aangetoond dat T cellen Hier veilige, effectieve en re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC media </td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA (Instructies&#39;s Medium) </td><td> Irvine Scientific </td><td> 9195 </td></tr><tr><td> Human Serum </td><td> Tweeling Bio Products </td><td> 100 tot 110 </td></tr><tr><td> Zuurstofdoorlatende Cultureware 18 </td><td> Wilson-Wolf </td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Chiron (TCH Apotheek) </td><td></td></tr><tr><td> IL-12 </td><td> NCI / CTEP </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 </td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> R &amp; D- </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1beta </td><td> R &amp; D- </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> CelGenix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH Apotheek </td><td></td></tr><tr><td> IL-4 </td><td> R &amp; D- </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-alpha </td><td> R &amp; D- </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM CAGT Vector Production Facility </td><td></td></tr><tr><td> Plasma overdracht set met vrouwelijke luer adapter </td><td> Charter Medical </td><td> 89-550-66j </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Nycomed </td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

uitbreiden cytotoxische t-lymphocyten uit navelstrengbloed dat target cytomegalovirus, epstein-barr virus, en adenovirus

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infecties na stamceltransplantatie behoren tot de meest voorkomende oorzaken van sterfte, vooral na navelstrengbloed (CB) transplantatie (CBT), waar de CB bevat geen aanzienlijke aantallen van virus-ervaren T-cellen die de ontvanger kan beschermen tegen infectie 1. - 4 Wij en anderen hebben aangetoond dat virus-specifieke CTL gegenereerd uit seropositieve donoren en toegediend aan de ontvanger veilig en beschermend. 5-8 Tot voor kort, virus-specifieke T-cellen niet kunnen worden gegenereerd uit navelstrengbloed, waarschijnlijk door de Aangezien virus-specifieke geheugen T-cellen. In een poging om beter na te bootsen in vivo priming omstandigheden van naïeve T-cellen hebben we een methode die gebruikt CB-afgeleide dendritische cellen (DC) getransduceerd met een adenovirale vector (Ad5f35pp65) met de immunodominante CMV pp65 antigen dus een T celspecificiteit in de richting van CMV en adenovirus. 9 Bij initiatie, gebruiken we deze mareerde DCs als CB-afgeleide T-cellen in aanwezigheid van de cytokinen IL-7, IL-12 en IL-15. 10 Op de tweede stimulatie we EBV-getransformeerde B-cellen of EBV-LCL, die zowel uitdrukken latente en lytische EBV-antigenen. Ad5f35pp65-getransduceerde EBV-LCL worden gebruikt om de T cellen te stimuleren in aanwezigheid van IL-15 bij de tweede stimulatie. Volgende stimulaties gebruik Ad5f35pp65 getransduceerde EBV-LCL en IL-2. Van 50x10 6 CB mononucleaire cellen kunnen wij ruim 150 x 10 6 virus-specifieke T-cellen die antigen-gepulseerde doelen en afgifte cytokines lyseren in reactie op antigene stimulatie genereren. 11 Deze cellen werden in een GMP-compatibele wijze met alleen de 20% fractie van een gefractioneerde navelstrengbloed en zijn vertaald voor klinisch gebruik.

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Virusinfecties na stamceltransplantatie behoren tot de meest voorkomende doodsoorzaken, vooral na navelstrengbloedtransplantatie (CB-transplantatie), waarbij ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van uit navelstrengbloed afgeleide cytotoxische T-lymfocyten of CTL die antigenen van meerdere virussen herkennen. Dit wordt bereikt door eerst de mononucleaire cellen uit het navelstrengbloed te isoleren uit de 20%-fractie van de navelstrengbloedeenheid. De tweede stap is het gebruik van de mononucleaire cellen om dendritische cellen, Epstein-Barr-viruslymfoblastcellijnen, of E-B-V-L-C-L en virus-specifieke CTL te genereren.De mononucleaire cellen, die de T-cellen bevatten, worden gestimuleerd met cellen die zijn getransduceerd met de A five F 35 PP 65 vector. De laatste stap is het bevestigen van de specificiteit van de multi-virus specifieke CTL en het invriezen van de CTL. Uiteindelijk kan de specificiteit van de expansie van de CTL voor ten minste één viraal antigeen worden geëvalueerd via ELISpot-analyse en cytotoxiciteitsassays.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat het volume kernbloed dat beschikbaar is in de 20%-fractie zeer klein is, wat betekent dat er zeer weinig cellen zijn om mee te werken. De procedure is bovendien vrij complex en omvat de generatie van ten minste dr

expanding-cytotoxic-t-lymphocytes-from-umbilical-cord-blood-that

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

CD4+ regulatorische T-cellen zijn krachtige immuunmodulatoren en hebben belangrijke functies in immuunhomeostase. Het gebrek aan deze cellen in perifeer bloed maakt functionele studies uitdagend, specifiek in de context van HIV-1-infectie. We beschrijven hier een methode om functionele CD4+ Tregs te isoleren en uit te breiden van perifeer bloed van HIV-1-geïnfecteerde individuen.

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

We schetsen een 9-daags protocol voor de transductie en uitbreiding van rhesus macaque perifere bloedmononucleaire cellen die cellen oplevert met een uitstekende co-expressie van de genen van belang in voldoende aantal voor infusie studies van celwerkzaamheid.

Transductie en uitbreiding van primaire T-cellen in negen dagen met onderhoud van centraal geheugen Fenotype

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Leer een GMP-conforme methode om virus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten te produceren uit navelstrengbloed. Deze techniek genereert CTL die meerdere virale antigenen herkennen voor klinische toepassingen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Meer video's verkennen