Name: Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer de isolatie en uitbreiding van stamachtige cellen uit menselijk glioblastoomweefsel met behulp van de neurosphere-assay. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en potentiële therapeutische doelwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Florida Centre for Brain Tumor onderzoek; Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapie.

1. Verzameling van primaire GBM Tissue <ol><li> Een glioblastoma mutliforme (GBM) tumor is verkregen van een patiënt gediagnosticeerd met de kanker en die een operatie ondergaan. </li><li> Regelingen moeten worden gemaakt met neurochirurgie team. De neurochirurg zal plaats de verwijderde tumor GBM in een geschikte grootte buis met neurale stamcellen (NSC) basaal medium, aangevuld met 10-15% antibiotica (Peniciline / streptomycine). Koude medium moet worden verstrekt aan operatiekamer door lab. Als alternatief, koude HEPES-gebufferd minimale essentiële medium (HEM) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met een hoge concentratie van antibiotica kan ook worden gebruikt voor dit doel. </li><li> De verwijderde tumor weefsel wordt geleverd aan het lab op het ijs en onder de motorkap. </li></ol> 2. Dissociatie van de primaire tumor in de Single-Cell Suspension <ol><li> Bovenop de oorspronkelijke medium / PBS wordt verwijderd uit de valk buis en het monster wordt gewassen 2-3 keer met 5-10ml PBS / NSC basismedium om bloed en vuil te verwijderen. De PBS / Medium is verwijderd en de GBM tumor weefsel wordt geplaatst in een petrischaal. </li><li> Het weefsel wordt in kleine stukjes gesneden en gehakt met een nr. 10 scalpel in kleine stukjes naar de oppervlakte voor het trypsine te vergroten. Hakken kan 1-3 minuten, afhankelijk van de grootte van de tumor. </li><li> Het gehakt weefsel wordt getrypsiniseerd in 3-5 ml van de voorverwarmde% 0,05 trypsine-EDTA gedurende 10-15 minuten bij een 37 ° C waterbad. Een elektronische pipet wordt gebruikt om de kleine stukjes tumor en trypsine te zetten in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Een gelijk volume van de sojaboon trypsine-remmer wordt toegevoegd aan de enzymatische trypsine reactie na de incubatietijd te stoppen. </li><li> Trypsine inactivatie wordt verzekerd door pipetteren de schorsing op en neer meerdere malen. Vervolgens wordt de suspensie gepelleteerd door centrifugeren bij 800rpm (110g) voor 5min. </li><li> Het supernatant wordt verwijderd en het weefsel stukken worden geresuspendeerd in 1 ml van de steriele NSC basal medium. De klompjes worden gescheiden door zachtjes en neer te pipetteren (3-7 keer) tot een gladde melkachtige enkele cel suspensie is ontstaan. Het aantal pipetteerstappen is direct afhankelijk van de grootte van deeltjes in de gehakt weefsel. Langdurige en krachtige mechanische dissociatie moet worden vermeden omdat het kan resulteren in celdood en een vermindering van de sfeer formatie. </li><li> Van de VN-gesplitste stukken en vuil te verwijderen, is 10-15 ml van de basale medium toegevoegd aan de buis en de celsuspensie wordt gefilterd door een 40 micron cel zeef in een 50 ml buis. </li><li> De gefilterde suspensie wordt gecentrifugeerd bij 800rpm (110g) voor 5min. Het supernatant wordt achteraf weggegooid. </li><li> Gepelleteerd cellen worden dan geresuspendeerd in 1-2 ml van complete NSC medium voor cel tellen. </li></ol> 3. Celgetal en Plating <ol><li> 10 pi van de celsuspensie wordt toegevoegd aan 90 ul van 0,04% trypan blauw in een 1 ml eppendorfbuisje. Let op: andere geschikte cel verdungen kan ook worden gebruikt. </li><li> Pipet op en neer om de schorsing te mengen. 10 pi van de cellen / trypan blauw mengsel wordt overgebracht naar hemocytometer om celdichtheid tellen. </li><li> Cellen worden uitgeplaat in volledige NSC medium (een mengsel van NSC basale medium en NSC proliferatie aan te vullen op een 09:01 verhouding), aangevuld met 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF en 1μl/ml van 0,2% heparine (2μg/ml) in juiste weefselkweek schepen. 5, 20 en 40 ml medium wordt gebruikt voor T25, T80 en T175 flessen, respectievelijk. Antibiotica kunnen worden toegevoegd aan het medium bij een concentratie van 1:100 tot kans op besmetting verminderen. </li><li> De kolf is geplaatst in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> 4. Passage en uitbreiding van de GBM afgeleid sferen: <ol><li> Wanneer de neurospheres een gemiddelde grootte van 150-200 micrometer in diameter bereikt, de cultuur is klaar voor subcultuur. De inhoud van elke kolf wordt verwijderd en geplaatst in een passende omvang steriele Tissue cultuur buis, en gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Het supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA. </li><li> Om een ​​optimale behandeling met trypsine, wordt de celsuspensie geïncubeerd bij 37 ° C in een waterbad voor 2-3 minuten. Te stoppen met de trypsine-activiteit een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt toegevoegd aan de celsuspensie en de celsuspensie voorzichtig gepipetteerd op en neer. </li><li> De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 800 rpm (110g) gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het supernatant verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in 1 ml van NSC medium. </li><li> Een cel telling wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven. </li><li> De cellen worden uitgeplaat bij een concentratie van 5x10 4 cellen / ml in volledige NSC medium aangevuld met groeifactoren en uitgeplaat in de juiste grootte weefselkweek schepen zoals beschreven in de vorige deel. </li><li> Secundaire neurospheres worden gevormd in 7-10 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtigeified incubator met 5% CO 2. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Na beplating van de afzonderlijke cellen geoogst van GBM tumorweefsel, tumor stam-achtige cellen prolifereren en het genereren van kleine clusters van cellen bestaat uit enkele cellen in 3-4 dagen (zie de video en zie figuur 1). Omdat deze clusters groeien, krijgen ze een meer ronde vorm, zodat met 7-8 dagen, een goede fase heldere bollen met een gemiddelde diameter van 150-200 micron vorm (Zie de video en Figuur 2). Bij hogere vergroting, gezonde bollen meestal demonstreren microspikes op hun periferie. Na grote bol, zoals clusters binnen 1-2 dagen na de initiatie cultuur is te wijten aan het bestaan ​​van niet-gesplitste klonten in de binging van de cultuur en mag niet worden verward als echte bollen. De hoeveelheid puin in de primaire tumor sfeer cultuur hangt af van de oorspronkelijke bron van weefsel en al dan niet omvat alle omliggende hersenweefsel. De juiste weefsels bereidingstechniekeninclusief enzymatische en mechanische dissociatie, en de daaropvolgende filtratie van het monster met een voldoende hoeveelheid van het medium kan leiden tot minder vuil in de cultuur. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Primaire GBM bol cultuur 4 dagen na de plating. Tumor stam-achtige cellen prolifereren en het genereren van kleine clusters van cellen in 3-4 dagen. Originele Vergroting; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Passage een GBM bol cultuur 8 dagen na plating. Originele Vergroting; 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Om neurale stamcellen en stamcellen uit normale volwassen en foetale hersenen 1, 2, 3, 4 isoleren en ook de tumor stam-achtige cellen aan kanker weefsels zoals long-5-, prostaat-6-, borst-7 en de hersenen 8, 9 van de neurosphere test is vaak gebruikt als de methode van keuze. Met behulp van deze eenvoudige en reproduceerbare test, kan men het genereren van een onbepaald aantal cellen van de tumor operatief verwijderde weefsel dat dezelfde kenmerken als somatische stamcellen te tonen; ex vivo multipotent, de mogelijkheid om nieuwe tumoren te creëren bij de implantatie, en zelf-vernieuwing. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de basis van kanker celbiologie waaronder cel-cel interacties, en differentiatie, migratie, invasie en celdood te bestuderen. Daarnaast, geïsoleerde tumor stam-achtige cellen geven een waardevol instrument om te onderzoeken hoe tumoren vormen, vooruitgang en terugval en ook om de onderliggende cellulaire mechanismen die voortvloeien dat uiteindelijk zou kunnen inzicht te verstrekken aan therapeutische ontrafelenmogelijkheden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen (Human) </td><td> Medium aan te vullen </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05% trypsine-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM component </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM component </td></tr><tr><td> * Gedistilleerd water </td><td> Reagens </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Soja trypsine-remmer </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nr. 10 scalpel </td><td> Chirurgisch instrument </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaal </td><td> Cultuur software </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine tang </td><td> Chirurgische instrumenten </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cel zeef </td><td> Zeef </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 fles </td><td> Cultuur software </td><td> Nu Nalgenc internationale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 fles </td><td> Cultuur software </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml buizen </td><td> Cultuur software </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml buizen </td><td> Cultuur software </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Groeifactor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Groeifactor </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparine </td><td> Groeifactor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Gereconstitueerd in PBS </td></tr></tbody></table> * Om HEM te maken, mix 1x10L pakje MEM and160ml van 1M HEPES en breng het volume tot 8,75 L met gedestilleerd water. Zet de laatste PH tot 7,4 eend opslaan bij 4 ° C. ** Ter voorbereiding trypsine-remmer oplossing, eerst 10 ml van DNase I-oplossing (100 mg DNase opgelost in 100 ml van HEM) en vervolgens 0,14 g trypsine-remmer aan DNase-oplossing toe te voegen en eindelijk het volume aan tot 1 liter met behulp van HEM. Houd aliquots van de eindproducten in de -20 ° C vriezer.

isolatie en uitbreiding van de mens glioblastoma multiforme tumorcellen met behulp van de neurosphere assay

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stam-achtige cellen werden geïsoleerd in tumoren zoals borst-, long-, colon-, prostaat-en de hersenen. Een kritiek punt in al deze tumoren, met name in glioblastoom mutliforme (GBM), is het identificeren en te isoleren tumor initiëren cel populatie (s) om hun rol te onderzoeken in tumorvorming, progressie, en herhaling. Inzicht in tumor initiëren van celpopulaties zal aanwijzingen geven over het vinden van effectieve therapeutische benaderingen voor deze tumoren. De neurosphere assay (NSA), vanwege zijn eenvoud en reproduceerbaarheid is gebruikt als de methode van keuze voor isolatie en verspreiding van veel van deze tumorcellen. Dit protocol laat de neurosphere kweekmethode te isoleren en stam-achtige cellen uit te breiden in chirurgisch weggesneden humane GBM tumor weefsel. De procedures omvatten een eerste chemische vertering en mechanische dissociatie van tumorweefsel, en vervolgens plating de resulterende enkele celsuspensie in NSA cultuur. Na 7-10 dagen, primaire neurospheres van 150-200 micrometer in diameter kunnen worden waargenomen en zijn klaar voor verdere passage en uitbreiding.

Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Stamcelachtige cellen zijn geïsoleerd in tumoren zoals in de borst, longen, dikke darm, prostaat en hersenen. Een kritiek probleem bij al deze tumoren, vooral in ...

Het doel van dit protocol is de isolatie en expansie van menselijke glioblastoma multiforme tumorcellen met behulp van neurosferen. Dit wordt bereikt door het geoogste tumorweefsel eerst fijn te hakken, gevolgd door mechanische dissociatie, om de resulterende cellen vervolgens uit te platen voor groei in een neurosfeer-cultuur. In deze video laten we zien hoe stamcelachtige cellen uit menselijk glioblastoomtumorweefsel kunnen worden geïsoleerd en geëxpandeerd met behulp van de neurosfeer-cultuurmethode.Deze methode kan ook worden gebruikt voor het kweken van cellen uit andere hersentumoren, evenals uit solide tumoren zoals borst-, prostaat-, lever- en longtumoren. Laten we beginnen. Na ontvangst van het chirurgisch geresecteerde GBM-tumorgeweef is het medium verwijderd.De tumor wordt twee of drie keer gewassen met steriele PBS om verontreinigingen zoals bloed en debris te verwijderen. Plaats de geresecteerde tumor na het wassen in een steriele petrischaal. Snijd de tumor eerst in kleinere delen, breng vervolgens een deel van het tumorweefsel over naar een aparte petrischaal en hak het weefsel met een scalpel nr. 10 in zeer kleine stukjes.Dit zal het oppervlak vergroten dat beschikbaar is voor enzymatische dissociatie. Het fijnmalen kan één tot drie minuten duren, afhankelijk van de grootte van de tumor. Voeg nu drie tot vijf ml voorverwarmde trypsine toe aan het fijngehakte weefsel en breng dit over naar een steriele falconbuis van 15 ml.Plaats de 15 Ml buis gedurende 10 tot 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Schud de buis elke vijf minuten. Voeg, om een betere weefseldigestie te waarborgen, een gelijk volume trypsineremmer toe om de reactie te stoppen.De activering van trypsine wordt gewaarborgd door meerdere keren op en neer te pipetteren. Centrifugeer de suspensie bij 800 RRP M of 110 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer vervolgens het pellet in 1 ml neuros stamcelbasaalmedium door de pipetpunt tegen de bodem van de buis te plaatsen.Pipette drie tot zeven keer op en neer om klontjes op te lossen tot een melkachtige suspensie is verkregen; overmatig pipetteren kan leiden tot celdood. Plaats een 40 micron filter op een 50 ml buis. Voeg nu 10 tot 15 ml basaal medium toe aan de celsuspensie en meng dit voorzichtig. Leid de celsuspensie door het 40 micron filter om debris en niet-geassocieerde klontjes te verwijderen.Centrifugeer de cellen en zuig het supernatant af. Resuspendeer de cellen in 1 tot 2 ml compleet medium. Pipetteer vervolgens voorzichtig op en neer om de suspensie te homogeniseren.Meng 10 µL cellususpensie met 90 µL Trypaanblauw. Meng de suspensie goed en breng 10 µL over naar de hemo.Cytometer. Voer een celtelling uit zoals hier wordt getoond.Een suspensie van enkelvoudige cellen zonder klonters is vereist voor een nauwkeurige cel telling. Sluit trypan blue-positieve cellen uit. Gebruik dit bij het tellen om de cellen in een T 80-fles uit te platen.Voeg 20 ml compleet neuro-stamcelmedium toe aan een buis van 50 ml. Voeg de juiste hoeveelheid cel-suspensie toe om een dichtheid van 200.000 cellen per ml te bereiken. Voeg nu EGF toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per ml.Voeg 0,2% heparine toe in een concentratie van één µL per ml. Voeg ten slotte BFGF toe om een eindconcentratie van 10 ng per ml te bereiken. Meng de cellen in compleet medium aangevuld met groeifactoren.Breng de suspensie vervolgens over naar een T 80-fles. Plaats de fles daarna in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor zeven tot 10 dagen. Na acht dagen in cultuur zijn de sferoïden volledig gegroeid en klaar om te worden gepasseerd.Verzamel de inhoud van de kolf en breng deze over naar een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 800 RPM. Zuig het supernatant af en resuspendeer het pellet vervolgens in één ml voorverwarmde trypsine.Incubeer de cellen in een waterbad bij 37 °C gedurende twee minuten. Voeg een gelijke hoeveelheid trypsineremmer toe en meng grondig om activering te waarborgen. Pelleteer vervolgens de cellen.Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml compleet medium; pipetteer voorzichtig op en neer om de celsuspensie te homogeniseren. Voer een cel telling uit zoals eerder beschreven om de cellen in een T 80-fles met 20 ml compleet medium in een 50 ml buis uit te platen. Voeg een passende hoeveelheid celsuspensie toe om een dichtheid van 50.000 cellen per ml te bereiken.Voeg nu groeifactoren toe, waaronder E-G-F-B-F-G-F, en heparine in de eerder beschreven concentratie. Meng de resulterende celsuspensie voorzichtig, breng de suspensie vervolgens over naar een T 80 en plaats deze gedurende zeven tot 10 dagen in de incubator. Hier is een voorbeeld van een primaire GBM-cultuur.Na vier dagen in dit stadium is te zien dat de cellen prolifereren en sferoïden beginnen te vormen. Grote sferische celclusters mogen in dit stadium niet worden waargenomen. Dit zou het gevolg zijn van een onjuiste preparatie van het weefsel.Na een kweekperiode van zeven tot 10 dagen zijn er sferoïden van verschillende grootte gevormd. Wanneer de sferoïden een gemiddelde diameter van 150 tot 200 micron hebben bereikt, zijn ze klaar om te worden gepassaged. Dit is een voorbeeld van het passagen van een GBM-kweek na acht dagen. Hier zijn opnieuw sferoïden van verschillende grootte te zien; gezonde sferoïden vertonen micro-spikes aan hun periferie.Het bereiden van een suspensie van enkelvoudige cellen is een zeer belangrijk aspect bij elke sfeer-kweek. Anders kan het voorkomen dat u zelfs de dag na het uitplaten van de cellen celaggregaten waarneemt. Deze aggregaten zouden als sferen kunnen worden beschouwd, maar er moet worden opgemerkt dat het minstens een week duurt voordat de cellen echte sferen vormen.De hoeveelheid debris in de primaire tumorsferencultuur varieert afhankelijk van vele factoren, zoals de bron van het weefsel, de precisie waarmee het weefsel is verwijderd en de gebruikte weefselverwerkingstechniek. We hopen dat u deze video nuttig vindt en wensen u veel succes met uw experimenten.

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

This video demonstrates the in vitro brain tumor stem cell (BTSC) invasion assay to determine the effect of drug treatment on the invasion capacity of BTSCs from the neurosphere via live-cell imaging technique.

Brain Tumor Stem Cell (BTSC) Neurosphere Invasion Assay: An In Vitro Assay to Analyze the Effect of Drug Treatment on BTSC Invasion from Neurosphere

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden...

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

We presenteren een 3D-glioblastoommigratiemodel met behulp van door patiënten afgeleide magnetische gliomasferen, gegenereerd uit nieuw gediagnosticeerde en terugkerende tumoren. Dit platform maakt het mogelijk om patiëntspecifieke migratiedynamiek te visualiseren en de therapeutische effectiviteit te beoordelen. De assay kan na migratie worden gemultiplexed om eiwitlokalisatie en expressiepatronen te evalueren.

Reproducerbare 3D glioblastoom migratietest met magnetische nanodeeltjesgemedieerde sferoidlokalisatie onder hypoxische omstandigheden

Leer de isolatie en uitbreiding van stamachtige cellen uit menselijk glioblastoomweefsel met behulp van de neurosphere-assay. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en potentiële therapeutische doelwitten.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Meer video's verkennen