Name: Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer tandem affinity purification om eiwit-interactiepartners te identificeren met behulp van TAP-tagged eIF4E in HEK 293-cellen. Deze methode maakt efficiënte isolatie van eiwitcomplexen mogelijk voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gefinancierd door een Wellcome Trust Senior Fellowship toegekend aan Dr Ian Goodfellow.

1. Het genereren van cellijnen: pMEP4 transfectie / expressie <ol><li> Transfecteren cellen met de pMEP4 expressievector en selecteer met 100 ug van hygromycine B / ml (Roche) totdat alle schijn-getransfecteerde cellen zijn gedood. De pMEP4 plasmide wordt episomaal dus gehandhaafd hoeft specifieke klonen te isoleren. </li><li> Cellen die de pMEP4 vector kan geïnduceerd worden door behandeling met 10 pM 2 CdCl gedurende 16 uur. Expressie en induceerbaarheid worden bevestigd op kleine schaal voor de amplificatie van de cellijnen. De TAP-gelabeld eiwit kan gemakkelijk worden gedetecteerd als het eiwit G-domeinen te binden aan antilichamen van bijna alle soorten. Voor grootschalige zuiveringen meestal 10 samenvloeiing 175 cm 2 flessen van cellen nodig zijn. Dit komt neer op ongeveer 2 X10 8 tot expressie brengen. </li></ol> 2. Cellysaat bereiding <ol><li> Schraap cellen in PBS en combineren in een 50 ml buis. Spin 1200 x gfen 5 minuten (dit resulteren in 2-3 ml gepakte cellen te beginnen, dat tot op ongeveer 1,5 ml na het wassen). </li><li> Was de cellen drie keer ijskoude PBS (50 ml per keer). </li><li> Lyseren cellen in 5 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 en proteaseremmers ). Let op: NaF, Na 3 VO 4 en protease-remmers dient te worden toegevoegd fris. Pipetteer op en neer 10 keer voordat hij gedurende 5 minuten op ijs. Spuit op en neer 5-10 keer met behulp van een stompe naald voor vertrek weer op ijs gedurende 5 minuten op ijs. Herhaal syringing en laat nog 5 minuten op ijs. </li><li> Twee keer vries-dooi het lysaat (vloeibare N 2 / of droog ijs en ethanol). Sta niet toe dat monster tot meer dan 4 ° C te bereiken Opmerking: u kunt dit monster te bewaren bij -80 ° C tot je tijd hebt om te verwerken. </li><li> Aliquot monster in 1,5 ml buizen en verwijder unlysed cellen en debris door centrifugeren (10 minuten bij 4 ° C, 16.000 x g). </li><li> Recover supernatant, te combineren in een 15 ml Falcon buis en (optioneel) door een 0,45 pm filter passeren voordat u een 20 ul monster voor eiwitrendement kwantificering. Haal nog eens 50 ul aliquot voor verdere analyse (Voorbeeld 1). </li></ol> 3. Binding aan konijnen-IgG-agarose (Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven) <ol><li> Voorzichtig mengen het konijnen-IgG-agarose-oplossing (Sigma-Aldrich) door wervelen fles. Neem 380 ul van IgG agarose (met behulp van een verlaging van 1 ml pipet) en verwijder de scheepvaart / conserveermiddel oplossing door middel van centrifugeren gedurende 1 minuut. Was de agarose driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. De eindopbrengst van agarose moet 250 pi verpakte kralen zijn. </li><li> Voeg de gewist cellysaat van 2,6 (in een 15 ml falcon bade) het gewassen konijnen-IgG agarose Incubeer 3 uur (of overnacht) bij 4 ° C met een roterende menger. </li><li> Spin down van de agarose parels gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant voor verdere analyse (Voorbeeld 2). Opmerking: De TAP-gemerkte eiwit moet nu worden geassocieerd met de kralen. </li></ol> 4. TEV protease decollete (Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 oC gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven) <ol><li> Was de konijnen-IgG agarose parels drie keer in gekoelde lysis buffer (4 ° C) met behulp van centrifugatie om duidelijk te maken (let op: de lysisbuffer mogen geen protease-remmers). Zorg ervoor dat u niet te verwijderen of kralen te verliezen tijdens het wassen stappen. </li><li> Was de korrels nog twee maal met TEV-protease-splitsingsplaats buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, en 0,2% NP-40) met centrifugeren te verduidelijken. Na de laatste wasbeurt verwijder zorgvuldig alle lipond per van de kralen. </li><li> Maak een TEV protease decollete mix, voor elk monster zijn 467,5 ul H 2 O, 25 ui 20x TEV buffer (Invitrogen), 5 pi 0,1 M DTT en 2,5 pl (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Voeg 500 pi van dit mengsel TEV splitsing elk monster van verpakte kralen en dragen de gehele mengsel aan een 1,7 ml pre-gesmeerd buis (Costar). Vóór incuberen verwijderen 30 pl aliquot voor verdere analyse (voorbeeld 3). </li><li> Overnacht incuberen de TEV protease reactie bij 4 ° C met een roterende menger. Merk op dat korte incubatie tijd kan worden afhankelijk van de aard van het lokaas eiwit en de toegankelijkheid van de TEV protease-splitsingsplaats, maar de minimale incubatietijd dient empirisch worden bepaald. </li></ol> 5. De binding aan geïmmobiliseerd streptavidine Plus kralen ULTRALINK (Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven) </p&gt; <ol><li> Centrifugeer de TEV splitsingsreactie met het konijnen-IgG agarose korrels gedurende 5 minuten bij 1200 x g (4 ° C). Verwijder een 20 ui monster van de geklaarde supernatant voor analyse (monster 4) </li><li> Breng de resterende supernatant (ongeveer 480 pi) op ​​een nieuwe 1,5 ml pre gesmeerd buis (Costar) en verlaat deze op ijs. Gooi deze supernatant - dit bevat uw TEV gesplitste aas eiwit en de bijbehorende eiwitten. </li><li> Voeg 500 ul van gekoelde lysis buffer (paragraaf 2.3) om de resterende konijnen-IgG agarose parels en resuspendeer. Centrifugeer dit mengsel aan de parels te verduidelijken alvorens de supernatant en combineren met die in stap 5.2. Laat deze buis op ijs (het moet bevatten nu ~ 980 ul van het monster). </li><li> Bewaar de konijnen-IgG agarose parels voor verdere analyse (Sample 5). Let op: als je dit monster op een SDS-PAGE gel (of western blot) het geeft veel achtergrondinformatie te wijten aan de aanwezigheid van de IgG zware en lichteketens. </li><li> Ondertussen voorzichtig resuspendeer de Ultralink Streptavidine Plus agarose parels (Pierce) geïmmobiliseerd door schudden de fles. Met behulp van een 200 ul pipetpunt met het einde cut, aliquot 70 ul van streptavidine korrels per monster in pre-gesmeerd 1,5 ml buizen en verwijder de scheepvaart / conserveermiddel oplossing door middel van centrifugeren. Opmerking: Deze kralen zijn erg klein en zo &quot;duck-billed&quot; of platte / smalle-ended tips kunnen gebruikt worden om kraal verlies te minimaliseren tijdens het wassen worden. </li><li> Was de streptavidine korrels driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. Dit moet vertrekken ongeveer 45-50 ul van verpakte kralen per buis. </li><li> Breng de TEV-protease-splitsingsplaats supernatant (de 980 pi monster van stap 5.3) van de buis met de gewassen streptavidine kralen en geïncubeerd 3 uur (of overnacht) bij 4 ° C met een roterende menger. </li><li> Spin down van de streptavidine kralen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant voor verdere analyse (SamPLE 6). Was de streptavidine korrels driemaal gekoeld lysis buffer (4 ° C) met centrifugeren te verduidelijken. Na de laatste wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle resterende wasbuffer. </li></ol> 6. Biotine elutie van de streptavidine bindend peptide en proteïne aas (Opmerking: spins worden uitgevoerd bij 1200 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C gedurende 1 minuut, tenzij anders aangegeven) <ol><li> Elueren gemerkte eiwitten van streptavidine kralen door toevoeging van 500 ul PBS: biotine (1 mM D-biotine) en incubatie bij 4 ° C gedurende 3 uur (of een nacht) met een roterende menger. </li><li> Spin down van de streptavidine kralen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant naar een 1,5 ml pre-gesmeerd buis (Let op: dit is uw uiteindelijke steekproef / elutie (Sample 7). </li><li> Nog een 500 ul Biotine: PBS de resterende parels streptavidine en incuberen bij 4 ° C gedurende 2-3 uur (of een nacht) met een roterende menger. </li><li> Returf stap 6.2 en combineren de twee eluties (Sample 7). Deze laatste elutie worden opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> Om de efficiëntie van de biotine elutie te beoordelen, bevriezen de resterende streptavidine kralen en kook later in SDS sample buffer (Sample 8) (aanbevelingen: LaneMarker 5x het verminderen van monsterbuffer van Fisher). </li></ol> 7. Eiwitconcentratie <ol><li> De laatste eluaat (Voorbeeld 7) moet vóór de analyse worden geconcentreerd door de lage eiwitconcentratie en relatief hoge volume. Dit kan bereikt met een laag molecuulgewicht (&lt;5 kDa) Vivaspin rotatie kolommen (Vivascience). Doel het volume ingedampt tot minder dan 100 ul. Dit laatste monster kan worden gekookt en opgeslagen in eiwitmonster buffer (aanbevelingen: LaneMarker 5x het verminderen van monsterbuffer van Fisher). </li></ol> 8. Analyse <ol><li> Monsters 1-8 kunnen worden geanalyseerd met Western blot om de efficiëntie van slopen bepalen. Opmerking: De meeste secundaire antilichamen zalkruisreageren met Proteïne G domeinen van het fusie-eiwit, maar dit wordt verwijderd na TEV protease-splitsingsplaats. </li><li> Voorbeeld 7 kan geanalyseerd worden door 1D en 2D SDS-PAGE. Kleuring kan worden uitgevoerd met zilver of Coomassie (aanbevelingen: SilverQuest Silver kleuring en Colloïdaal Blue Coomassie kleuringskits van Invitrogen). Proteïne-identificatie kan worden uitgevoerd met behulp van massaspectrometrie. </li></ol> 9. Representatieve resultaten Een voorbeeld van 1D SDS-PAGE analyse van het elutie (Voorbeeld 7) van dit protocol naar bindingspartners van TAP gelabeld eIF4E identificeren wordt in figuur 2. Deze vertegenwoordiger gel weerspiegelt de complexe en rijke natuur van eIF4E interacties met andere eiwitten in de cel. Vergelijking met de negatieve controle ook in figuur 2 gegenereerd van een cellijn die alleen TAP tag illustreert de specificiteit van deze eIF4E pull-down lokaas. In dit geval 15% van het geconcentreerde uiteindelijke elutie (monster7) werd geanalyseerd door 1D SDS-PAGE met behulp van in de handel verkrijgbare prefab gradiënt gels alvorens te worden gekleurd met behulp van de Silverquest zilverkleuring kit van Invitrogen. Typisch 50-85% van de resterende geconcentreerde laatste elutie (Sample 7) wordt geanalyseerd met colloïdaal Coomassie vlek (Invitrogen). Monsters (gelstukjes / bands) van de gehele rijbaan werd vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd door massa-spectrometrie. Eiwitten die in de eIF4E pull-down werden gefilterd tegen de bindende partners uit de negatieve controle van niet-specifieke binding partners te identificeren. De geïdentificeerde laatste proteïnen met dit proces TAP labels eIF4E te zien in figuur 2, die representatief is voor de normale eiwitten geïdentificeerd met deze techniek. Daarnaast werden een aantal eIF3 subeenheden ook geïdentificeerd (gegevens niet getoond). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van detandem affiniteitszuivering procedure. De zes stap tandem affinity purification &#39;(TAP)-protocol gaat genereren van cellijnen, cellysis, konijn IgG agarose immuno-precipitatie, TEV protease-splitsing, streptavidine kraal affiniteitszuivering en uiteindelijk biotine elutie. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Tandem affiniteitszuivering van de muis eIF4E eiwit. Interactie partners van de N-terminaal TAP gelabeld eIF4E werden gezuiverd van eukaryotische HEK293 cellen met behulp van de bijgevoegde protocol. Een 20% deel van de uiteindelijke elutie (monster 7) werd geanalyseerd door SDS-PAGE op een geprefabriceerde 4-12% gradiënt gel (TAP eIF4E baan). Een equivalent analyse werd uitgevoerd voor de tag alleen (TAP laan). Eiwitten werden geïdentificeerd met behulp van zilverkleuring. Eiwitten vervolgens geïdentificeerd door massa spectrometrie van hetzelfde monster worden gemarkeerd op deze gel. Afkortingen: eIF4G; eukaryote translatie-initiatie facteur 4 gamma, PABP; polyA bindend eiwit, eIF4A: eukaryote translatie initiatie factor 4 letters, SBP-eIF4e, de overige TAP aas eiwit met de streptavidine bindende peptide gefuseerd met de eukaryote translatie-initiatie factor 4E, 4EBPs; eukaryote translatie initiatie factor 4E bindend eiwitten, eIF4eNiF1l eukaryote translatie initiatie factor 4E nucleaire import factor 1, SBP, de overige streptavidine bindend peptide van het TEV niet-gefuseerde TAP peptide.

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li>
<li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein%2C+NAP1%2C+affects+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li>
<li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li>
<li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep%2FFLAG+%28SF%29-TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li>
<li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP%2FUSP7%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li>
<li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li>
<li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factor+4E%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De TAP labelen techniek hier getoonde toont een zeer specifieke en strenge werkwijze voor het isoleren van de bindingspartners van lokaas eiwitten in eukaryote cellen. Deze benadering kan worden toegepast zowel cellulaire als virale eiwitten. Voor zover ons bekend, is dit de eerste keer dat een dergelijke techniek is toegepast op de translatie-initiatie factor eIF4E. Identificatie van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en de 4EBPs gebruik van deze techniek bevestigt de geldigheid van een dergelijke aanpak. Bovendien is de identificatie van de resterende component van het complex eIF4F, namelijk eIF4A en PABP bevestigt dat onrechtstreekse interactie en tertiaire complexen intact blijven tijdens het zuiveringsproces. De identificatie van meerdere isovormen van de canonieke eIF4e bindende eiwitten was ook duidelijk. Deze zijn in detail beschreven in figuur 2. Met betrekking tot de beperkingen van de aanpak, dienen bepaalde zorg worden ondernomen met betrekking tot de keuzeaas eiwit en of de TAG tag plaatsen op de N-of C-terminus. Het is misschien raadzaam om een ​​functionele test uitvoeren of de lokalisatie van het fusie-eiwit te onderzoeken door middel van microscopisch voorafgaand aan de full scale zuivering om ervoor te zorgen de gelabelde afgeleide functioneel is. Integraal membraan of nucleaire eiwitten kunnen niet zonder meer worden vrijgegeven door de relatief mild voorwaarden beschreven in de lysis stap. Zoals alle immunoprecipitaties en dergelijke pull-down assays kunnen wijzigingen worden aangebracht aan de aard en concentratie van het detergens in de lysisbuffer de efficiëntie van lysis te verhogen. De concentratie van de ionische lysis en wasbuffers kunnen ook worden gemodificeerd te verhogen of verlagen de stringentie van de zuivering. Het is ook mogelijk om de eerste zuivering onder standaard milde omstandigheden (hierboven beschreven) maar vervolgens verdelen streptavidine kralen (punt 5.8) in 4-5 aliquots, dat kan worden gewassen onder meer ionische conomstandigheden. Daardoor kunnen de gebruiker de optimale voorwaarden niet-specifieke interagerende eiwitten verwijderd identificeren. Het gehele proces kan uitgevoerd worden met transiënte transfectie waarbij de interactie partners zijn bekend en de aanwezigheid of afwezigheid bepaald door western blot na alleen. In dit geval zouden we suggereren twee 100cm 2 gerechten van cellen elk getransfecteerd met 8 ng van expressie plasmide. Deze gewijzigde procedure is van bijzonder bij de behandeling van het vermogen van mutant derivaten van de TAP-fusie-eiwit interactie met bekende bindingspartners. Analyseren monsters 1 tot en met 8 op zilver gekleurde SDS-PAGE gels (of western blot als een antilichaam aanwezig) is een goede manier problemen is de techniek niet acceptabele resultaten oplevert. De capaciteit van elke affiniteit gebaseerde neerslag en specifieke elutie kunnen worden geanalyseerd met deze systematische steekproefbenadering. Monsters een tot acht moeten worden genomen tijdens de optimisering van het protocol voor elk nieuw aas. De TAP-tagging techniek biedt een krachtige en robuuste alternatief voor andere benaderingen, zoals GST pull-downs, gist twee-hybride testen, etc. De dubbele affiniteitszuivering en specifieke elutie stappen (TEV decollete en biotine elutie) specificiteit en strengheid te verstrekken aan worden gehandhaafd op een hoog gedurende de zuiveringsprocedure. Kritisch deze techniek kan worden toegepast op elk eiwit en derhalve een goede methode voor het identificeren bindingspartners voor een eiwit doel van belang.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> Konijnen-IgG Agarose </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Proteaseremmer cocktail </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink Geïmmobiliseerde Streptavidine Plus kralen </td><td> Doorboren </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 centrifugale concentrator (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest zilverkleuring kit </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Colloïdaal Blue Coomassie vlekken kit </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml smeermiddel behandelde buizen</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapillaire pipettips </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-Tris gradiënt gels </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x SDS sample buffer </td><td> Visser </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identificatie van eiwit interactie partners met behulp van tandem affinity purification

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Een kritische vaak beperkende stap het begrijpen van de werking van de gastheer en virale eiwitten is de identificatie van interactie cellulaire of viraal eiwit partners. Er zijn vele benaderingen die de identificatie van interagerende partners, waaronder de gist twee-hybride systeem, en pull-down assays met behulp van recombinante eiwitten en immunoprecipitatie van endogene eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie identificatie 1 mogelijk te maken. Recente studies hebben gewezen op het nut van dubbele affiniteit tag gemedieerde zuivering, in combinatie met twee specifieke elutie stappen in de identificatie van interagerende eiwitten. Deze aanpak, aangeduid als Tandem Affinity Purification (TAP), werd aanvankelijk gebruikt in gist 2,3, maar meer recent is aangepast voor gebruik in zoogdiercellen 4-8. Als proof-of-concept hebben we een tandem affinity purification &#39;(TAP) methode met behulp van de goed gekarakteriseerde eukaryote translatie-initiatie factorenTor eIF4E 9,10. De cellulaire vertaling factor eIF4E is een cruciaal onderdeel van de cellulaire eIF4F complex betrokken bij cap-afhankelijke translatie initiatie 10. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde 8. Om de behoefte aan het genereren van klonale cellijnen af ​​te zien, ontwikkelden we een snel systeem dat is gebaseerd op de expressie van het TAP-tag aas eiwit uit een episomaal onderhouden plasmide gebaseerd op pMEP4 (Invitrogen). Expressie van muizen gelabeld eIF4E uit dit plasmide werd gecontroleerd met behulp van de cadmiumchloride induceerbare metallothioneïne promotor. Lysis van de expressie brengen en vervolgens affiniteitszuivering via binding aan rabbit IgG agarose, TEV protease-splitsing, de binding aan streptavidine verbonden agarose en de daarop volgende biotine elutie op de vele eiwitten die blijkbaar eigen aan de eIF4E pull-down (in vergelijking met cellijnen de uiting van de TAP-tag alleen te controleren). De identiteit van de eiwitten werden verkregen door verwijdering van de banden van 1D SDS-PAGE en daaropvolgende tandem massaspectrometrie. De geïdentificeerde componenten die onderdeel zijn van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en 4EBP-1. Ook andere componenten van het complex eIF4F waarvan eIF4E een component geïdentificeerd namelijk eIF4A en Poly-A bindende eiwit. De mogelijkheid om niet alleen bekend directe binding partners en secundaire interagerende eiwitten, te identificeren benadrukt verder het nut van deze aanpak in de karakterisering van eiwitten van onbekende functie.

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Een kritische en vaak beperkende stap in het begrijpen van de functie van gastheer- en virale eiwitten is de identificatie van interagerende cellulaire of virale eiwitten ...

Het algemene doel van deze procedure is om een methode genaamd tandem-affiniteitszuivering te gebruiken om eiwitbindende partners te isoleren. Hallo, ik ben dLAN Bailey van de sectie Virologie aan het Imperial College London. In ons laboratorium werken we aan virus-gastheerinteracties voor verschillende leden van de virusfamilie.Het identificeren van eiwitten die interageren met andere cellulaire of virale eiwitten is een uitstekend startpunt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen het virus en de gastheer tijdens een infectie. In deze video leg ik een benadering uit die we in ons laboratorium gebruiken: tandem affinity purification of tap-tagging. De Tap-tag die in deze studie wordt gebruikt, is een N-terminale tag bestaande uit twee eenheden proteïne G en een streptavidine-bindend peptide.Deze zijn gescheiden door een TEV-protease-splitsingssequentie die specifieke elutie van het lokeiwit mogelijk maakt. In dit voorbeeld bevindt het muis-eIF4E zich aan de C-terminus van dit fusieconstruct. Het TAP-tagging-protocol is een procedure in zes stappen.Na transfectie en het genereren van cellijnen worden de cellen geïnduceerd om het tag-abate-eiwit tot expressie te brengen voordat ze worden gelyseerd in een milde lysisbuffer. Twee affiniteitszuiveringsstappen en twee specifieke oplossingen worden gebruikt om het lokaas en eventuele potentiële interagerende partners te zuiveren om cellijnen te genereren. HEK 293-cellen moeten worden getransfecteerd met de P met vier expressievector die codeert voor.De cellen met het TAP-getagde lokaasteiwit worden vervolgens geselecteerd met 100 µg/ml hygromycine B. Omdat het plasmide episomaal behouden blijft, is het niet nodig om specifieke klonen te isoleren. 10 confluente flessen cellen worden geïnduceerd door behandeling met 10 µM cadmiumchloride gedurende 16 uur, waarna ze in medium worden afgeschraapt. De gesuspendeerde cellen worden vervolgens overgebracht naar 15 mL-buisjes en de cellen worden door centrifugatie gepelleteerd.Deze cellen worden vervolgens drie keer gewassen met ijskoud PBS voordat ze uiteindelijk worden gecentrifugeerd tot een pellet. Stap twee: cellyse. De cellen worden gelyseerd in 5 mL koude lysisbuffer door herhaaldelijk pipetteren, waarna ze vijf minuten op ijs worden bewaard. Om een efficiënte lyse te garanderen, worden de cellen vervolgens door een smalle, stompe naald gespoten en onderworpen aan vries-dooi-cycli.Het resulterende lysaat wordt verdeeld over 1,5 ml buisjes en ongelyste cellen en debris worden door centrifugatie verwijderd. Let op dat de grootte van de pellet na deze centrifugatiestap aanzienlijk is verminderd. De supernatanten van het lysaat worden vervolgens samengevoegd in een 15 ml Falcon-buis en door een 0,45 micrometer filter geleid om eventueel overgebleven debris te verwijderen.Er moeten aliquota's van 50 µL van dit lysaat worden genomen voor verdere analyse. Dit monster wordt aangeduid als monster één. Stap drie, binding aan konijn IgG Aeros.In deze fase van het protocol worden de proteïne G-tags geïmmunoprecipiteerd met rabbit IgG aros. Om de aros-beads over te brengen, dient het uiteinde van de pipetpunt te worden verwijderd. Dit helpt om beschadiging van de beads te voorkomen.Resuspendeer de rabbit IgG-beads voorzichtig door de fles te draaien voordat u de beads overbrengt naar een buis van 15 ml. Was de beads drie keer in gekoelde lysisbuffer en gebruik bij elke stap centrifugatie op lage snelheid om de beads te klaren. De gepelleteerde rabbit IgG-beads moeten na centrifugatie zichtbaar zijn.Verwijder na elke stap voorzichtig de buffer zonder de kraaltjes te verstoren. Voeg na voltooiing van de laatste wasstap het gefilterde en geklaarde lysaat toe aan de gepakte kraaltjes en incubeer dit gedurende drie uur of een nacht. Bij voorkeur gebeurt dit bij vier graden C met gebruik van een roterende mengmachine.Centrifuge na de immunoprecipitatie de agros-beads en verwijder het supernatant voor een daaropvolgende analyse. Indien nodig kunt u een fijne pipetpunt gebruiken om alle resterende vloeistof uit deze buis te verwijderen. Dit supernatant is monster twee stap vier TEV-protease splitsing.In deze stap wordt de bait losgekoppeld van de proteïne G-tags. Deze stap maakt specifieke splitsing van het bait-eiwit mogelijk, wat in feite een elutiestap is uit de rabbit IgG-beads immunoprecipitatie. Bereid het TEV-splitsingsmengsel en voeg dit toe aan de beads met behulp van een pipetpunt waarvan het uiteinde is verwijderd; overbreng dit mengsel naar een gesiliconiseerde microcentrifugebuis en keer deze om om de beads in suspensie te brengen voorafgaand aan de incubatie gedurende de nacht bij 4 °C. Neem een aliquot van deze TEV-splitsingsreactie af voor analyse.Dit is monster drie. Incubatie gedurende de nacht op de roterende mixer zou de TEV-reactie tot bijna volledige voltooiing moeten laten verlopen. Stap vijf, binding om streptavidine-beads te immobiliseren.In deze stap worden het Cleve-aas en eventuele potentiële bindingspartners affiniteitsgezuiverd uit de oplossing. Centrifugeer eerst de TEV-splitsingsreactie die de rabbit IgG aros-beads bevat. Verwijder een OTT van het geklaarde supernatant voor analyse om de aros-beads te pelletteren.Dit is monster vier. Verwijder voorzichtig al het resterende supernatant, dat uw lokaisteiwit bevat, naar een nieuwe buis. Gebruik hiervoor opnieuw een fijne tip.Gebruik pipetpuntjes om al het mogelijke supernat remove. Bewaar de rabbit IgG aros beads voor latere analyse. Dit is monster vijf.Om beschadiging van de strep-avidin-beads te voorkomen, verwijdert u de punt van een pipetpunt. Resuspendeer de beads voorzichtig en breng een aliquot over naar een gesiliconiseerde buis. Was de beads die strep bevatten met S-buffer en klaarlen deze door middel van centrifugatie bij lage snelheid.Na elke wasbeurt. Verwijder na elke wasbeurt voorzichtig de buffer. Streptavidine-beads zijn zeer klein en kunnen gemakkelijk worden verplaatst, zelfs bij gebruik van een fijne pipetpunt.Bereid de pet-tips voor. Nadat de streptavidine-beads zijn gewassen, voegt u het supernatant van de TEV-splitsingsreactie toe aan deze beads en laat u de reactie drie uur of overnacht incuberen bij 4 °C met behulp van een roterende mengmachine.Centrifugeer na incubatie de streptavidine-beads en verwijder het supernatant. Dit is monster zes. Ter informatie.Het Beit-eiwit is nu gebonden aan de resterende kraaltjes in de buis. Was de streptavidine-kraaltjes die uw lokaas-eiwit bevatten met lysisbuffer. Om eventuele overige contaminerende eiwitten te verwijderen, verwijdert u de resterende wasoplossing van de kraaltjes en bewaart u deze op ijs.Stap zes, biotin-elutie. In deze stap wordt biotine toegevoegd aan de streptavidine-beads. De interactie tussen biotine en de streptavidine-beads verdringt het aas, waardoor dit terug in de oplossing gaat.Voeg de biotinoplossing direct toe aan de beads en keer de buis om om te mengen. Incubeer de reactie drie uur of overnight bij vier graden C met behulp van een roterende mengcentrifuge, meng de biotin aeros-mix en verzamel het mengsel zorgvuldig in een nieuwe buis. Dit is uw uiteindelijke EIT, aangeduid als monster zeven.De resterende strept havering-beads zijn monster acht. Vanwege de lage eiwitconcentratie moet dit laatste eluaat vóór de analyse worden geconcentreerd. Dit wordt bereikt met behulp van spin-kolommen met een laag moleculair gewicht (cut-off), waarbij het volume door centrifugatie wordt verminderd en het proces regelmatig wordt gemonitord.Dit geconcentreerde monster kan worden gesplitst en geanalyseerd op SDS-PAGE-gels met Coomassie- en zilverkleuring. Als de monsters via massaspectrometrie worden geanalyseerd, adviseren wij het gebruik van commerciële gegoten gels. Individuele banden kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en de eiwitten via massaspectrometrie worden geïdentificeerd.In dit geval was het lokaas muis-EIF voor het E-eiwit. Het voordeel van het TAP-systeem is dat u de mogelijkheid heeft om uw eiwit van interesse in een specifieke cellijn te tot expressie te brengen en, afhankelijk van de cellijn waarin u geïnteresseerd bent, biedt het u ook de mogelijkheid om het eiwit op relatief lage niveaus tot expressie te brengen, indien u dat wenst, waarbij alle posttranslationele modificaties en lokalisaties behouden blijven, zodat u vaak het oorspronkelijke complex kunt zuiveren.

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Leer tandem affinity purification om eiwit-interactiepartners te identificeren met behulp van TAP-tagged eIF4E in HEK 293-cellen. Deze methode maakt efficiënte isolatie van eiwitcomplexen mogelijk voor virologisch onderzoek.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Meer video's verkennen