Name: Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer een robuuste methode voor virusassemblage in vivo en in vitro met behulp van Agrobacterium-geïnfiltreerde plantencellen. Deze aanpak maakt de productie van optische virale ghosts mogelijk voor biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag een aantal leden van het lab bedanken voor hun waardevolle suggesties in de ontwikkeling van agroinfiltration en in vitro assemblage assays. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Universiteit van Californië. Deze studie werd ondersteund in delen door een subsidie ​​van de National Science Foundation (cbet-1144237).

1. Plantaardig materiaal <ol><li> Nicotiana benthamiana planten worden in de encapsideringssequenties test moet bij 4 bladeren fase (ongeveer 3-4 weken oude planten). </li></ol> 2. Levering en expressie van functionele virale genoom componenten naar de cellen te planten door agroinfiltration <ol><li> Dag 1: Agrobacterium-stam (bijv. EH 105 of GV 3101) herbergen de pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 en BMV RNA 3 1,2 gekweekt op LB-agarplaten aangevuld met 50 mg / ml kanamycine (selecteert voor de pCASS vector) en 100mg/ml van rifampicine (kiest voor de Agrobacterium). De incubatie wordt uitgevoerd bij 28 ° C voor twee dagen. </li><li> Dag 3: Inoculatie enkele kolonie van de LB-agar plaat in 2 ml LB-bouillon met daarin 50 mg / ml kanamycine en 100 mg / ml rifampicine voor 1 dag bij 28 ° C in rondschudapparaat bij 250 RPM. </li><li> Dag 4: Inoculeer 50 ml van de LB-bouillon supplemented met 50 mg / ml kanamycine en 100 mg / ml rifampicine, 10 mM MES pH 5,6 en 100 mM acetosyringoon met een ml van de cultuur in een 250 ml Erlenmeyer gedurende 16 uur bij 28 ° C orbitale schudder bij 250 RPM . </li><li> Dag 5: Breng de cultuur (bij OD 600 1,0 bereikt) om een Oak Ridge buis of steriele Falcon buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5000 rpm bij 4 ° C. </li><li> Los de pellet in 10 ml 10 mM MgCl2 en centrifugeer 10 minuten bij 5000 rpm bij 4 ° C, Herhaal stap een keer een volledige verwijdering van het antibioticum waarborgen. </li><li> Suspendeer de pellet in 10 ml buffer die 10 mM MgCl2 en 10 mM MES (pH 5.6). </li><li> Meet de OD 600 voor elke kweek van BMV RNA 1, RNA 2 en RNA 3 en tot aan 0,1 OD 600 met 10 mM MgCl2 en 10 mM MES (pH 5.6). </li><li> Meng 1 ml elk alle drie 0,1 OD 600 cultuur suspensies. </li><li> Voeg 100 mM acetosyringoon, mix gently en dit mengsel ongestoord bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Teken de cultuur schorsing in 1 ml. injectiespuit zonder naald. </li><li> Infiltreren bovengenoemde cultuur suspensie in abaxiale zijde van 2-3 goed geëxpandeerde bladeren N. benthamiana (5 bladeren fase van 3-4 weken oude planten) zachtjes op de spuit de helft van de abaxiale oppervlak van het blad. </li><li> Herhaal infiltratie procedure andere bladeren. </li><li> Houd geïnfiltreerde planten in de kas met 24 ° C. </li><li> Oogst de bladeren 3 geïnfiltreerd tot 4 dagen na infiltratie (dpi). </li></ol> 3. Zuivering van BMV virionen <ol><li> Verzamel N. benthamiana laat agroinfiltrated met een mengsel dat alle drie de wild-type BMV agrotransformants. </li><li> Malen bladeren in een steriele vijzel met een gelijk volume (w / v) BMV extractiebuffer (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 en 1/100 volume van β-mercapto-ethanol die wordt toegevoegd onmiddellijk voor gebruik) 3. Om virus opbrengst te maximaliseren, is het raadzaam om zuur gewassen zand (~ 0,5-1 g) die gemakkelijk slijpen en efficiënte cel verstoring vergemakkelijkt toe te voegen. </li><li> Filtreer het extract door middel van 2-3 lagen van mousseline doek en het verzamelen van de vlaag. </li><li> Opnieuw malen de ingehouden gedeelte op mousseline doek met gelijk volume van BMV extractiebuffer van het gewicht van bladmateriaal. </li><li> Herhaal de procedure met behulp van filtratie mousseline doek. Deze stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C. </li><li> Breng het filtraat oplossing een centrifugebuis en voeg gelijk volume van pre-gekoelde chloroform en vortex (of schud) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur tot de kleur van de suspensie wordt lichtgroen. </li><li> Centrifugeer de geëmulgeerde oplossing gedurende 15 minuten bij 12.000 rpm bij 4 ° C. </li><li> Verzamelen van de waterfase en roer 30 minuten magneetroerder om eventuele chloroform verwijderen. </li><li> Doe de suspensie in een steriele ultracentrifuge buis. </li><li&gt; Underlay 1 ml. 10% sucrose (bereid virus extractiebuffer) als buffer 3. </li><li> Centrifugeer bij 30.000 tpm gedurende 3 uur in een Beekman ultracentrifuge bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en schorten pellet in gewenste volume van de BMV suspensie buffer (tot opschorting buffer verdunde BMV extractiebuffer voor te bereiden tot 1/10 met steriel gedestilleerd water). </li><li> De gedeeltelijk gezuiverd virion bereiding van bovenaf wordt onderworpen aan 10-40% sucrose gradiënt centrifugatie dichtheid van 150 min bij 28.000 rpm bij 4 ° C. </li><li> Verzamel het virus band met de hand of door een fractioneerinrichting. Het virus band zal verschijnen blauw onder wit licht verlichting. </li><li> Verdun de sucrose-oplossing met virus monster ten minste 50% met virussuspensie buffer. </li><li> Centrifugeer verdunde virus sucrose-oplossing gedurende 3 uur bij 30.000 rpm in een Beekman ultracentrifuge bij 4 ° C. </li><li> Tot slot schort de sterk gezuiverde virus pellet in een gewenste volume van virons schorsing buffer. </li><li> Concentratie van de virion (mg / ml) met spectrofotometer bij OD 260. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> Opmerking: Op basis van RNA-inhoud, de extinctiecoëfficiënt voor BMV is 5 4. <ol start="19"><li> Controleer of de zuiverheid van virionen door het bekijken van onder TEM (afb. A) </li></ol> 4. Bereiding van capside-eiwit subeenheden in vitro assemblage <ol><li> Bereid 1 Liter van 1x virus dissociatie buffer (0,5 M CaCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT en 0,5 mM PMSF) 5. </li><li> Bereid dialysemembraan volgens Sambrook et al. 6. </li><li> Breng benodigde concentratie van gezuiverd virus in een dialysezak. </li><li> Plaats het virus met dialyse tas in een bekerglas met 1x virus dissociatie buffer. </li><li> Dialyze 24 uur bij 4 ° C while roeren. </li><li> Verzamelen oplossing uit de dialysezak na 24 uur en centrifugeer bij 12.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Dit zal scheiden van de BMV RNA uit de gedissocieerde virions. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof en centrifugeer bij 35.000 toeren per minuut in Beckman centrifuge gedurende 3 uur bij 4 ° C tot pellet alle VN-gesplitste virusdeeltje. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof. </li><li> In dit stadium is het noodzakelijk om eventuele besmetting van virion RNA te verwijderen van los capside-eiwit subeenheden. Hiertoe dient het supernatans van stap 8 worden onderworpen aan een ronde overnacht montage van capside-eiwit subeenheden zonder toevoeging RNA (RNA in 1x montage buffer, zie hieronder) gevolgd door een snelle centrifugatie (30.000 rpm gedurende 3 uur bij 4 ° C) tot pellet een samengesteld virions. Na deze montage stap zou de supernatant bevattende manteleiwit subeenheden vrij zijn van contaminerende resterende RNA. Echter, dit te waarborgen is het raadzaam om een ​​extra voeren in vitro montage slechts manteleiwit subeenheden met RNA 1x montage buffer. Na meer dan &#39;s nachts opnieuw monteren, moet de voorbereiding vrij van geassembleerde virionen (te controleren met behulp van TEM). </li><li> Het gehalte aan capside-eiwit subeenheden door meting bij OD 254 en 280 nm of door andere methoden zoals Bradford-test. </li><li> Voer 12-15% SDS-PAGE, gevolgd door western blot om de integriteit van het gedissocieerde capside eiwitsubeenheden bepalen. </li></ol> 5. In vitro samenstel van RNA die virionen <ol><li> Bereid RNA-transcripten opnieuw worden geassembleerd in virions en bereken de concentratie 7. </li><li> Meng capside-eiwit subeenheden en RNA transcript in een verhouding van 1:5 (gew / gew) 5. </li><li> Breng het bovengenoemde mengsel een dialysezak en goed vast te zetten lekkage te voorkomen. </li><li> Bereid 1000 ml. RNA 1x samenstel buffer (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,0 mM DTT) 5. </li><li> Plaats de dialyse zak met het reactiemengsel tegen 1x montage buffer in de beker en roer. </li><li> Dialyze de hermontage reactie bij 4 ° C gedurende 24 uur zacht roeren. </li><li> Verzamelen het mengsel uit de dialysezak na 24 uur en voeg 1,5 ml RNA samenstel buffer. </li><li> Stuur dit mengsel door een Centricon-100 kolom door centrifugeren op lage snelheid (2000 xg) gedurende 30 minuten. </li><li> Ze wast de kolom met 1,5 ml buffer samenstel bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Twee keer Herhaal bovenstaande wasstap. </li><li> Tenslotte elueren het opnieuw geassembleerde virions door centrifugatie bij 10000 g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Schat de virion concentratie bij OD 260 nm. </li></ol> 6. Fabricage van optische Viral Ghosts (OVGs) <ol><li> Voeg indocyaninegroen (ICG) 8 van het gezuiverde capside-eiwit in de gewenste concentratie ratio (de gewichtsverhouding van indocyaninegroen en capside-eiwit in dit rapport 01:10) een<html> d meng goed door pipetteren. </li><li> Dialyze de capside eiwitten en ICG oplossing tegen de OVG samenstel buffer (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA en 1 mM DTT, pH4.8) bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur verzameld oplossing uit de dialysezak (12 kDa poriegrootte) en gecentrifugeerd bij 90.000 rpm gedurende 1 uur bij 4 ° C (Fig. B) </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en hang de pellet in BMV suspensie buffer en door vortexen of deze op door zelf te schorten BMV suspensie buffer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Controleer of de morfologie van OVGs door TEM (afb. C). </li><li> Meet de absorptie van 240 nm tot 950 nm met behulp van spectrofotometer (Cary 50, Varian Inc), de aanwezigheid van ICG wordt bevestigd door ondertekening absorptie pieken rond de 700 nm en 790 nm 8. (Afb. D) </li><li> De typische ICG fluorescentie pieken op ~ 700 nm en ~ 800 nm te zien is bij de 620 nm excitatie van OVG-oplossing (afb. D) met behulp van spectrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon). </li></ol>_title &quot;&gt; 7. representatieve resultaten <img alt="Figuur A" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> Figuur A. TEM beeld van negatief gekleurde BMV virionen gezuiverd van N. benthamiana planten agroinfiltrated met een mengsel van alle drie de wild-type BMV agroconstructs (schaal bar = 100 nm). <img alt="Figuur B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> Figuur B. Pellet van in vitro-geassembleerde ICG bevattende OVGs na hoge snelheid centrifugeren. <img alt="Figuur C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> Figuur C. TEM beeld van negatief gekleurde ICG met OVGs (schaal bar = 100 nm). <img alt="Figuur D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> Figuur D. Absorptie (Top) en fluorescentie (onder) spectra van OVGs. De golflengte voor OVG emissie wals 620 nm.

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Agroinfiltration hier gepresenteerde benadering op grote schaal kunnen worden toegepast op een breed scala van plantenvirussen. Een kenmerk kenmerk van deze benadering is gesynchroniseerd levering van meerdere agroconstruct naar dezelfde cel-een groot nadeel vaak geassocieerd met routinematig mechanische inoculatie van plantenvirussen. In vivo en in vitro studies montage met broom mosaic virus als model kan doelmatig worden uitgevoerd door volgen enkele tips. (i) Voor een succesvolle infiltratie van <e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MES Natriumzouten </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyaninegroen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beekman ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 kolom </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spectrofotometer </td><td> Cary 50 Varian Inc </td><td> Onderdeelnummer 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Onderdeelnummer FL3-21 </td></tr></tbody></table>

eenvoudige en robuuste in vivo en in vitro aanpak voor het bestuderen van virus vergadering

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In virussen met een positieve-sense RNA genoom pathogeen zijn voor mens, dier en plant, nageslacht ingepakt in volwassen en stabiel virionen is een kardinale fase tijdens de oprichting van de infectie in een bepaalde host. Bijgevolg, studie van inkapseling ontcijfert de informatie met betrekking tot de know-how van het mechanisme reguleren virus assemblage van infectueuze virionen te vormen. Dergelijke informatie is van vitaal belang bij het formuleren van nieuwe methoden voor het terugdringen van het virus verspreiding van ziekten en plagen. Virus inkapseling kan worden bestudeerd in vivo en in vitro. Genoom inkapseling in vivo is een sterk gereguleerde selectief proces, waarbij macromoleculaire interacties en subcellulaire verkokering. Daarom studie die leidt tot ontleden gebeurtenissen omvat virus inkapseling in vivo zou basiskennis te bieden om te begrijpen hoe virussen zich vermenigvuldigen en te monteren. Onlangs in vitro inkapseling is benut voor het onderzoek op het gebied van biomedische imaGing en therapeutische toepassingen. Niet-omhulde plantenvirussen staan ​​ver vooruit in de onderneming van in vitro inkapseling van de negatief geladen vreemd materiaal. Brome mosaic virus (BMV), een niet-omhulde multicomponent RNA virus pathogeen planten werd gebruikt als modelsysteem voor het bestuderen genoom verpakking in vivo en in vitro. Voor encapsidering assays in Nicotiana benthamiana planten Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie, noemen agroinfiltration, is een efficiënte en robuuste techniek voor de gesynchroniseerde leveren en expressie van meerdere componenten dezelfde cel. In deze benadering wordt een schorsing van Agrobacterium tumefaciens cellen die binair plasmide vectoren die cDNA&#39;s van desiredviral mRNA&#39;s geïnfiltreerd in de intercellulaire ruimte withina blad met niets meer verfijnd dan een 1 ml wegwerpspuit (zonder naald). Dit leidt tot de overdracht van DNA insert in plantencellen, de T-DNAinsert blijft tijdelijk in de kern en wordt getranscribeerd door de gastheer polymerase II, leiden tot de transiënte expressie. De resulterende mRNA transcript (capped en gepolyadenyleerde) wordt vervolgens geëxporteerd naar het cytoplasma voor de vertaling. Na ongeveer 24 tot 48 uur incubatie, kunnen delen van geïnfiltreerde bladeren worden bemonsterd voor microscopyor biochemische analyses. Agroinfiltration maakt grote aantallen (honderden tot duizenden) cellen gelijktijdig getransfecteerd. Voor in vitro encapsideringssignaal gezuiverd virions van BMV worden gescheiden in capside-eiwit door dialyseren tegen dissociatie buffer met calciumchloride gevolgd door verwijdering van RNA en niet-gedissocieerd virions door centrifugeren. Genoom verarmd capside-eiwit subeenheden vervolgens weer met de gewenste virale genoom onderdelen of niet-virale componenten zoals indocyanine kleurstof.

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen via<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde transiënte expressie beschreven. Deze aanpak is vatbaar voor het bestuderen van replicatie, inkapseling gevolgd door<em&gt; In vitro</em&gt; Montage van niet-virale componenten in het genoom van uitgeput optische virale geesten die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Bij virussen met positieve-sense RNA-genomen die pathogeen zijn voor mensen, dieren en planten, is de encapsidatie van nakomelingen tot rijpe en stabiele virionen een cruciaal...

Het algemene doel van deze procedure is om de assemblage van virussen in vivo en in vitro te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst bromeekmozaïïkus-RNA's in bacteriën tot expressie te brengen en deze vervolgens aan plantencellen bloot te stellen via agro-infiltratie. Vervolgens worden de BMV-virionen gezuiverd uit de geïnfiltreerde bladeren.Vervolgens worden de subunits van het capsid-eiwit voor in vitro assemblage voorbereid. Ten slotte worden BMV Varians in vitro geassembleerd met behulp van het capsid-eiwit en indocyaninegroen kleurstof. Uiteindelijk tonen de resultaten in vitro geassembleerde bro mosaic varians door de vorming van optische ghosts, wat kan worden bepaald via absorptie en fluorescentie-emissie.Vandaag gaan we een techniek laten zien die filtratie wordt genoemd; deze techniek is nuttig voor het afleveren van virale componenten in planten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het maken van in vitro transcripten overbodig wordt, terwijl er tegelijkertijd meerdere componenten naar dezelfde cel worden afgeleverd, wat een gesynchroniseerde infectie mogelijk maakt. Het werk waar wij ons momenteel op richten, is het gebruik van het brommozaïekvirus in combinatie met een door de FDA goedgekeurd chromofoor, cyanine green, om een nieuw type nanodeeltje te vervaardigen voor biomedische toepassingen.Onze specifieke bedoeling is om deze constructen, waarnaar we verwijzen als optical wire ghosts of OWG's, te gebruiken voor optische beeldvormingsmodaliteiten, waaronder fluorescentiebeeldvorming en foto-akoestische beeldvorming, en daarnaast als middel voor lasertherapie. Een specifieke klinische toepassing die we momenteel nastreven, is het gebruik van deze constructen voor de beeldvorming van eierstokkanker in combinatie met intraoperatieve procedures. Het idee is dat we deze constructen kunnen functionaliseren.De OBG met het specifieke targetmotief dat residuele tumorcellen kan herkennen, die in het geval van eierstokkanker zich met name in de peritoneale holte kunnen bevinden. Kies uit een plaat met eerder bereide agrobacterium die het RNA één, twee of drie van het brown mosaic virus bevat, een enkele kolonie om twee milliliter LB te inoculeren, bestaande uit 50 µg/mL kanamycin en 100 µg/mL rifampicine. Incubeer de cultuur gedurende één dag bij 28 °C in een orbitale schudder bij 250 RPM. Inoculeer de volgende dag 50 milliliter LB in een erlenmeyer van 500 milliliter met één milliliter cultuur en incubeer dit gedurende 16 uur bij 28 °C in een orbitale schudder bij 250 RPM. Wanneer de culturen een OD 600 van 1,0 hebben bereikt, brengt u deze over in steriele buisjes van 30 milliliter en centrifugeer ze gedurende 10 minuten.Los de pellets op in 10 milliliters van 10 millimolar magnesiumchloride bij 5, 000 RPM en vier graden Celsius en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5, 000 RPM en vier graden Celsius. Herhaal deze stap nogmaals om volledige verwijdering van het antibioticum te waarborgen. Suspendeer de pellets vervolgens in 10 milliliters buffer die 10 millimolar MES en 10 millimolar magnesiumchloride bevat.Meet de OD 600 voor elke cultuur en stel deze bij naar een OD 600 van 0,1 met behulp van 10 millimol magnesiumchloride en 10 millimol MES. Combineer vervolgens 10 milliliters van elk van de drie cultuursuspensies met een OD 600 van 0,1. Voeg acetofenon toe tot een eindconcentratie van 100 millimol.Meng voorzichtig en laat het mengsel drie uur ongestoord op kamertemperatuur staan. Trek na de incubatie de cultuur op in een spuit van één milliliter zonder naald. Infiltreer de cultuursuspensie in de abaxiale zijde van twee tot drie goed uitgevouwen bladeren van N hamana door de spuit voorzichtig tegen de helft van het abaxiale oppervlak van elk blad te drukken.Houd de geïnfiltreerde planten in de kas bij 24 °C gedurende drie tot vier dagen voordat de bladeren worden geoogst. Bereid na het zuiveren van de BMV-virionen één liter van één x virus-dissociatiebuffer voor. Bereid vervolgens het dialysemembraan voor.Volgens de methode van Sambrook et al. wordt vijf tot 10 mg/mL gezuiverd virus in een dialysezak gedaan en wordt de zak geplaatst in een kolf met 1x virus-dissociatiebuffer. Dialyseer het virus gedurende 24 uur bij 4 °C onder constant roeren.Verzamel de oplossing uit de dialysezak en centrifugeer deze 30 minuten lang bij 30.000 RPM bij vier graden Celsius om eventuele niet-geassocieerde viruspartikels te pelletteren. Centrifugeer het supernatant drie uur lang bij 30.000 RPM bij vier graden Celsius. Nadat de RNA-transcripten die tot virionen moeten worden geassembleerd zijn voorbereid, worden de capsidendoteïne-subunits en RNA-transcripten in een verhouding van één op vijf gemengd.Breng het mengsel over in een dialysiszak en sluit deze goed af om lekkages te voorkomen. Bereid één liter 1X RNA-assemblagebuffer en dialyseer het reassemblatiemengsel in deze buffer bij 4 °C gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag het mengsel uit de dialysiszak en voeg 1,5 ml RNA-assemblagebuffer toe; centrifugeer vervolgens opnieuw bij 30.000 RPM gedurende drie uur bij 4 °C. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer het pellet.Schat vervolgens de virionconcentratie bij OD 260 nanometer. Bepaal daarna de concentratie van de capsidPROTEïne-subeenheden bij OD 280 nanometer of met andere methoden, zoals de Bradford-assay, om de integriteit van de gedissocieerde capsidPROTEïne-subeenheden te bepalen. Voer een 12 tot 15% SDS-PAGE uit, gevolgd door western blotting. Volg tenslotte de procedure zoals beschreven in het geschreven protocol om optische virale ghosts of ov-cheese te genereren.Hier wordt een transmissie-elektronenmicroscopische afbeelding getoond van negatief gekleurde BMV-varionen, gezuiverd uit end hamana-planten die agro-geïnfiltreerd zijn met een mengsel van alle drie de wild-type BMV-agri-constructen. Deze TEM-afbeelding toont negatief gekleurde optische virale ghosts met indocyaninegroen. Hier worden de absorptie- en fluorescentiespectra voor optische virale ghosts getoond zodra deze zijn beheerst.Deze techniek kan in vijf minuten per monster worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale of niet-virale componenten kunnen worden ingekapseld in capside-proteensubunits.

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Hier beschrijven we een procedure om virale complexen in vloeistof met nanometerresolutie in beeld te brengen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Leer een robuuste methode voor virusassemblage in vivo en in vitro met behulp van Agrobacterium-geïnfiltreerde plantencellen. Deze aanpak maakt de productie van optische virale ghosts mogelijk voor biomedische toepassingen.

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Meer video's verkennen