Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification
February 25th, 2012
Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.
Het algemene doel van deze procedure is om een methode bekend als Tandem affinity purification te gebruiken om eiwitbindingspartners te isoleren. Hallo, ik ben dLAN Bailey van de afdeling Virologie aan Imperial College London. In ons lab werken we aan interacties tussen virus en gastheer voor verschillende leden van de virusfamilie.
Het identificeren van eiwitten die interageren met andere cellulaire of virale eiwitten is een goed startpunt voor het onderzoeken van de interactie tussen het virus en zijn gastheer tijdens infectie. In deze video leg ik een benadering uit die we in ons lab gebruiken, tandem en e-purificatie of tap-tagging. De Tap-tag die in deze studie wordt gebruikt, is een N-terminaal tag bestaande uit twee eenheden van proteïne G en een strep adin-bindend peptide.
Deze zijn gescheiden door een A TEV-protease splitsingssequentie die een specifieke elutie van het aas-eiwit mogelijk maakt. In dit voorbeeld is muis, EIF vier E aan het C-uiteinde van deze fusieconstructie. Het tap-tagging protocol is een zes-stappen procedure.
Na transfectie en generatie van cellijnen, worden cellen geïnduceerd om het tag abate-eiwit te gaan uitdrukken voordat ze worden gelegd in een milde lysisbuffer. Twee affiniteitszuiveringsstappen en twee specifieke oplossingen worden gebruikt om het aas en eventuele potentiële interacterende partners te zuiveren om cellijnen te genereren. HEC 2 93 cellen moeten worden getransfecteerd met de P met vier expressievector coderend.
De tap-gelabelde aas-eiwitcellen worden vervolgens geselecteerd met honderd microgram per milliliter hygromycine B. Aangezien het plasmide episo wordt gehouden, is er geen noodzaak om specifieke klonen te isoleren. 10 confluente flessen cellen worden geïnduceerd door behandeling met 10 micromolar cadmiumchloride gedurende 16 uur voordat ze in media worden afgeschraapt. De gesuspendeerde cellen worden vervolgens overgebracht naar 15 M-buizen en de cellen worden gepelleteerd door centrifugatie.
Deze cellen worden vervolgens drie keer gewassen met ijskoud PBS voordat ze uiteindelijk worden gepelleteerd. Stap twee, cel lysis: cellen worden gepelleteerd in vijf milliliters koude lysisbuffer door herhaald pipetteren voordat ze vijf minuten op ijs worden geplaatst. Om een efficiënte lysis te garanderen, worden de cellen vervolgens door een nauwe naald met stompe punt en bevroren-ontdooid.
Het resulterende sediment wordt verdeeld in 1,5 milliliterbuisjes en onzuivere cellen en deeltjes worden verwijderd door centrifugatie. Opmerkelijk is dat de pelletgrootte aanzienlijk is verminderd na deze centrifugatiestap. De lysaat-supernatanten worden vervolgens gecombineerd in een 15 milliliter Falcon-buis en door een 0,45 micrometerfilter gevoerd om eventuele aanvullende deeltjes te verwijderen.
Een 50 microliter-aliquot van dit lysaat moet worden genomen voor verdere analyse. Dit monster wordt aangeduid als monster één. Stap drie, binding aan konijn IgG Aeros.
In deze fase van het protocol worden de proteïne G-tags geïmmunoprecipiteerd door konijn IgG aros. Om aros-kralen te verdelen, verwijdert u het einde van de ape-tip. Dit helpt om schade aan de kralen te voorkomen.
Meng de oplossing van konijn IgG aro voorzichtig door de fles te laten slingeren voordat u de aros naar een 15 milliliterbuisje verwijdert. Was de aros drie keer in gekoelde lysisbuffer met behulp van lage snelheid centrifugatie om de kralen bij elke stap te verhelderen. De gepelleteerd konijn IgG-kralen zouden zichtbaar moeten zijn na centrifugatie.
Na elke stap verwijdert u voorzichtig de buffer zonder de kralen te verstoren. Nadat de laatste wasbeurt is voltooid, voegt u het gefilterde en verhelderde lysaat toe aan de gepakte kralen en incubeert u gedurende drie uur of een nacht. Het is te verkiezen bij vier graden C met behulp van een roterende mixer.
Na de immunoprecipitatie, centrifugeert u de aros-kralen neer en verwijdert u de supernatant voor verdere analyse. Indien nodig, kunt u een fijne build-tip gebruiken om eventueel resterend vocht uit deze buis te verwijderen. Dit supernatant is monster twee, stap vier TEV-protease splitsing.
In deze stap wordt het aas gesplitst van de proteïne G-tags. Deze stap zorgt voor een specifieke splitsing van het aas-eiwit en effectief een elutiestap van de konijn IgG aros-immunoprecipitatie. Bereid de TEV-splitsingsmix voor en voeg deze toe aan de aros-kralen met behulp van een ape-tip waarvan het einde is verwijderd, breng dit mengsel over naar een gesiliconiseerde microcentrifugebuis en draai om de aros in suspensie te brengen vóór overnachtelijke incubatie bij vier graden C, verwijder een aliquot van deze TEV-splitsingsreactie voor analyse.
Dit is monster drie. Overnachtelijke incubatie op de roterende mixer zou de TEV-reactie tot bijna voltooiing moeten laten verlopen. Stap vijf, binding aan geïmmobiliseerde strep adin-kralen.
In deze stap worden de Cleve-aas en eventuele potentiële bindingspartners gezuiverd uit oplossing. Centrifugeer eerst de TEV-splitsingsreactie die de konijn IgG aros-kralen bevat. Om de aros te pelletten, verwijdert u een OTT van de verhelderde supernatant voor analyse.
Dit is monster vier. Verwijder voorzichtig alle resterende supernatant, dat uw aas-eiwit bevat, naar een verse buis. Gebruik opnieuw fijn.
Build peppe-tips om alle mogelijke supernatant te verwijderen. Bewaar de konijn IgG aros-kralen voor verdere analyse. Dit is monster vijf.
Om schade aan de strep adin-kralen te voorkomen, verwijdert u het einde van een pet-tip. Meng de kralen voorzichtig en verwijder een aliquot naar een gesiliconiseerde buis. Was de strep-have in kralen met S-buffer, verhelderd door lage snelheid centrifugatie.
Na elke wasbeurt. Na elke wasbeurt verwijdert u voorzichtig de buffer. Strept adin-kralen zijn erg klein en kunnen gemakkelijk worden verplaatst, zelfs bij gebruik van fijn.
Build pet-tips. Nadat de strept adin-kralen zijn gewassen, voegt u het supernatant van de TEV-splitsingsreactie toe aan deze kralen en incubeert u de reactie gedurende drie uur of een nacht bij vier graden C, met behulp van een roterende mixer.
Overzicht
Tandem affinity purification is een krachtige techniek voor het identificeren van eiwitbindingspartners. Deze methode werd toegepast op het translatie-initiatiefactor eIF4E om gastheercelfactoren mee te precipiteren die betrokken zijn bij translatie-initiatie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Eiwitinteractiestudies
- Celbiologie
Achtergrond
- Tandem affinity purification (TAP) is een methode die wordt gebruikt om eiwitcomplexen te isoleren.
- De TAP-tag bestaat uit proteïne G en een streptavidine-bindend peptide.
- Deze techniek maakt specifieke elutie van lokkeiwitten mogelijk.
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het bestuderen van virus-gastheerdynamiek.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitten te isoleren en identificeren die interageren met het translatie-initiatiefactor eIF4E.
- Om de interactie tussen virale en gastheereiwitten tijdens infectie te onderzoeken.
- Om de aanpasbaarheid van de TAP-methode voor verschillende eiwitten te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Transfectie van HEC 293-cellen met een TAP-gelabelde expressievector.
- Cellyse en zuivering met behulp van konijnen-IgG en streptavidine-kralen.
- TEV-protease-splitsing voor specifieke elutie van lokkeiwitten.
- Meerdere was- en centrifugatiestaps om de zuiverheid van monsters te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van eIF4E en zijn interacterende partners.
- Demonstratie van de efficiëntie van de TAP-methode bij identificatie van eiwitcomplexen.
- Identificatie van potentiële gastheerfactoren betrokken bij translatie-initiatie.
- Validatie van de aanpasbaarheid van de methode voor andere eiwitten.
Conclusies
- Tandem affinity purification is een effectieve aanpak voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- De methode kan worden toegepast op verschillende cellulaire en virale eiwitten.
- Het begrijpen van deze interacties biedt inzicht in virale pathogenese.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
