In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe een dubbel gelabelde DNA-schadesensor kan worden samengesteld en gebruikt om twee hoofdtypen DNA-breuken in weefselcoupes te labelen. De sensor bestaat uit een 30-mer DNA-oligonucleotide dat dubbel gelabeld is met ZI en Rumine, en een enzym, vaccinia topo-isomerase één (of vac topo), dat zelf samenstelt. Wanneer VAC topo bindt aan de 30-mer, start de werking waarbij topo het oligonucleotide splitst bij het 3'-uiteinde van de herkenningssequentie, wat resulteert in een vac topo-geactiveerde fitzy-gelabelde eenheid en een amine-gelabelde vrije hairpin.

Met een terminale drie-prime hydroxylgroep zijn de eenheden kortlevend en worden ze snel weer samengevoegd tot het oorspronkelijke construct, dat vervolgens wordt gesplitst. In afwezigheid van aanvullende extra moleculaire DNA-breuken scheiden deze twee eenheden zich continu en herstellen ze zich in een cyclische wijze. Wanneer de moleculaire sensor wordt toegepast op weefselsneden met DNA-schade, hecht de Fitz-gelabelde detectoreenheid selectief aan stompgeëinde DNA-breuken met een vijf-prime hydroxylgroep.

De R-domein gelabelde detectie-eenheid zal ligeren aan een vijf-prime fosfaat stomp-ended breuk. Indien T4 DNA-ligase aanwezig is, worden resultaten verkregen die de aanwezigheid en distributie van DNA-breuken van type één en twee in cellen aantonen op basis van fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de detectie van DSB's, zoals TUNEL, is dat deze specifieker is en aanvullende informatie biedt door zowel de zelfstandige als de fagocytische fasen van apoptose te labelen.

Vanuit het perspectief van de nanotechnologie is deze sensor een voorbeeld van een bio-geïnspireerde benadering die feitelijke biologische structuren en architecturen aanpast voor de constructie van niet-toxische apparaten op moleculaire schaal. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren, aangezien het succes afhangt van het gebruik van een zeer actieve Toro SOM-preparatie en de correcte verwerking van coupes om overmatige digestie door proteinase K te voorkomen. De weefselcoupes voor deze procedure moeten worden voorbereid vóór de assemblage van het moleculaire apparaat. Coupes met een dikte van vijf tot zes micron, gesneden uit paraldehyde.

Gefixeerde in paraffine ingebedde weefselblokken worden aanbevolen. Plaats de dia met de weefselcoupe in een diarak en verwijder de was in xyleen gedurende 15 minuten. Na 15 minuten wordt de dia overgebracht naar een vers xyleenbad voor nog eens vijf minuten.

Rehydrate het coupes door de slide door deze oplopende ethanolconcentraties te halen. Twee keer 96% ethanol gedurende vijf minuten per keer. 80% ethanol gedurende vijf minuten, gevolgd door water.

Twee keer gedurende vijf minuten. Na rehydratatie wordt de sectie verteerd met proteinase K. Gebruik per sectie 100 µL van een 50 µg/mL oplossing en incubeer dit 15 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Afhankelijk van het weefseltype moet de digestietijd mogelijk worden aangepast, maar wees voorzichtig om overdigestie te voorkomen, aangezien dit leidt tot het verdwijnen van het signaal en verstoring van de sectie zodra de digestie is voltooid.

Spoel de slide twee keer gedurende elk 10 minuten met gedestilleerd water. Breng 2% BSA aan voor pre-blocking en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Zet tijdens deze tijd de moleculaire machine in elkaar, zoals hierna in deze video wordt getoond.

Alle reagentia voor de assemblage van de moleculaire machine zijn geschaald voor een totaalvolume van 25 microliters, wat voldoende is voor één detectie in een weefselcoupe van gemiddelde grootte. Het volume kan indien nodig worden opgeschaald in een klein plastic buisje. Meng de volgende reagentia in deze volgorde met gedestilleerd water.

15% polyethyleenglycol 8.000, T4 DNA-ligasebuffer, dubbel gelabelde oligonucleotiden, vaccinia-topoisomerase I en T4 DNA-ligase voorzichtig mengen door te pipetteren. Het moleculaire construct zal zich in deze oplossing vrijwel onmiddellijk zelf assembleren en kan direct bij kamertemperatuur worden gebruikt. Om de procedure voor het labelen van DNA-breuken te starten, wordt de pre-blockingsolutie van de slide geaspireerd.

Breng 25 µL van het volledige reactiemengsel aan op elk gedeelte. Plaats een plastic dekglas over het gedeelte en plaats het objectglas in een bevochtigingskamer. Bescherm tegen licht door de kamer in aluminiumfolie te wikkelen en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Hoewel zowel ligase- als topo-signalen na de incubatie van één uur kunnen worden waargenomen, kan het ligase-signaal in veel gevallen verder worden versterkt. Om het signaal te versterken, brengt u het reactiemengsel opnieuw aan zonder vac topo en oligonucleotide één, maar met oligonucleotide drie en T four DNA Ligase, plaatst u een plastic dekglas op de sectie en incubeert u deze gedurende 18 uur in een bevochtigingskamer. Dompel de slide de volgende dag bij kamertemperatuur voorzichtig verticaal in een coplan-pot met water op kamertemperatuur om het dekglas te verwijderen.

Was daarna de sectie drie keer gedurende telkens 10 minuten in gedestilleerd water. Spoel de sectie met natriumbicarbonaatbuffer. Deze spoeling met een alkalische oplossing versterkt de FITC-fluorescentie, welke pH-gevoelig is en significant afneemt bij een pH lager dan zeven.

Dek slutend het coupesectie af met een anti-fading oplossing die tevens DPI bevat voor contrast, kleur de kernen en breng een dekglas aan. De coupesecties zijn nu klaar voor fluorescentiemicroscopie. In deze figuur wordt een weefselcoupe getoond van een met dexamethason behandelde thymus, waarbij de moleculaire machine DNA-breuken met stompe uiteinden van type DNA1 en DNA2 heeft gedetecteerd in de thymische corticale gebieden die apoptose ondergaan; groene cytoplasmatische fluorescentie duidt op breuken van type DNA2, en corticale macrofagen markeren het verteren van nucleusmateriaal van apoptotische thymocyten.

Dit signaal wordt geproduceerd door vac topo en lokaliseert naar FGA-lysosomen met DNA dat een vijf-prime hydroxylgroep bevat. Dubbelstrengs breuken met rode fluorescentie duiden op labels voor één type DNA-breuken, in kernen van apoptotische thymocyten die niet zijn opgenomen door macrofagen. Enorme hoeveelheden thymocyten ondergaan gelijktijdig apoptose.

Geleid door de generatie van vijf primaire fosfaat-dubbelstrengsbreuken, gevisualiseerd middels ligase-gebaseerde labeling. Deze breuken bevinden zich aan de nucleaire periferie en vormen ringvormige patronen. Alle celkernen zijn in het blauw gevisualiseerd door tegenkleuring met dpi.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de coupes nooit mogen uitdrogen tussen het toevoegen van verschillende oplossingen. Bewaar daarnaast alle enzymatische preparaten op ijs voordat ze aan de coupes worden toegevoegd en bescherm uw fluorescentiesondes tegen licht tijdens de labelingsreactie na de ontwikkeling. De techniek maakte visualisatie van alle fasen van de afbraak van de cel mogelijk.

Deze sensor zelf is een voorbeeld van de groene nanotechnologische benadering voor het ontwerp van nanodeeltjes, probes en machines. Deze benadering combineert kunstmatige componenten met natuurlijk voorkomende onderdelen van moleculaire machines. Het doel is om de toxiciteit en nadelige biologische reactiviteit van deze sterk gedispergeerde nanomaterialen te elimineren.