Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Het doel van dit protocol is de isolatie en expansie van menselijke glioblastoma multiforme tumorcellen met behulp van neurosferen. Dit wordt bereikt door het geoogste tumorweefsel eerst fijn te hakken, gevolgd door mechanische dissociatie, om de resulterende cellen vervolgens uit te platen voor groei in een neurosfeer-cultuur. In deze video laten we zien hoe stamcelachtige cellen uit menselijk glioblastoomtumorweefsel kunnen worden geïsoleerd en geëxpandeerd met behulp van de neurosfeer-cultuurmethode.

Deze methode kan ook worden gebruikt voor het kweken van cellen uit andere hersentumoren, evenals uit solide tumoren zoals borst-, prostaat-, lever- en longtumoren. Laten we beginnen. Na ontvangst van het chirurgisch geresecteerde GBM-tumorgeweef is het medium verwijderd.

De tumor wordt twee of drie keer gewassen met steriele PBS om verontreinigingen zoals bloed en debris te verwijderen. Plaats de geresecteerde tumor na het wassen in een steriele petrischaal. Snijd de tumor eerst in kleinere delen, breng vervolgens een deel van het tumorweefsel over naar een aparte petrischaal en hak het weefsel met een scalpel nr. 10 in zeer kleine stukjes.

Dit zal het oppervlak vergroten dat beschikbaar is voor enzymatische dissociatie. Het fijnmalen kan één tot drie minuten duren, afhankelijk van de grootte van de tumor. Voeg nu drie tot vijf ml voorverwarmde trypsine toe aan het fijngehakte weefsel en breng dit over naar een steriele falconbuis van 15 ml.

Plaats de 15 Ml buis gedurende 10 tot 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Schud de buis elke vijf minuten. Voeg, om een betere weefseldigestie te waarborgen, een gelijk volume trypsineremmer toe om de reactie te stoppen.

De activering van trypsine wordt gewaarborgd door meerdere keren op en neer te pipetteren. Centrifugeer de suspensie bij 800 RRP M of 110 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer vervolgens het pellet in 1 ml neuros stamcelbasaalmedium door de pipetpunt tegen de bodem van de buis te plaatsen.

Pipette drie tot zeven keer op en neer om klontjes op te lossen tot een melkachtige suspensie is verkregen; overmatig pipetteren kan leiden tot celdood. Plaats een 40 micron filter op een 50 ml buis. Voeg nu 10 tot 15 ml basaal medium toe aan de celsuspensie en meng dit voorzichtig. Leid de celsuspensie door het 40 micron filter om debris en niet-geassocieerde klontjes te verwijderen.

Centrifugeer de cellen en zuig het supernatant af. Resuspendeer de cellen in 1 tot 2 ml compleet medium. Pipetteer vervolgens voorzichtig op en neer om de suspensie te homogeniseren.

Meng 10 µL cellususpensie met 90 µL Trypaanblauw. Meng de suspensie goed en breng 10 µL over naar de hemo.Cytometer. Voer een celtelling uit zoals hier wordt getoond.

Een suspensie van enkelvoudige cellen zonder klonters is vereist voor een nauwkeurige cel telling. Sluit trypan blue-positieve cellen uit. Gebruik dit bij het tellen om de cellen in een T 80-fles uit te platen.

Voeg 20 ml compleet neuro-stamcelmedium toe aan een buis van 50 ml. Voeg de juiste hoeveelheid cel-suspensie toe om een dichtheid van 200.000 cellen per ml te bereiken. Voeg nu EGF toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per ml.

Voeg 0,2% heparine toe in een concentratie van één µL per ml. Voeg ten slotte BFGF toe om een eindconcentratie van 10 ng per ml te bereiken. Meng de cellen in compleet medium aangevuld met groeifactoren.

Breng de suspensie vervolgens over naar een T 80-fles. Plaats de fles daarna in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor zeven tot 10 dagen. Na acht dagen in cultuur zijn de sferoïden volledig gegroeid en klaar om te worden gepasseerd.

Verzamel de inhoud van de kolf en breng deze over naar een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 800 RPM. Zuig het supernatant af en resuspendeer het pellet vervolgens in één ml voorverwarmde trypsine.

Incubeer de cellen in een waterbad bij 37 °C gedurende twee minuten. Voeg een gelijke hoeveelheid trypsineremmer toe en meng grondig om activering te waarborgen. Pelleteer vervolgens de cellen.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml compleet medium; pipetteer voorzichtig op en neer om de celsuspensie te homogeniseren. Voer een cel telling uit zoals eerder beschreven om de cellen in een T 80-fles met 20 ml compleet medium in een 50 ml buis uit te platen. Voeg een passende hoeveelheid celsuspensie toe om een dichtheid van 50.000 cellen per ml te bereiken.

Voeg nu groeifactoren toe, waaronder E-G-F-B-F-G-F, en heparine in de eerder beschreven concentratie. Meng de resulterende celsuspensie voorzichtig, breng de suspensie vervolgens over naar een T 80 en plaats deze gedurende zeven tot 10 dagen in de incubator. Hier is een voorbeeld van een primaire GBM-cultuur.

Na vier dagen in dit stadium is te zien dat de cellen prolifereren en sferoïden beginnen te vormen. Grote sferische celclusters mogen in dit stadium niet worden waargenomen. Dit zou het gevolg zijn van een onjuiste preparatie van het weefsel.

Na een kweekperiode van zeven tot 10 dagen zijn er sferoïden van verschillende grootte gevormd. Wanneer de sferoïden een gemiddelde diameter van 150 tot 200 micron hebben bereikt, zijn ze klaar om te worden gepassaged. Dit is een voorbeeld van het passagen van een GBM-kweek na acht dagen. Hier zijn opnieuw sferoïden van verschillende grootte te zien; gezonde sferoïden vertonen micro-spikes aan hun periferie.

Het bereiden van een suspensie van enkelvoudige cellen is een zeer belangrijk aspect bij elke sfeer-kweek. Anders kan het voorkomen dat u zelfs de dag na het uitplaten van de cellen celaggregaten waarneemt. Deze aggregaten zouden als sferen kunnen worden beschouwd, maar er moet worden opgemerkt dat het minstens een week duurt voordat de cellen echte sferen vormen.

De hoeveelheid debris in de primaire tumorsferencultuur varieert afhankelijk van vele factoren, zoals de bron van het weefsel, de precisie waarmee het weefsel is verwijderd en de gebruikte weefselverwerkingstechniek. We hopen dat u deze video nuttig vindt en wensen u veel succes met uw experimenten.