Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Het algemene doel van deze procedure is om een methode genaamd tandem-affiniteitszuivering te gebruiken om eiwitbindende partners te isoleren. Hallo, ik ben dLAN Bailey van de afdeling Virologie aan Imperial College London. In ons laboratorium werken we aan virus-gastheerinteracties voor verschillende leden van de virusfamilie.

Het identificeren van eiwitten die interageren met andere cellulaire of virale eiwitten is een uitstekend startpunt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen het virus en de gastheer tijdens een infectie. In deze video leg ik een methode uit die we in ons laboratorium gebruiken: tandem affinity purification of tap-tagging. Het tap-tag dat in deze studie wordt gebruikt, is een N-terminale tag die bestaat uit twee eenheden proteïne G en een streptavidine-bindend peptide.

Deze zijn gescheiden door een TEV-protease-splitsingsvolgorde die specifieke elutie van het lokaasprotein mogelijk maakt. In dit voorbeeld bevindt muis EIF4E zich aan de C-terminus van dit fusieconstruct. Het TAP-taggingprotocol is een procedure bestaande uit zes stappen.

Na transfectie en het genereren van cellijnen worden de cellen geïnduceerd om het getagde abate-eiwit tot expressie te brengen voordat ze worden gelyseerd in een milde lysisbuffer. Twee affiniteitszuiveringsstappen en twee specifieke oplossingen worden gebruikt om het lokaas en eventuele potentiële interactiepartners te zuiveren om cellijnen te genereren. HEC 2 93-cellen moeten worden getransfecteerd met de P met vier expressievector die codeert voor.

De cellen met het tap-getagde lokaateiwit worden vervolgens geselecteerd met 100 µg/ml hygromycine B. Aangezien het plasmide episomaal wordt behouden, is het niet nodig om specifieke klonen te isoleren. 10 confluente flessen cellen worden geïnduceerd door behandeling met 10 µM cadmiumchloride gedurende 16 uur, waarna ze in medium worden afgeschraapt. De gesuspendeerde cellen worden vervolgens overgebracht naar 15 mL-buisjes en de cellen worden door centrifugatie gepelleteerd.

Deze cellen worden vervolgens drie keer gewassen met ijskoud PBS voordat ze uiteindelijk worden gecentrifugeerd tot een pellet. Stap twee: cellyse. Cellen worden gelyseerd in 5 mL koude lysisbuffer door herhaaldelijk pipetteren, waarna ze vijf minuten op ijs worden geplaatst. Om een efficiënte lyse te waarborgen, worden de cellen vervolgens door een smal kaliber stompe naald gespoten en onderworpen aan een vries-dooi-cyclus.

Het resulterende lysaat wordt verdeeld over 1,5 ml buisjes en ongeloste cellen en debris worden verwijderd door centrifugatie. Opmerkelijk is dat de grootte van de pellet aanzienlijk is afgenomen na deze centrifugatiestap. De supernatanten van het lysaat worden vervolgens samengevoegd in een 15 ml Falcon-buis en door een 0,45 micrometer filter geleid om eventueel overgebleven debris te verwijderen.

Neem aliquoten van 50 µL van dit lysaat voor verdere analyse. Deze monster wordt aangeduid als monster één. Stap drie, binding aan konijn IgG Aeros.

In deze fase van het protocol worden de proteïne G-tags immunoprecipiteerd met konijn IgG-aros. Om de aros-beads over te brengen, dient het uiteinde van de pipetpunt te worden afgeknipt. Dit helpt om beschadiging van de beads te voorkomen.

Resuspendeer de rabbit IgG aro-oplossing voorzichtig door de fles te schudden voordat de aro's naar een 15 ml buis worden overgebracht. Was de aro's drie keer in gekoelde lysisbuffer en gebruik bij elke stap centrifugatie op lage snelheid om de beads te zuiveren. De gepelletteerde rabbit IgG-beads moeten na centrifugatie zichtbaar zijn.

Verwijder na elke stap voorzichtig de buffer zonder de kralen te verstoren. Wanneer de laatste wasbeurt is voltooid, voegt u het gefilterde en geklaarde lysaat toe aan de ingepakte kralen en incubeert u dit gedurende drie uur of overnight. Dit bij voorkeur bij vier graden C met behulp van een roerapparaat.

Centrifuge na de immunoprecipitatie de agros-beads en verwijder het supernatant voor verdere analyse. Indien nodig kunt u een fijne pipetpunt gebruiken om alle resterende vloeistof uit deze buis te verwijnen. Dit supernatant is monster twee stap vier TEV-protease-splitsing.

In deze stap wordt het lokaas losgekoppeld van de proteïne G-tags. Deze stap maakt de specifieke splitsing van het lokaaseiwit mogelijk, wat in feite een elutiestap is uit de immunoprecipitatie van konijnen-IgG. Bereid het TEV-splitsingsmengsel voor en voeg dit toe aan de beads met behulp van een pipetpunt waarvan de punt is verwijderd; overbreng dit mengsel naar een gesiliconiseerde microcentrifugebuis en keer deze om om de beads in suspensie te brengen vóór incubatie gedurende de nacht bij 4 °C. Neem een aliquot van deze TEV-splitsingsreactie af voor analyse.

Dit is voorbeeld drie. Incubatie gedurende de nacht op de roterende menger moet ervoor zorgen dat de TEV-reactie bijna volledig wordt voltooid. Stap vijf, binding om streptavidine-beads te immobiliseren.

In deze stap worden het Cleve-aas en eventuele bindingspartners door affiniteitszuivering uit de oplossing gehaald. Centrifugeer eerst de TEV-splitsingsreactie die de rabbit IgG aros-beads bevat. Verwijder een OTT van het geklaarde supernatant voor analyse om de aros te pelletteren.

Dit is monster vier. Verwijder voorzichtig al het resterende supernatant, dat uw lokaat-eiwit bevat, naar een nieuwe buis. Gebruik opnieuw een fijne.

Gebruik pipetpuntjes om al het mogelijke supernatant te verwijderen. Bewaar de rabbit IgG aros beads voor verdere analyse. Dit is monster vijf.

Om beschadiging van de strep adin-beads te voorkomen, verwijdert u het uiteinde van een pet-tip. Resuspendeer de beads voorzichtig en breng een alico over naar een gesiliconiseerde buis. Was de strep-beads met S-buffer en klaarden deze op door middel van centrifugatie bij lage snelheid.

Na elke wasbeurt. Verwijder na elke wasbeurt voorzichtig de buffer. Streptavidine-beads zijn zeer klein en kunnen gemakkelijk worden verplaatst, zelfs bij gebruik van fijne pipetten.

Stel de pet-tips samen. Nadat de streptavidine-beads zijn gewassen, voegt u het supernatant van de TEV-splitsingsreactie toe aan deze beads en incubeert u de reactie gedurende drie uur of overnacht bij 4 °C met behulp van een roterende mengmachine.

Centrifugeer na incubatie de streptavidine-beads en verwijder het supernatant. Dit is monster zes. Ter attentie.

Het Beit-eiwit is nu gebonden aan de resterende kraaltjes in de buis. Was de streptavidine-kraaltjes met uw lokaas-eiwit met lysisbuffer. Om eventuele aanvullende contaminerende eiwitten te verwijderen, verwijdert u de resterende wasoplossing van de kraaltjes en laat u deze op ijs staan.

Stap zes, biotine-elutie. In deze stap wordt biotine toegevoegd aan de streptavidine-beads. De interactie tussen de biotine en de streptavidine-beads verdringt het lokaas, dat terugkeert naar de oplossing.

Voeg de biotine-oplossing direct toe aan de beads en keer de buis om om te mengen. Incubeer de reactie gedurende drie uur of overnacht bij vier graden C met gebruik van een roterende mengcentrifuge; centrifugeer het biotine-aeros mengsel en verzamel het mengsel voorzichtig in een nieuwe buis. Dit is uw uiteindelijke EIT, aangeduid als monster zeven.

De resterende strept havein-beads vormen monster acht. Vanwege de lage eiwitconcentratie moet dit laatste eluaat voor analyse worden geconcentreerd. Dit wordt bereikt met behulp van spin-kolommen met een lage moleculaire massa-afsnijwaarde, waarbij het volume door middel van centrifugatie wordt verminderd en het proces regelmatig wordt gemonitord.

Dit geconcentreerde monster kan worden gesplitst en geanalyseerd op SDS-PAGE-gels met Coomassie- en zilverkleuring. Als de monsters via massaspectrometrie moeten worden geanalyseerd, adviseren wij het gebruik van commerciële precast gels. Individuele banden kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en de eiwitten worden geïdentificeerd via massaspectrometrie.

In dit geval was het lokaas muis-EIF voor het E-eiwit. Het voordeel van het tap-systeem is dat u in staat bent om uw eiwit van belang in een specifieke cellijn tot expressie te brengen, en afhankelijk van de cellijn waarin u geïnteresseerd bent, biedt het u ook de mogelijkheid om het eiwit op relatief lage niveaus tot expressie te brengen. U bepaalt dit zelf, waarbij alle post-translationele modificaties en lokalisaties behouden blijven, zodat u vaak het native complex kunt zuiveren.