Name: De CYP2D6 Animal Model: Hoe kan ik auto-immune hepatitis induceren in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer hoe je een muismodel voor auto-immuun hepatitis ontwikkelt met adenovirus-expressie van CYP2D6. Deze methode bootst chronische leverontsteking na en helpt onderzoekers bij het bestuderen van ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door het Goethe-University Hospital Frankfurt en een subsidie ​​van het Duitse Research Foundation naar UC

1. Intraveneuze injectie van Ad-2D6 in de oogheelkundige sinus <ol><li> Onder steriele omstandigheden, verdunnen de Ad-2D6 virus stockoplossing aan een concentratie van 5 x 10 9 pfu / ml in RPMI en de Ad-2D6 virusoplossing op ijs houden. Injectie van twee doses van 5 x 10 8 pfu (intraveneuze en intraperitoneale) heeft bewezen te resulteren in de meest betrouwbare uitkomst van autoimmune hepatitis in muizen van de FVB stam. </li><li> Verdoof muis met 4% isofluraan in een anesthesie kamer. Knijp het achterbeen om te controleren of het dier onder narcose is. </li><li> Houd de muis door de achterkant van de nek en draai de losse huid van het hoofd met duim en middelvinger. Zoals dit, het oog steekt iets door de tractie aan de huid naast het oog. </li><li> Verticaal Plaats de naald in de mediale ooghoek (kruising van de oogleden die het dichtst bij de neus van het dier) en injecteer langzaam 100 ul van Ad-2D6 virus oplossing. Het is belangrijk niet van toepassing teveel druk, naarvoorkomen dat schade aan de schepen en de luchtpijp. </li><li> Langzaam trekken de naald om morsen te voorkomen en de oogleden te sluiten. </li><li> Injectie werkt goed als het virus oplossing niet lekken via de neus en het oog glijdt terug naar de beginpositie. </li><li> Onmiddellijk na de intraveneuze injectie, voert u een standaard intraperitoneale injectie van de tweede 100 pi van de Ad-2D6 virus oplossing. </li></ol> Alternatief kan de intraveneuze injectie worden uitgevoerd via de staartader. Echter, injectie via de oogheelkundige sinus is veel gemakkelijker uit te voeren om en minimaliseert het verlies van het virus oplossing. Het is aangetoond dat deze twee technieken gebruikt kunnen worden uitwisselbaar en dat beide routes zijn even effectief 10. Geïnfecteerde muizen worden gecontroleerd op bijwerkingen en de duidelijke tekenen van lijden en pijn, zoals verlies van eetlust, gewichtsverlies, verlies van mobiliteit, het niet bruidegom, ruwe vacht, gebogenuiterlijk, maar ook likken, bijten, krabben, of het schudden van een bepaald gebied (dwz plaats van de injectie). Hoewel de muizen vertonen een enorme schade aan de lever in het CYP2D6-model, de muizen lijken gezond en vertonen geen tekenen van lijden, pijn of stress. Toch zijn de indicatoren van ernstige leverfalen, zoals serum aminotransferasen bepaald op regelmatige basis of deel uitmaken van de uitgevoerde experimenten. Serum aminotransferasespiegels van&gt; 1000 U / l mag alleen verschijnen als een direct gevolg van de virus-infectie, maar niet chronisch. Als het serum aminotransferasespiegels zijn chronisch van meer dan 1000 U / l (limiet ernst) de muizen worden opgeofferd. 2. Muis bloedingen in het oog <ol><li> Verdoof muis met 4% isofluraan in een anesthesie kamer. Knijp het achterbeen om te controleren of het dier onder narcose is. </li><li> Houd de muis door de achterkant van de nek en draai de losse huid van het hoofd met duim en middelvinger. Zo, het oog steekt iets uit doorde tractie aan de huid naast het oog. </li><li> Plaats de open zijde van het capillair op de lagere of de binnenhoek van het oog en voorzichtig maar stevig gleed naast de oogbol om de oogheelkundige veneuze sinus. De veneuze haarvaten scheuren en de daaruit voortvloeiende bloeding vult de orbitale holte. </li><li> Iets te trekken van de capillaire buis tot aan de punt te bevrijden, zodat de opgehoopte bloed wordt getrokken in de buis. </li><li> Wanneer genoeg bloed wordt verzameld, wordt de buis ingetrokken en de oogleden gesloten. Bleeding stopt na een intrekking van de buis en herstel van de normale oculaire druk op de veneuze complex. </li><li> Bloed in de capillair wordt overgebracht naar een Microtainer buis en geïncubeerd 30 min op ijs. </li><li> De Microtainer buis wordt gecentrifugeerd bij 7500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. </li><li> De supernatant komt overeen met de serum dat getransporteerd wordt naar een nieuwe buis en opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> Serum kan worden gebruikt om antilichaam titer bepalen ELISA. Indicaren van leverschade, zoals de serumspiegels van de leverenzymen alanine aminotransferase (ALT / GPT) en aspartaat aminotransferase (AST / GOT) kan worden beoordeeld met behulp van de bijbehorende teststrips van Roche Diagnostics (Mannheim, Duitsland) en een Reflotron Plus Analyzer ( Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). </li></ol> Als alternatief kan bloedafname gedaan worden via de staartader of via de oppervlakkige tijdelijke ader 11. 3. Muis leverperfusie Opmerking: Deze stap is belangrijk om te voorkomen dat een besmetting van geïsoleerde lever lymfocyten door bloed-lymfocyten <ol><li> Euthanaseren de muis door dodelijke doses van CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Monteer het dier liggend op zijn rug op het piepschuim bord. Gebruik 23 G naalden tot het uiterste pin. </li><li> Bevochtig en desinfecteer de muis met 70% EtOH </li><li> Ongeveer 1 cm uit de buurt van achterpoten, een insnijding maken door middel vande huid en de spierlaag. Op Knippen in beide zijden van het dier werken tot het middenrif. </li><li> Wanneer het membraan wordt bereikt, de huid kan naar achteren worden geklapt. </li><li> Snijd het membraan uit de buurt van de rips knip dan de vena cava. </li><li> Verplaats de maag en de darmen aan de zijkant, waardoor de poortader. </li><li> In de poortader insert een 27 G naald aangesloten op een 5 ml injectiespuit gevuld met koude PBS. Laat de PBS langzaam het bloed spoelen van de lever. </li><li> Ontleden van de lever door te pakken op het middenrif en het snijden van het middenrif uit de buurt van het lichaam. </li><li> Breng de lever om een ​​petrischaaltje en verwijder het middenrif, de galblaas en de andere weefsels nog steeds verbonden met de lever </li><li> Breng de lever om 10 ml PBS in een 50 ml tube op ijs of insluiten in OCT compound. </li></ol> 4. Isolatie van de lever lymfocyten <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen: <ul><li> Collagenase IV voorraad (100 mg / ml) in PBS. (Maak kleine porties en bewaar bij -20 ° C). </li><li> DNase voorraad (25 mg / ml) in PBS. (Maak kleine porties en bewaar bij -20 ° C). </li><li> Collagenase buffer: PBS bevattende 0,2 mg / ml collagenase IV, 0,02 mg / ml DNase en 5% FCS; voor 1 lever, meng 9,5 ml ijskoude PBS, 20 ul collagenase IV (100 mg / ml stock), 8 pi DNase ( 25 mg / ml stock), en 500 pi hitte-geïnactiveerd FCS. </li><li> 35% Percoll, meng 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS voorraad; 305 ml PBS. </li><li> RPMI volledige = RPMI bevattende 10% hitte geïnactiveerd FCS, 100 μ / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine. </li></ul></li><li> Breng de geperfundeerde lever (zie hoofdstuk 3) tot 10 ml vers PBS in een petrischaal op ijs en in kleine stukjes gesneden met een schaar. </li><li> Over in een 70 pm cel zeef en squeeze lever jonken door met een glas stamper of een stamper van een 2 ml spuit. Voeg voorzichtig 10 ml koud collagenase buffer endrukt u op door middel van zeef. Verzamel schorsing en filtreer door zeef twee keer meer. </li><li> Overdracht schorsing in de frisse 50 ml buis op ijs. Volgende verwerken lever. </li><li> Incubeer lever celsuspensie bij 37 ° C gedurende 60 min, meng voorzichtig elke 15 min. </li><li> Centrifugeer bij 30 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant naar een nieuwe buis, waardoor 5 mm vloeistof erboven pellet </li><li> Centrifugeer bij 650 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant en laat 3 mm boven de pellet </li><li> Resuspendeer pellet in 20 ml Percoll buffer </li><li> Centrifugeer bij 600 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant af en resuspendeer pellet door de knop de buis. </li><li> Was de pellet 1 x met PBS. </li><li> Was de pellet 1 x met RPMI compleet </li><li> Hersuspenderen pellet in 3 ml RPMI voltooien en tellen cellen in een 1:10 verdunning. </li><li> Hersuspenderen cellen op ~ 10 7 cellen / ml in RPMI te vullen en over te dragen buis in ijs. </li></ol&gt; 5. Intracellulaire cytokine kleuring (ICCS) 5,1 Stimulatie: <ol><li> Bereid lever lymfocyten bij ~ 10 7 cellen / ml in RPMI volledig zoals beschreven. Plaat 100 pi (10 6 cellen) / well tot een plat 96-well plaat die niet weefselkweek behandeld. </li><li> Voeg 50 ul RPMI te voltooien met 2μg/ml Brefeldin A en voeg 50 ul RPMI compleet met 2 ug / ml het stimuleren van CYP2D6 peptide (dwz de immunodominante CD4 epitoop CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 of de immunodominante CD8 epitoop CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Meng door pipetteren. </li><li> Incubeer 5 uur bij 37 ° C (optimale stimulatie tijd maar overnacht incubatie werkt ook). </li></ol> 5.2. Kleuring: <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen: <ul type="disc"><li> FACS buffer: PBS bevattende 1% foetaal kalf sErum (FCS). </li><li> Fixatie / permeabilisatie buffer: FACS buffer die 0,1% saponine en 4% paraformaldehyde </li><li> FACS / saponine wasbuffer: FACS buffer die 0,1% saponine </li><li> FACS / PFA buffer: FACS buffer met 1% paraformaldehyde (PFA) </li></ul></li><li> Overdracht cellen in V-bodem microtiterplaat (96-well) en spin op 460 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Gooi medium en vortex plaat </li><li> Voeg 150 ul FACS buffer en centrifugeer op 460 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Gooi medium en vortex plaat. Herhaal stap te wassen. </li><li> Block oppervlak FcR indien nodig (bij gebruik secundaire antilichamen) met 1 ug / ml αCD16/32 cocktail (FcR blok) in FACS buffer gedurende 15 min bij 4 ° C en wassen 2 x met 150 ul kleuring buffer (460 xg gedurende 2 min bij 4 ° C). </li><li> Stain voor oppervlaktemoleculen: dwz Anti-CD8a-FITC mAb 10 pg / ml in 50 pi FACS buffer voor 30 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Voeg 100 ul FACSbuffer en spin op 460 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Was cellen 2 x met 150 ul FACS buffer (460 xg; 3 min; 4 ° C). Vortex plaat. </li><li> Fix / permeabilize cellen met 100 ul fixatie / permeabilisatie buffer gedurende 10 min bij RT. </li><li> Spin op 460 xg gedurende 7 min bij 4 ° C. Merk op dat het belangrijk is om de centrifugeertijd te breiden tot 7 min, aangezien de fixatie / permeabilzation stappen verandert de totale dichtheid van de cellen. Vortex plaat. </li><li> Was 2 x met 150 ul FACS / saponine wasbuffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plaat. </li><li> Stain voor intracellulaire moleculen: dwz Anti-IFNy-PE mAb 10 pg / ml in 50 ul FACS / saponine wasbuffer voor 30 min bij 4 ° C. </li><li> Voeg 100 ul FACS / saponine wasbuffer en spin op 460 xg gedurende 7 min bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen 2 x met 150 ul FACS / saponine wasbuffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plaat. </li><li> Was de cellen 1 x met FACS buffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plaat. </li&gt; <li> Hersuspenderen cellen in 200 ul FACS / PFA buffer, overdracht buizen, en bewaar bij 4 ° C in het donker totdat verwerving van gegevens door flowcytometrie. We normaal gesproken gebruik maken van een FACSCanto II of een FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland). </li></ol> 6. Immunohistochemie 6.1. H &amp; E kleuring voor de beoordeling van de algemene lever pathologie: <ol><li> Harvest lever, onderdompelen in Tissue-Tek LGO in een wegwerp basis mal en snel-vries op droog ijs. </li><li> Snijd 7 urn leverweefsel secties met een Leica cryostaat ingesteld op -17 ° C en monteer het weefsel secties over Superfrost Plus objectglaasjes. Store dia&#39;s bij -20 ° C tot verder gebruik. </li><li> Fix cryosecties in pre-gekoelde EtOH voor 15 min bij -20 ° C. Even laten drogen gedurende 10 minuten. </li><li> Was 2 x in gedestilleerd water gedurende 2 min bij kamertemperatuur (de volgende stappen, 6.1.5 - 6.1.13, worden uitgevoerd bij kamertemperatuur). </li><li> Vlek in Meyer&#39;s Hematoxylin oplossing voor8 min. </li><li> Was in warm (30 ° C) leidingwater gedurende 10 minuten. Verander het water een paar keer. </li><li> Spoel in gedistilleerd water. </li><li> Spoel ze in 95% EtOH voor 20 sec. </li><li> Achtergrondkleuring in Eosin G / Y oplossing gedurende 40 sec. </li><li> Dehydrateer 2 x in 95% EtOH gedurende 5 minuten per incubatie. </li><li> Dehydrateer 2 x in 100% EtOH gedurende 5 minuten per incubatie. </li><li> Maak in xyleen 2 x 5 minuten per clearing. </li><li> Monteer in de Roti-Histokitt. </li></ol> 6.2. Immunohistochemie voor collageen I depositie: <ol><li> Harvest lever, onder te dompelen in Tissue-Tek oktober in een wegwerp basis mal en snel-vries op droog ijs. </li><li> Snijd 7 urn leverweefsel secties met een Leica cryostaat ingesteld op -17 ° C en monteer het weefsel secties over Superfrost Plus objectglaasjes. Store dia&#39;s bij -20 ° C tot verder gebruik. </li><li> Bevestig vriescoupes in koude EtOH gedurende 15 minuten bij -20 ° C. Even laten drogen gedurende 10 minuten. </li><li> Was 2 x in PBS gedurende 2 min bij kamertemperatuur. </li> &lt;li&gt; Incubate in PBS die 0,3% H 2 O 2 en 0,1% Na-azide voor 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was 2 x in PBS gedurende 2 min bij kamertemperatuur. </li><li> Blokkeer met een avidine-biotine blokkeren kit volgens richtlijnen van de fabrikant. </li><li> Blokkeer met 10% FCS in PBS (FCS / PBS) voor 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> De primaire antilichaam is een konijn anti-muis collageen I antilichaam dat 1:200 wordt verdund in 10% FCS / PBS. Incubeer secties met primair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was secties 3 x in PBS voor 4 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun gebiotinyleerde anti-konijn antilichaam tot 1:500 en incubeer met de secties gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was secties 3 x in PBS voor 4 min bij kamertemperatuur. </li><li> Color reactie wordt verkregen door sequentiele incubatie met avidine-peroxidaseconjugaat en diaminobenzidine-waterstofperoxide volgens de fabrikant richtsnoeren. </li><li> Achtergrondkleuring in Meyer&#39;s Hijmatoxylin oplossing voor 5 min, wassen 2 x in PBS gedurende 2 min bij kamertemperatuur en monteer in Aquatext. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Infectie van muizen met Ad-2D6 geïnduceerde twee verschillende stadia van de schade aan de lever. In de eerste dagen na de infectie, virusinfectie van de lever veroorzaakt een acute stijging van de serum aminotransferasespiegels, een indicator van de hepatocyt de dood 6. Deze eerste, acute fase treedt onafhankelijk van de expressie van hCYP2D6 en kan ook worden waargenomen na infectie met een lege control virus (Ad-Control) of een virus expressie groene fluorescentie proteïne (Ad-GFP). In daarentegen de tweede fase is autoimmuun-gemedieerde en afhankelijk op de expressie van het trekkersysteem molecule hCYP2D6. Deze auto-fase treedt binnen 2-4 weken na de infectie en blijft enkele maanden 6. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig1.jpg" /> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Figuur 1. De CYP2D6 model. Wildtype FVB of C57BL / 6 muizen geïnjecteerd met twee doses van Ad-2D6 (intraveneuze en intraperitoneale). In een tijd van belang de lever en de serum worden verzameld en beoordeeld op leverletsel en vorming van hCYP2D6-specifieke antilichamen en T cellen. De volgende functies zijn karakteristiek voor de aanhoudende auto-immune hepatitis ontwikkelen na de Ad-2D6-infectie van wildtype FVB of C57BL / 6 muizen in de CYP2D6 model: Ten eerste, de lever toont een afwijkend veranderde morfologie. Met name de lever lobben zijn versmolten, hyperplastische knobbeltjes verschijnen verspreid over het gehele lever en een massale capsulaire fibrose zichtbaar is (figuur 2). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig2.jpg" /> Figuur 2. Lever morfologie. Typische Ad-2D6-geïnduceerde leverschade zoals gedetecteerd in week 4 na infectie. Merk op dat de individuele lever lobben zijn gefuseerd (pijlpunten). Hyperplastische knobbeltjes verschijnen verspreid over de gehele lever (pijlen). Infectie met een controle adenovirus niet tot expressie hCYP2D6 heeft geen effect op de lever morfologie. Ten tweede, uitgebreide en hardnekkige cellulaire infiltraties in de peri-portaal en parenchymcellen regio&#39;s van de levers van Ad-2D6-infectie, maar niet Ad-Control-geïnfecteerde muizen (figuur 3A). Fibrosis ontwikkelt overwegend subcapsulaire regio met enkele collageenbundels uitsteken in het parenchym (figuur 3B). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig3.jpg" /> Figuur 3. Leverhistologie A:. H &amp; E kleuring van leverweefsel deel van FVB muizen geïnfecteerd met een Ad-Control of Ad-2D6 in week 4 na de infectie. Merk op dat significant infiltraties van mononucleaire cellen slechts aanwezig in Ad-2D6 geïnfecteerde muizen (enkele pijlen). Triple pijlen geven aan grotere cellulaire infiltraties in de lever parenchym overbruggen tussen naburige portal traktaten. B: Immunohistochemische vertegenwoordiging van leverfibrose in week 4 na infectie met Ad-2D6 of Ad-controle. De lever secties zijn gekleurd voor collageen gebruik van een anti-collageen I antilichaam. Opmerking meerdere laagje collageen dispositie onder de lever capsule (triple pijlen) met enkele bundels uitsteken in het parenchym (single pijlen) en de aanwezigheid van grote clusters van infiltrerende cellen (pijlpunten). Twee representatieve leversecties worden weergegeven voor elke voorwaarde. Maat bars: 100 urn. Een derde functie is het genereren van hoge titers van anti-CYP2D6 antilichamen, die een soortgelijke epitoop specificiteit voor de menselijke LKM-1-antilichamen 6,13 te hebben. Last, hCYP2D6-specifieke CD4-en CD8 T-cellen zijn die voornamelijk thuis gegenereerd naar de lever. Dergelijke hCYP2D6-specifieke T cellen kan worden gedetecteerd door stimulatie met immunodominant hCYP2D6 peptiden en gevolgd door meting van IFNy expressie door een intracellulaire cytokine kleuring (ICCS) (figuur 4). hCYP2D6-specifieke CD8 T-cellen te doden Ad-2D6-geïnfecteerde doelcellen in vivo 12. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig4.jpg" /> Figuur 4. hCYP2D6-specifieke T cellen. Flowcytometrische analyse van hCYP2D6-specifieke T cellen. Lever lymfocyten zijn geïsoleerd in week 4 na Ad-2D6-infectie en werden gestimuleerd met ofwel de immunodominante CD4 of CD8 hCYP2D6 epitoop &#39;s nachts. Generation van IFNy werd gedetecteerd door intracellulaire cytokine kleuring en geanalyseerd door flow cytometrie behulp van een FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland). Het percentage hCYP2D6-specifieke CD4 en CD8 cellen is geïndiceerd.

<ol><li>Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.</a> Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).</li>
<li>Czaja, A. J., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Diagnosis%2C+Pathogenesis+and+Management+of+Autoimmune+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis.</a> Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">New animal models for autoimmune hepatitis.</a> Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).</li>
<li>Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models for autoimmune hepatitis.</a> Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of autoimmune hepatitis.</a> Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Holdener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+to+the+natural+human+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+by+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection.</a> J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).</li>
<li>Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKM-1+autoantibodies+recognize+a+short+linear+sequence+in+P450IID6%2C+a+cytochrome+P-450+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase.</a> J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).</li>
<li>Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+human+cytochrome+P-450db1+in+autoimmune+hepatitis+type+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).</li>
<li>von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+autoimmunity%3A+making+the+barren+field+fertile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile.</a> Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Forbes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morbidity+and+mortality+rates+associated+with+serial+bleeding+from+the+superficial+temporal+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).</li>
<li>Ehser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+rather+than+identity+beaks+T+cell+tolerance+in+the+CYP2D6+mouse+model+for+human+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+of+the+anti-CYP2D6+antibody+response+in+patients+with+autoimmune+hepatitis+and+in+the+CYP2D6+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model.</a> J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Ando, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cytotoxic+T+lymphocytes+are+directly+cytopathic+for+their+target+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo.</a> J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).</li>
<li>Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+regulation+of+autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis.</a> Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).</li>
<li>Limmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+induce+organ-specific+autoimmunity+by+breaking+of+tolerance%3A+importance+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment.</a> Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).</li>
<li>Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break+of+T+cell+ignorance+to+a+viral+antigen+in+the+liver+induces+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis.</a> J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).</li>
<li>Derkow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+priming+of+CD8+and+CD4+T-cells+in+animal+models+of+autoimmune+hepatitis+and+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis.</a> Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).</li>
<li>Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+type+2+autoimmune+hepatitis%3A+Xenoimmunization+with+human+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens.</a> Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).</li>
<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
<li>Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+exhaustion+and+deletion+of+CTL+following+immunization+with+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus.</a> J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).</li>
<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In voorgaande studies werd experimentele hepatitis vaak naar verluidt slechts van voorbijgaande aard en veel van de huidige modellen voor auto-immuun leverziekten zijn afhankelijk van een vrij complexe ziekte inductie protocollen (voor reviews zie 3,5). Bijvoorbeeld diverse modellen gebruiken transgene muizen expressie van specifieke doel-antigenen en adoptief getransfereerd doelantigeen-specifieke, meestal TcR-transgene, T cellen 14,15. Vaak een extra infectie met livertropic virussen, bacteriën of parasieten noodzakelijk is ziekte 16-18 induceren. Alternatief wordt DNA-vaccinatie met plasmiden coderen voor target antigenen, met inbegrip CYP2D6 19, gebruikt om hepatitis induceren. Wordt echter een additionele vaccinatie met Plasmiden coderen voor pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-12, 20 vereist. Helaas, op enkele uitzonderingen na 15,20 hepatitis is slechts van voorbijgaande aard. Het CYP2D6-model 6,21 maakt gebruik van een eenvoudige methode to veroorzaken auto-immune hepatitis door simpelweg te infecteren muizen met een adenovirus in hCYP2D6, de belangrijkste autoantigeen in AIH-2 7,8. Levering van CYP2D6 door een adenovirus constructie staat garant voor zowel een directe targeting van de lever en een lokale ontsteking die de afbraak van tolerantie bevordert. Het is echter belangrijk op constateren dat zowel het virus titer evenals de route van toediening is daarbij cruciaal model. Enerzijds, Ad-2D6 is een replicatie deficiënt virus dus een voldoende hoog titer van virus wordt noodzakelijk om een ​​kritische hoeveelheid antigeen genereren binnen de lever. Anderzijds, zullen het ook hoge titer resulteren in een fataal acuut leverfalen. In Bovendien is al eerder aangetoond dat infecties van muizen door hoge titers van adenovirus leidt tot een functionele uitputting van de immuunrespons 22. In ons model, gebruikten we een combinatie van intraveneuze en intraperitoneale infectie teneinde zowel chronische cellulaire infiltratie alsmede ext verkrijgenensive fibrose. Wij hebben geconstateerd dat intraveneuze besmetting alleen nog steeds enorme cellulaire infiltratie veroorzaakt, maar geen fibrose van de subcapsulaire regio, waaruit blijkt dat peritoneale ontsteking als gevolg van de intraperitoneale injectie zou kunnen worden betrokken bij de continue subcapsulaire ophoping van collageen (Hintermann &amp; Christen, manuscript in voorbereiding). Het is echter belangrijk op te merken dat de waargenomen leverfibrose is antigeen-specifieke, want we hebben de activering van leverstellaatcellen en collageen depositie niet detecteren na infectie met gelijke virus-titers van Ad-GFP of Ad-Control 23. De CYP2D6 model weerspiegelt een groot aantal aspecten van het menselijk AIH 1,2, zoals chronische hepatitis gekarakteriseerd door aanhoudende cellulaire infiltratie en leverfibrose 6. In Bovendien, de aanwezigheid van hoge-titer anti-CYP2D6 antilichamen met soortgelijke epitoopspecificiteit en verspreiding 13 tot LKM-1-antilichamen gevonden in AIH-2 patiënten geeft de prewezigheid van een veel voorkomende chronische auto-immune reactiviteit. CYP2D6 is de belangrijkste antigeen in AIH-2, maar het wordt niet herkend door patiënten met de meer voorkomende type 1 AIH. Bovendien kunnen patiënten die lijden aan andere leverziekten met een auto-etiologie, zoals primaire biliaire cirrose (PBC) of primaire scleroserende cholangitis (PSC), het genereren van keurmerk auto-antistoffen met specificiteit voor verschillende lever autoantigenen en hun levers tonen verschillende pathologische kenmerken, gericht op kleine (PBC ) of grote (PSC) galwegen. Toch is het CYP2D6-modellen biedt de mogelijkheid om immunopathogenic mechanismen die betrokken zijn bij chronische lever-inflammatoire processen die optreden bij auto-immuun leverziekten, om de belangrijkste spelers die de auto-immune vernietiging van hepatocyten te rijden en om mogelijke therapeutische interventies te evalueren om de ziekte te genezen te identificeren analyseren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Benaming van het apparaat </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 23G naald </td><td> BD Biosciences </td><td> 300800 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ G naald </td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ½ G naald </td><td> BD Biosciences </td><td> 304000 </td><td></td></tr><tr><td> Alanine aminotransferase teststrips (GPT / ALT) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td> Aspartaat aminotransferase teststrips (GOT / AST) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td> Anesthesie Unit Univentor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnTho&#39;s</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base mallen, wegwerp 37x24x10 mm </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td> Cell filter 70mm </td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica </td><td> CM1850 UV- </td><td></td></tr><tr><td> Gehepariniseerde capillairen </td><td> Visser </td><td> 3123987 </td><td></td></tr><tr><td> Objectglaasjes Superfrost Plus </td><td> Menzel Gläser </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SST buizen </td><td> BD Biosciences </td><td> 365951 </td><td></td></tr><tr><td> Microtiter platen, V-bottom </td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotron Plus </td><td> Roche Diagnostics </td><td></td><td> Determiniation van serum AST / ALT </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Naam of het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Rabbit anti-muis anti-Collagen type I IgG, </td><td> Chemicon </td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td> Gebiotinyleerde geit anti-konijn IgG </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-geconjugeerd anti muis CD8a antilichaam </td><td> Zuid-Biotech </td><td> 1550-1502 </td><td></td></tr><tr><td> PE-geconjugeerd anti-muis antilichaam IFNy </td><td> BD Biosciences </td><td> 554412 </td><td></td></tr><tr><td> PE-geconjugeerd anti-muis CD16/CD32 antilichaam (FcR blok) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatext </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Avidine / biotine blokkeren kit </td><td&gt; Vector (AXXORA) </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> Brefeldin A </td><td> Sigma </td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> Sigma </td><td> C5138-100mg </td><td></td></tr><tr><td> DAB-substraat kit 3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td> Elite ABC Reagens </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine G / Y-oplossing </td><td> Roth </td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum (FCS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Meyer&#39;s Hematoxylin oplossing </td><td> AppliChem </td><td> A4840, 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Compound </td><td> Sakura Finetek Europa </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-gebufferde formaldehyde 10% </td><td> Roth </td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Amersham </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> Roti-Histokit </td><td> Roth </td><td> 6638.1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td><td></td></tr><tr><td> Saponine uit quillaja schors </td><td> Sigma </td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

de cyp2d6 animal model: hoe kan ik auto-immune hepatitis induceren in muizen

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Auto-immune hepatitis is een zeldzame maar levensbedreigende auto-immuunziekte van de lever van onbekende etiologie 1,2. In het verleden vele pogingen zijn gegeven aan een dier model dat de kenmerken van de menselijke ziekte 3-5 weerspiegelt genereren. Echter, in verschillende modellen de inductie van ziekte vrij complex en vaak hepatitis was slechts voorbijgaande 3-5. Daarom hebben we een eenvoudige muis model dat de belangrijkste menselijke autoantigeen gebruikt bij type 2-auto-immuun hepatitis (AIH-2), namelijk hCYP2D6, als een trigger 6. Type 1 lever-nier-microsomale antilichamen (LKM-1) antilichamen die hCYP2D6 zijn de kenmerken van AIH-2 7,8. Levering van hCYP2D6 in wildtype FVB of C57BL / 6 muizen was door een Adenovirus construct (Ad-2D6) die een directe levering van de triggering antigeen naar de lever zorgt. Zo, de daaruit voortvloeiende lokale ontsteking zorgt voor een vruchtbaar veld 9 voor de verdere ontwikkeling van auto-immuniteit. A combination van intraveneuze en intraperitoneale injectie van Ad-2D6 is de meest effectieve route naar een duurzame auto-schade aan de lever (hoofdstuk 1) induceren. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over de manier waarop auto-immuun leverziekten wordt geïnduceerd in de CYP2D6 model en hoe de verschillende aspecten van de schade aan de lever kan worden beoordeeld. Eerst worden de serumwaarden van markers waaruit hepatocyte vernietiging, zoals aminotransferasen, evenals de titers van hCYP2D6 antilichamen bepaald door bemonstering bloed retroorbitaly (sectie 2). Tweede wordt de hCYP2D6-specifieke T cel respons gekenmerkt door het verzamelen lymfocyten uit de milt en de lever. Met het oog op pure lever lymfocyten te verkrijgen, worden de levers perfusie door PBS via de poortader (hoofdstuk 3), verteerd in collageen en gezuiverd over een Percoll gradiënt (hoofdstuk 4). De frequentie van hCYP2D6-specifieke T-cellen wordt geanalyseerd door stimulatie met hCYP2D6 peptiden en identificatie van IFNy-producerende cellen door flowcytometrie (deel 5). Third,cellulaire infiltratie en fibrose wordt bepaald door immunohistochemie van de lever secties (sectie 6). Dergelijke analyse regime moet worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen na initiatie van de ziekte om de chronische aard van het model bewijzen. De omvang van de immuunrespons gekenmerkt door de frequentie en activiteit van hCYP2D6-specifieke T en / of B cellen en de mate van de lever schade en fibrose beoordeeld moeten worden voor een volgende evaluatie van mogelijke behandelingen om verhinderen, vertragen of intrekking van de autodestructive proces van de lever.

Infectie van muizen met een adenovirus uiting van de belangrijkste humane autoantigeen cytochroom P450 2D6 (hCYP2D6) erkend door sera van patiënten die lijden aan type 2-auto-immune hepatitis resulteert in een blijvende vorm van auto-immuun-gemedieerde lever ziekte die wordt gekenmerkt door uitgestrekte hepatitis, fibrose en genereren van een CYP2D6 -specifieke immuunrespons.

De CYP2D6 Animal Model: Hoe kan ik auto-immune hepatitis induceren in Muizen

Auto-immuunhepatitis is een zeldzame maar levensbedreigende auto-immuunziekte van de lever met een onbekende etiologie1,2. In het verleden zijn vele pogingen ondernomen om ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is het genereren en verifiëren van een muismodel voor auto-immuunhepatitis, een humane auto-immuunziekte van de lever die wordt gekenmerkt door een chronische ontsteking van de leverinterface, hepatitis, hypergammaglobulinemie en de productie van kenmerkende autoantilichamen. De dieren worden eerst geïnfecteerd met een adenovirusconstruct dat het ziekteverwekkende autoantigeen CYP 2D6 tot expressie brengt om lokale ontsteking in de lever op te wekken. Vervolgens worden leverlymfocyten geïsoleerd via leverperfusie en differentiële dichtheidscentrifugatie. Ten slotte kunnen leverschade en de identificatie van autoantigeenspecifieke T-cellen respectievelijk worden beoordeeld via immunohistochemie en intracellulaire cytokinestaining.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat ons model voor auto-immuunhepatitis wordt gekenmerkt door een chronische ontsteking van de lever en een auto-antigeenspecifieke immuunrespons die vrijwel identiek is aan die waargenomen bij mensen die lijden aan type twee auto-immuunhepatitis. Ons model kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van auto-immuunleverziekten, zoals de vraag hoe de progressieve destructie van de lever wordt aangestuurd bij patiënten met auto-immuunhepatitis. Over het algemeen hebben we bij de methode van vials moeite met de intraveneuze infectie en bloedafname via de ophthalmic venous sinus, evenals de perfusie van de lever, terwijl de porter wearing well oefening vereist.Houd na het verdoven de muis bij de nek vast en trek de losse huid van de kop strak met de duim en middelvinger. Let op hoe het oog in deze positie iets uitpuilt door de tractie van de huid naast het oog. Plaats nu de naald in de mediale canthus op het punt waar een van de oogleden het dichtst bij de neus van het dier samenkomen, en injecteer langzaam 100 microliters van de 80 2D six virusoplossing.Trek vervolgens de naald iets terug en sluit de oogleden. Begin eerst met het vullen van een spuit van 5 mL met koud PBS en bevestig een naald van 27 gauge aan de spuit. Maak na het euthanaseren van de muis een incisie met een schaar op ongeveer 1 cm afstand van de achterpoten van het dier door de huid- en spierlagen; knip aan beide zijden van het dier met de schaar door tot aan het diafragma.Zodra het diafragma is bereikt, trek je de huid naar achteren en knip je het diafragma met een schaar los van de ribben en ontleed je de vena cava. Verplaats op dit punt in de dissectie de maag en darmen naar de zijkant om de vena portae bloot te leggen. Het perfunderen van de lever is het meest complexe deel van de procedure, vooral wanneer de lever chronisch ontstoken of zelfs fibrotisch is. De muis is erg klein, dus is een vaste hand vereist om de vena portae nauwkeurig te puncteren.Bovendien is het belangrijk dat de PBS langzaam wordt toegediend, anders kan het weefsel beschadigd raken. Voer de eerder voorbereide naald in de poortader in en oefen vervolgens voorzichtig druk uit op de zuiger van de spuit om de PBS het bloed langzaam uit de lever te laten spoelen wanneer de perfusie is voltooid. Verwijder de lever door het diafragma met een pincet vast te pakken en de schaar te gebruiken om het diafragma van het lichaam los te snijden.Breng het orgaan tenslotte over naar een Petrischaal en verwijder het diafragma, de galblaas en al het overige weefsel dat nog met de lever is verbonden. Let op dat de lever van het dier met auto-immuunhepatitis fibrotisch is en de individuele lobben zijn gefuseerd. Begin met het vullen van een Petrischaal met 10 milliliters verse PPS en plaats deze op ijs.Breng de geperfuseerde lever over naar de schaal en knip het weefsel met een schaar in kleine stukjes. Giet vervolgens het weefsel en de PBS in een cellzeef van 70 micrometer en druk de leverstukjes met een glazen stamper door de zeef. Giet nu voorzichtig 10 milliliters koud collagenase-buffer over de weefselstukjes en blijf indien nodig de stamper gebruiken.Centrifugeer de cellen 3 minuten bij 30 ×g bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis, waarbij vijf millimeter vloeistof boven het pellet wordt gelaten; centrifugeer bij 650 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder al het supernatant, behalve de laatste drie millimeter.Resuspendeer de pellet in 20 milliliters per call buffer en centrifugeer de cellen vervolgens 20 minuten bij 600 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door tegen de buis te tikken bij het ontstaan van persistente auto-immuunhepatitis na adenovirus 2D6-infectie van wild-type muizen in het CYP 2D6-model. De lever vertoont een duidelijk gewijzigde morfologie, zoals hier in de rechterfiguur te zien is. In het bijzonder zijn de leverlobben gefuseerd, zoals aangegeven door de zwarte pijlpunten, en hyperphagische noduli, aangegeven door zwarte pijlen, zijn verspreid over de gehele lever zichtbaar, waarbij een massieve kapselfibrose waarneembaar is in vergelijking met een controle-infectie.Het adenovirus dat geen menselijk CYP 2D6 tot expressie brengt, heeft geen effect op de levermorfologie, zoals te zien is in de figuur links. Verder zijn uitgebreide en aanhoudende cellulaire infiltraties zichtbaar in de periportale en parenchymale regio's van de levers van muizen die zijn geïnfecteerd met adenovirus 2D6, maar niet in die van muizen die zijn geïnfecteerd met het adenovirus-controlemiddel. Let op de significante infiltraties van mononucleaire cellen die alleen aanwezig zijn in de met adenovirus 2D6 geïnfecteerde muizen, zoals aangegeven door de enkele zwarte pijlen hier.De drievoudige pijlen geven grotere cellulaire infiltraties aan in het leverparenchym die naburige portale tracten overbruggen. In deze figuur is te zien hoe fibrose zich voornamelijk ontwikkelt in de subcapsulaire regio, waarbij enkele collageenbundels in het parenchym uitsteken. Let op de meerdere lagen van collageenafzetting onder het leverkapsel, zoals aangegeven door de drievoudige zwarte pijlen, met enkele bundels die in het parenchym uitsteken, zoals aangegeven door de enkele pijlen, evenals de aanwezigheid van grote clusters infiltrerende cellen, zoals aangegeven door de zwarte pijlpuntjes.Een derde kenmerk van persistente auto-immuunhepatitis bij muizen geïnfecteerd met adenovirus 2D6 is de predominante generatie van lever-homing humane CYP 2D6-specifieke CD4- en CD8-Tcellen, zoals te zien is in deze representatieve dot plots van intracellulaire cytokinestaining; overnacht stimulatie van leverlymfocyten met het immunodominante CD4- of CD8-humane CYP 2D6-peptide wekt respectievelijk CD4-positieve of CD8-positieve Tcel-specifieke interferon gamma-expressie op. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een optimale perfusie van de lever een kritische stap is om contaminatie van de leverlymfocyten door mononucleaire cellen uit perifeer bloed te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de isolatie van primaire hepatische steroïdcellen, worden uitgevoerd om de activatiestatus en het migratiepotentieel van Tcellen na hun ontwikkeling te bestuderen.Dit diermodel moet de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van auto-immuunleverziekten om belangrijke factoren te onderzoeken die de chronische ontsteking van de lever aansturen, en om mogelijke behandelingen voor patiënten te evalueren.

the-cyp2d6-animal-model-how-to-induce-autoimmune-hepatitis-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video laat zien hoe u auto-immune hypophysitis induceren in SJL muizen en hoe u de ernst ervan te beoordelen door de histopathologie.

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Hier beschrijven we een gemeenschappelijke methode om chronische lever schade in muizen door het eten van een dieet van choline-deficiënte en ethionine-aangevuld (CDE). We tonen gezondheidsmonitoring, lever perfusie, isolatie en behoud. Een tijdsverloop van zes weken kan informeren over de lever schade, pathohistology, fibrose, inflammatoire, en lever progenitor cel reacties.

De lymfkliertest Choline-deficiënte, Ethionine-aangevuld (COB) dieet Model van chronische lever schade

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een menselijke lever chimeer muismodel van familiale hypercholesterolemie met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten. Dit is een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën voor hypercholesterolemie.

Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een klinisch relevant muriene model van leverkanker die de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) recapituleren.

Een oncogene hepatocyte-geïnduceerde Orthotopic muis model van hepatocellulaire kanker ontstaan in de setting van leverontsteking en fibrose

Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.

Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.

Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel

Verschillende soorten diermodellen van Hashimoto's thyroiditis zijn vastgesteld, net als spontane auto-immune thyroiditis bij de NOD-muis. H-2h4-muizen zijn een eenvoudig en betrouwbaar model voor HT-inductie. Dit artikel beschrijft deze aanpak en evalueert het pathologische proces voor een beter begrip van het SAT-muizenmodel.

Generatie van een muis Spontane auto-immuun thyroiditis model

Leer hoe je een muismodel voor auto-immuun hepatitis ontwikkelt met adenovirus-expressie van CYP2D6. Deze methode bootst chronische leverontsteking na en helpt onderzoekers bij het bestuderen van ziekteprocessen.

De CYP2D6 Animal Model: Hoe kan ik auto-immune hepatitis induceren in Muizen

Meer video's verkennen