Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Het algemene doel van deze procedure is om de assemblage van virussen in vivo en in vitro te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst bromeekmozaïïkus-RNA's in bacteriën tot expressie te brengen en deze vervolgens aan plantencellen bloot te stellen via agro-infiltratie. Vervolgens worden de BMV-virionen gezuiverd uit de geïnfiltreerde bladeren.

Vervolgens worden de subunits van het capsid-eiwit voor in vitro assemblage voorbereid. Ten slotte worden BMV Varians in vitro geassembleerd met behulp van het capsid-eiwit en indocyaninegroen kleurstof. Uiteindelijk tonen de resultaten in vitro geassembleerde bro mosaic varians door de vorming van optische ghosts, wat kan worden bepaald via absorptie en fluorescentie-emissie.

Vandaag gaan we een techniek laten zien die filtratie wordt genoemd; deze techniek is nuttig voor het afleveren van virale componenten in planten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het maken van in vitro transcripten overbodig wordt, terwijl er tegelijkertijd meerdere componenten naar dezelfde cel worden afgeleverd, wat een gesynchroniseerde infectie mogelijk maakt. Het werk waar wij ons momenteel op richten, is het gebruik van het brommozaïekvirus in combinatie met een door de FDA goedgekeurd chromofoor, cyanine green, om een nieuw type nanodeeltje te vervaardigen voor biomedische toepassingen.

Onze specifieke bedoeling is om deze constructen, waarnaar we verwijzen als optical wire ghosts of OWG's, te gebruiken voor optische beeldvormingsmodaliteiten, waaronder fluorescentiebeeldvorming en foto-akoestische beeldvorming, en daarnaast als middel voor lasertherapie. Een specifieke klinische toepassing die we momenteel nastreven, is het gebruik van deze constructen voor de beeldvorming van eierstokkanker in combinatie met intraoperatieve procedures. Het idee is dat we deze constructen kunnen functionaliseren.

De OBG met het specifieke targetmotief dat residuele tumorcellen kan herkennen, die in het geval van eierstokkanker zich met name in de peritoneale holte kunnen bevinden. Kies uit een plaat met eerder bereide agrobacterium die het RNA één, twee of drie van het brown mosaic virus bevat, een enkele kolonie om twee milliliter LB te inoculeren, bestaande uit 50 µg/mL kanamycin en 100 µg/mL rifampicine. Incubeer de cultuur gedurende één dag bij 28 °C in een orbitale schudder bij 250 RPM. Inoculeer de volgende dag 50 milliliter LB in een erlenmeyer van 500 milliliter met één milliliter cultuur en incubeer dit gedurende 16 uur bij 28 °C in een orbitale schudder bij 250 RPM. Wanneer de culturen een OD 600 van 1,0 hebben bereikt, brengt u deze over in steriele buisjes van 30 milliliter en centrifugeer ze gedurende 10 minuten.

Los de pellets op in 10 milliliters van 10 millimolar magnesiumchloride bij 5, 000 RPM en vier graden Celsius en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5, 000 RPM en vier graden Celsius. Herhaal deze stap nogmaals om volledige verwijdering van het antibioticum te waarborgen. Suspendeer de pellets vervolgens in 10 milliliters buffer die 10 millimolar MES en 10 millimolar magnesiumchloride bevat.

Meet de OD 600 voor elke cultuur en stel deze bij naar een OD 600 van 0,1 met behulp van 10 millimol magnesiumchloride en 10 millimol MES. Combineer vervolgens 10 milliliters van elk van de drie cultuursuspensies met een OD 600 van 0,1. Voeg acetofenon toe tot een eindconcentratie van 100 millimol.

Meng voorzichtig en laat het mengsel drie uur ongestoord op kamertemperatuur staan. Trek na de incubatie de cultuur op in een spuit van één milliliter zonder naald. Infiltreer de cultuursuspensie in de abaxiale zijde van twee tot drie goed uitgevouwen bladeren van N hamana door de spuit voorzichtig tegen de helft van het abaxiale oppervlak van elk blad te drukken.

Houd de geïnfiltreerde planten in de kas bij 24 °C gedurende drie tot vier dagen voordat de bladeren worden geoogst. Bereid na het zuiveren van de BMV-virionen één liter van één x virus-dissociatiebuffer voor. Bereid vervolgens het dialysemembraan voor.

Volgens de methode van Sambrook et al. wordt vijf tot 10 mg/mL gezuiverd virus in een dialysezak gedaan en wordt de zak geplaatst in een kolf met 1x virus-dissociatiebuffer. Dialyseer het virus gedurende 24 uur bij 4 °C onder constant roeren.

Verzamel de oplossing uit de dialysezak en centrifugeer deze 30 minuten lang bij 30.000 RPM bij vier graden Celsius om eventuele niet-geassocieerde viruspartikels te pelletteren. Centrifugeer het supernatant drie uur lang bij 30.000 RPM bij vier graden Celsius. Nadat de RNA-transcripten die tot virionen moeten worden geassembleerd zijn voorbereid, worden de capsidendoteïne-subunits en RNA-transcripten in een verhouding van één op vijf gemengd.

Breng het mengsel over in een dialysiszak en sluit deze goed af om lekkages te voorkomen. Bereid één liter 1X RNA-assemblagebuffer en dialyseer het reassemblatiemengsel in deze buffer bij 4 °C gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag het mengsel uit de dialysiszak en voeg 1,5 ml RNA-assemblagebuffer toe; centrifugeer vervolgens opnieuw bij 30.000 RPM gedurende drie uur bij 4 °C. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer het pellet.

Schat vervolgens de virionconcentratie bij OD 260 nanometer. Bepaal daarna de concentratie van de capsidPROTEïne-subeenheden bij OD 280 nanometer of met andere methoden, zoals de Bradford-assay, om de integriteit van de gedissocieerde capsidPROTEïne-subeenheden te bepalen. Voer een 12 tot 15% SDS-PAGE uit, gevolgd door western blotting. Volg tenslotte de procedure zoals beschreven in het geschreven protocol om optische virale ghosts of ov-cheese te genereren.

Hier wordt een transmissie-elektronenmicroscopische afbeelding getoond van negatief gekleurde BMV-varionen, gezuiverd uit end hamana-planten die agro-geïnfiltreerd zijn met een mengsel van alle drie de wild-type BMV-agri-constructen. Deze TEM-afbeelding toont negatief gekleurde optische virale ghosts met indocyaninegroen. Hier worden de absorptie- en fluorescentiespectra voor optische virale ghosts getoond zodra deze zijn beheerst.

Deze techniek kan in vijf minuten per monster worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale of niet-virale componenten kunnen worden ingekapseld in capside-proteensubunits.